超聲輔助響應面法優(yōu)化種植佛手中橙皮苷和柚皮苷提取工藝的研究

王向平，張建海，馮彬彬

（1重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W校，重慶 404120；2河南省洛陽市洛龍區(qū)農(nóng)林技術推廣站，河南 洛陽 471023）

0 引言

佛手為蕓香科植物佛手（Citri medica var.sarcodactylis）的干燥果實[1-2]，為中國傳統(tǒng)的藥食兩用藥材，具有疏肝理氣、和胃止痛、燥濕化痰的作用，一般用于治療肝胃氣滯、胸脅脹痛、胃脘痞滿、食少嘔吐、咳嗽痰多等疾病。佛手中主要的化學成分為多糖類、黃酮類、揮發(fā)油、香豆素、無機元素、氨基酸及維生素等[3-5]，其中藥效成分多為黃酮類。佛手總黃酮的提取研究涉及廣東、廣西的廣佛手、浙江的金佛手以及四川的川佛手較多。鄧祥等[6-7]研究了川佛手中黃酮類物質(zhì)的微波和超聲波聯(lián)合提取工藝及超臨界CO2流體萃取技術，在最佳提取工藝條件下，川佛手總黃酮的提取量和提取率分別約為44.05 mg/g和3.79%。章斌等[8-9]研究了復合酶法和超聲提取廣佛手總黃酮的工藝，佛手總黃酮得率分別為4.093%和3.22%。王晉、李宇浩等[10-11]進行了廣佛手中黃酮提取工藝的優(yōu)化。已有研究發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地、不同的提取方法對佛手黃酮提取影響較大[12-14]。超聲波輔助提取法是利用超聲波產(chǎn)生的強烈振動、高加速度、強烈的空化效應、攪拌作用等[15-16]，加速有效成分進入溶劑，從而提高浸出率，縮短提取時間。它可降低處理溫度，提高果膠提取率，具有操作方便、品質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點[17-18]。響應面分析法作為一種有效的試驗設計方法，可進行多因素多水平研究，并可研究因素間的交互作用，根據(jù)綜合指標得到最優(yōu)化的工藝結果[19-21]。為了提高佛手中橙皮苷和柚皮苷提取率，本研究根據(jù)有關資料和預試驗的結果，對萬州種植佛手藥材的提取工藝進行了改良，主要利用超聲波輔助提取萬州種植佛手中橙皮苷和柚皮苷，并通過Box-Behnken試驗和響應面分析法優(yōu)選提取工藝，為萬州種植佛手進一步開發(fā)利用提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

HH.SYZ1-NI型電熱恒溫水浴鍋（北京市長風儀器儀表公司），DGX-9143B-1型數(shù)顯鼓風干燥箱（上海?，攲嶒炘O備有限公司），SHB-IV雙A循環(huán)式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司），KQ5200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），液相色譜儀（美國Agilent1260），BSA224S電子天平（賽多利斯科學儀器（北京）有限公司），Millipore純水系統(tǒng)。

1.2 試劑和藥品

橙皮苷、柚皮苷對照品購自中國食品藥品檢定研究院，批號分別是110721-201818、110722-201815。乙腈、甲醇為色譜純，試驗用水為去離子水，其他試劑均為分析純。

萬州種植佛手，經(jīng)重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W校張建海教授鑒定為蕓香科植物佛手Citri medica var.sarcodactylis的干燥果實。

1.3 試驗設計

1.3.1 提取工藝單因素試驗 以橙皮苷、柚皮苷提取率為指標，選取超聲提取時間（10、15、20、25、30、35、40 min）、佛手與乙醇的質(zhì)量比（1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40）、乙醇體積分數(shù)為（30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%）、超聲提取溫度（40、45、50、55、60、65、70℃）進行單因素試驗，研究各因素對橙皮苷、柚皮苷提取率的影響并確定最佳提取工藝參數(shù)。

1.3.2 提取工藝響應面試驗 在單因素試驗所得數(shù)據(jù)基礎上，根據(jù)Box-Behnken組合試驗的設計理論，選取超聲提取時間（A）、乙醇體積分數(shù)（B）、超聲提取溫度（C）、佛手與乙醇的質(zhì)量比（D）對橙皮苷、柚皮苷提取率影響顯著的4個因素進行響應面試驗方案設計。

1.4 標準曲線的建立及樣品測定

1.4.1 色譜條件和系統(tǒng)適應性試驗 色譜柱Agilent-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-水-冰醋酸（33:63:2）為流動相；流速1.0 mL/min，溫度25℃，檢測波長284 nm，進樣量20 μL。理論板數(shù)按橙皮苷和柚皮苷峰計算應不低于5000。

1.4.2 對照品溶液的制備 分別取橙皮苷對照品和柚皮苷對照品各5.5 g，精密稱定，加甲醇制成分別含216.67 μg/mL橙皮苷和柚皮苷的溶液。

1.4.3 供試品溶液的制備 取本品粉末（過五號篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.4.4 標準曲線的建立 分別取1.4.2項下橙皮苷和柚皮苷對照溶液1.5、3、6、12、24、48、96 μL，將橙皮苷和柚皮苷儲備液配制成質(zhì)量濃度均為3.25、6.50、13.00、26.00、52.00、104.00、208.00 μg/mL的系列標準溶液，按1.4.1項下中的色譜條件進行HPLC分析。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel和Design-Expert.8.0.6等試驗軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結果與分析

2.1 萬州種植佛手單因素試驗考察

2.1.1 超聲波提取時間單因素考察 取萬州種植佛手粉末1.0 g，精密稱定，固定乙醇體積分數(shù)75%，超聲提取溫度65℃，佛手與乙醇的質(zhì)量比1:20，超聲提取時間分別為10、15、20、25、30、35、40 min。結果（圖1）顯示，橙皮苷含量分別為0.0301%、0.0310%、0.0315%、0.0324%、0.0321%、0.0316%、0.0314%，柚皮苷含量分別為0.0315%、0.0317%、0.0326%、0.0342%、0.0343%、0.0339%、0.0335%，綜合考慮選擇25 min超聲提取時間為最佳。

圖1 超聲波提取時間對橙皮苷和柚皮苷含量的影響

2.1.2 佛手與乙醇的質(zhì)量比單因素考察 取萬州種植佛手粉末1.0 g，精密稱定，固定乙醇體積分數(shù)75%，超聲提取時間25 min，超聲提取溫度65℃，佛手與乙醇的質(zhì)量比分別為1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40進行提取。結果（圖2）顯示，橙皮苷提取的百分含量分別為0.0251%、0.0311%、0.0352%、0.0355%、0.0353%、0.0351%、0.0354%，柚皮苷的含量分別為0.0231%、0.0296%、0.0336%、0.0335%、0.0337%、0.0338%、0.0337%，綜合考慮選擇佛手與乙醇的質(zhì)量比1:20為最佳。

圖2 佛手與乙醇的質(zhì)量比對橙皮苷和柚皮苷含量的影響

2.1.3 乙醇體積分數(shù)單因素考察 取萬州種植佛手粉末1.0 g，精密稱定，超聲提取時間25 min，超聲提取溫度65℃，佛手與乙醇的質(zhì)量比1:20，乙醇體積分數(shù)分別為30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液提取。結果（圖3）顯示，橙皮苷提取的百分含量分別為0.0215%、0.0227%、0.0237%、0.0258%、0.0282%、0.0321%、0.0325%，柚皮苷的含量分別為0.0231%、0.0263%、0.0297%、0.0325%、0.0338%、0.0342%、0.0337%，綜合考慮選擇80%乙醇為最佳。

圖3 乙醇體積分數(shù)對橙皮苷和柚皮苷含量的影響

2.1.4 超聲提取溫度單因素考察 取萬州種植佛手粉末1.0 g，精密稱定，固定乙醇體積分數(shù)80%，超聲提取時間25 min，佛手與乙醇的質(zhì)量比1:20，分別于40、45、50、55、60、65、70℃進行提取。結果（圖4）顯示，橙皮苷提取的百分含量分別為0.0256%、0.0263%、0.0289%、0.0298%、0.0341%、0.0338%、0.0337%，柚皮苷的含量分別為0.0283%、0.0297%、0.0314%、0.0352%、0.0349%、0.0345%、0.0347%，綜合考慮選擇超聲提取溫度60℃為最佳。

圖4 超聲提取溫度對橙皮苷和柚皮苷含量的影響

2.2 提取工藝優(yōu)選

基于萬州佛手單因素提取工藝試驗結果，根據(jù)各因素的特點及影響程度，選擇超聲提取時間（A）、乙醇體積分數(shù)（B）、超聲提取溫度（C）、佛手與乙醇的質(zhì)量比（D）為自變量，中水平分別為25 min、60℃、80%、1:20，采用4因素3水平Box-Behnken Design試驗設計[21]，因素水平見表1，試驗安排及結果見表2。

表1 Box-Behnken試驗因素水平

表2 Box-Behnken試驗及結果

續(xù)表2

2.3 橙皮苷和柚皮苷標準曲線的建立

根據(jù)1.4.4項下HPLC分析，以峰面積y對質(zhì)量濃度x進行線性回歸，得橙皮苷回歸方程y=33.838x+17.776（R2=0.9998），柚皮苷回歸方程y=60.635x+56.247（R2=0.9997），線性范圍3.25～208.00 μg/mL。

2.4 樣品測定

按照設計的試驗條件提取橙皮苷和柚皮苷，取各試驗設計供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定即得，結果見表2，響應面分析結果見圖5，方差分析結果見表3。

從表3方差分析可知，對橙皮苷來說，A、B、C、D、A2、B2、C2、D2為顯著性影響因素。在各影響因素中，佛手與乙醇的質(zhì)量比（D）的影響因素最大，其次超聲提取溫度（C）、乙醇濃度（B）和超聲提取時間（A）。在所有的作用因素中，平方項和1次項的系數(shù)對橙皮苷含量的影響較大，而交互項對橙皮苷含量影響相對較小，在交互項中，影響最大的是AD，影響最小的為AC；對柚皮苷含量提取來說，A、B、C、D、A2、B2、C2、D2為顯著性影響因素，影響最大的是A2，影響最小的是C。在各影響因素中，乙醇濃度（B）的影響因素最大，其次是佛手與乙醇的質(zhì)量比（D）、超聲提取時間（A）、超聲提取溫度（C）。在總的作用因素中，平方項和一次項的影響較大，而交互項項影響相對較小，在交互項中，影響最大的是AC，影響最小AB。

以萬州種植佛手中橙皮苷和柚皮苷含量為響應值，采用Design-Expert 8.0.6.1軟件對表2試驗數(shù)據(jù)進行三元二次多項式逐步回歸擬合，得回歸方程Y=0.0689+0.003733A+0.003783B+0.005025C+0.006092D-0.001700AB+0.0007500AC+0.002700AD+0.001525BC+0.001925BD+0.002600CD-0.0159A2-0.0154B2-0.0164C2-0.0148D2、Y=0.079+0.004700A+0.006267B+0.003450C+0.005283D-0.0003750+0.003475AC+0.001500AD+0.002675BC+0.002650BD+0.001300CD-0.021A2-0.018B2-0.020C2-0.020D2。由表3和回歸方程可以看出，該模型高度顯著，與實際試驗擬合較好，能很好地描述試驗結果。為更直觀地表現(xiàn)各因素對橙皮苷和柚皮苷提取量的相互關系，擬進行響應面分析，結果見圖5，從結果看出，各因子之間交互效果不顯著，但是有一定的相互作用，并且既有正相關也存在著負相關。

表3 回歸方程方差分析

圖5 超聲提取時間、乙醇濃度、超聲提取溫度和料液比對橙皮苷和柚皮苷的影響的響應面

驗證試驗通過Design Expert V8.0.6.1軟件進行響應面設計優(yōu)化，確定橙皮苷和柚皮苷含量最佳提取工藝條件為超聲提取時間26.3 min、乙醇體積分數(shù)81.5%、超聲提取溫度61.7℃、佛手與乙醇的質(zhì)量比1:21.9，則橙皮苷和柚皮苷提取的最大量為0.0705%和0.0808%。結合實際操作考慮，將工藝條件修正為超聲提取時間26 min、乙醇體積分數(shù)82%、超聲提取溫度62℃、佛手與乙醇的質(zhì)量比1:22（g/mL）。按該工藝進行5次驗證試驗，結果萬州區(qū)種植佛手和浙江佛手橙皮苷和柚皮苷含量如表4，與預測值基本一致，表明該三元二次方程與實際情況擬合較好，充分驗證了所建模型的正確性。

表4 不同產(chǎn)地佛手中橙皮苷和柚皮苷含量（n=5） %

3 討論與結論

超聲波提取分離主要是依據(jù)物質(zhì)中有效成分和有效成分群體的存在狀態(tài)、極性、溶解性等設計的一種方法。合理利用超聲波振動的方法進行提取的新工藝，使溶劑快速地進入固體物質(zhì)中，將其物質(zhì)所含的有機成分盡可能完全地溶于溶劑，得到多成分混合提取液。利用超聲波技術來強化提取分離過程，可有效提高提取分離率，縮短提取時間、節(jié)約成本，甚至還可以提高產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)量。本方法可較好地應用于萬州種植佛手有效成分的提取，其主要藥效成分可較好保留。在整個提取過程中溫度較低，有利于萬州種植佛手中的有效成分不被破壞。

在單因素試驗基礎上，確定超聲提取時間、乙醇體積、超聲提取溫度、液固比對萬州佛手橙皮苷和柚皮苷提取率影響顯著，采用響應面法對超聲輔助提取萬州種植佛手中的橙皮苷和柚皮苷工藝條件進行優(yōu)化，結果預測值與實測值基本一致，說明建立的工藝條件可靠，能有效提高萬州種植佛手中的橙皮苷和柚皮苷的提取率，對萬州種植佛手資源的綜合利用及工業(yè)生產(chǎn)具有指導意義。

本試驗利用響應曲面法優(yōu)化了從萬州種植佛手提取橙皮苷和柚皮苷的4個關鍵因子，得到二次項回歸模型，并對交互項作用進行分析。確定最佳工藝條件為超聲提取時間26 min、乙醇體積分數(shù)82%、超聲提取溫度62℃、佛手與乙醇的質(zhì)量比1:22（g/mL）。