百蕊草藥材中5種黃酮類化學(xué)成分的含量測(cè)定

鄭玲玲，紀(jì)瑞鋒，韓紅亮，羅旖璐，羅嘉儀，管悅琴，姚其盛，鄭衛(wèi)兵，陳美蘭，周修騰

（1中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心/道地藥材國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，北京 100700；2廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣州 510006；3安徽九華華源藥業(yè)有限公司，安徽滁州 239000）

0 引言

百蕊草為檀香科植物百蕊草Thesium chinensisTurcz.的干燥全草，原名百乳草，別名一顆松、細(xì)須草、青龍草、地石榴、松毛參等，系草本或灌木[1]。百蕊草始載于《圖經(jīng)本草》，味苦澀，性溫，補(bǔ)氣益腎，清熱解毒，解暑，對(duì)多種致病菌有抑制作用，全草入藥能抗菌消炎、清熱解毒、補(bǔ)腎澀精，被譽(yù)為“植物抗生素”[2]。臨床上已有百蕊草顆粒、百蕊草片、百蕊草膠囊等制劑，主要用于急性炎癥如乳腺炎、肺炎、肺膿瘍、扁桃體炎、上呼吸道感染等多種疾病，療效顯著，市場(chǎng)潛力較大。但是由于百蕊草資源儲(chǔ)量較少，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)需要，因而急需深入結(jié)合植化分析及藥效評(píng)價(jià)研究開展擴(kuò)大藥源方面研究，為藥材質(zhì)量的控制以及優(yōu)良種質(zhì)的選育提供技術(shù)指導(dǎo)，為百蕊草資源可持續(xù)利用提供科學(xué)依據(jù)。

百蕊草中含有黃酮、有機(jī)酸、生物堿、甾醇、酚類、揮發(fā)油等多種化學(xué)成分，黃酮類化合物是百蕊草抗菌消炎作用的主要成分之一，其在百蕊草中含量最高，且抑菌效果最好[3]，因此黃酮類成分含量成為評(píng)價(jià)其質(zhì)量的一項(xiàng)重要指標(biāo)[2]。百蕊草報(bào)道的化學(xué)成分有23種，且包括黃酮類[4-5]，黃酮醇類[5-7]、二氫黃酮醇類[8]及其他類成分[4,9]，徐國(guó)兵等[10]一般以山奈酚或總黃酮含量對(duì)百蕊草進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。目前，百蕊草成分的提取一般使用酸水解的方法，是使結(jié)合型黃酮類成分水解成游離型黃酮類成分，以檢測(cè)山奈酚及槲皮素等水解產(chǎn)物為評(píng)價(jià)指標(biāo)。吳兆喜[3]對(duì)水解法后百蕊草山奈酚及槲皮素等黃酮醇苷類成分進(jìn)行提取，確定百蕊草最佳提取工藝，并發(fā)現(xiàn)用60%甲醇提取的效果最佳。湯超[11]以水解后山奈酚含量為指標(biāo)對(duì)百蕊草藥材建立指紋圖譜。徐國(guó)兵[10]采用高效液相色譜法測(cè)定水解后百蕊草山奈酚含量，建立百蕊草質(zhì)量檢測(cè)方法。

雖然百蕊草的黃酮類成分眾多，但是研究測(cè)定的成分一般是水解后單一的山奈酚或槲皮素類成分，本研究結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)研及前期代謝組學(xué)研究的基礎(chǔ)上，建立百蕊草素Ⅰ、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、紫云英苷、山奈酚-7-O-葡萄糖苷和芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的化學(xué)成分檢測(cè)方法，以期為百蕊草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供借鑒，全面評(píng)價(jià)百蕊草藥材的質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 儀器

超高效液相色譜儀(Waters；ACGUITY I-CLASS)，Millipore超純水系統(tǒng)（美國(guó)Thermo Scientific公司），SB-800 DTD超聲清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司），BT-224S型萬分之一電子分析天平（上海贊維衡器有限公司），XS105DU型1/10萬分析天平（梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易有限公司），ZA305AS十萬分之一電子天平（上海贊維衡器有限公司）。

1.2 試劑

百蕊草素Ⅰ（批號(hào)：C09M9G55496，純度≥98%）購(gòu)買于上海源葉生物科技有限公司；山奈酚-3-O-蕓香糖苷（批號(hào)：DST200619-075，純度≥98%）、紫云英苷（批號(hào)：DSTDZ000101，純度≥98%）、山奈酚-7-O-葡萄糖苷（批號(hào)：DST200719-077，純度≥98%）、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（批號(hào)：DST200923-063，純度≥98%）購(gòu)買于樂美天醫(yī)藥/德斯特生物；色譜甲醇、色譜乙腈購(gòu)買于Thermo Fisher Scientific；超純水自制。

1.3 百蕊草藥材

野生兩年生百蕊草由九華華源藥業(yè)提供，采自安徽滁州；人工種植百蕊草由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心和九華華源藥業(yè)合作在安徽滁州種植基地種植并采集兩年生百蕊草。試驗(yàn)于2021年1—4月在中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.4 方法

1.4.1 正交試驗(yàn)

（1）采用正交試驗(yàn)法考察料液比、提取時(shí)間及溶劑比例對(duì)百蕊草成分提取的影響，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)三因素三水平，具體的參數(shù)見表1。

表1 因素水平表

（2）根據(jù)選擇的因素水平，按照L9（34）正交試驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)安排，共有9組試驗(yàn)，按照試驗(yàn)號(hào)對(duì)應(yīng)的提取條件，分別稱取百蕊草粉末0.5 g于25 mL錐形瓶中進(jìn)行提取試驗(yàn)，采用超高效液相色譜法測(cè)定其化學(xué)成分的含量。

1.4.2 色譜條件 色譜柱：ACQUITYUPLC BEH-C18柱(2.1×50 mm，1.7 μm)，柱溫：30℃，流速：0.4 mL/min，波長(zhǎng)：254 nm，流動(dòng)相：乙腈-0.5%甲酸水進(jìn)行梯度洗脫，具體見表2，進(jìn)樣量：1 μL。

表2 流動(dòng)相洗脫表

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

（1）取百蕊草素Ⅰ對(duì)照品10 mg，置于5 mL容量瓶中，加入純甲醇至刻度線，制成2 mg/mL的母液，逐級(jí)稀釋成1 mg/mL和500、200、100、20、10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

（2）取山奈酚-3-O-蕓香糖苷對(duì)照品5 mg，置于5 mL容量瓶中，加入純甲醇至刻度線，制成1 mg/mL的母液，逐級(jí)稀釋成20、100、20、10、2、1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

（3）取紫云英苷對(duì)照品5 mg，置于5 mL容量瓶中，加入純甲醇至刻度線，制成1 mg/mL的母液，逐級(jí)稀釋成200、100、20、10、2、1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液

（4）取山奈酚-7-O-葡萄糖苷對(duì)照品5 mg，置于5 mL容量瓶中，加入純甲醇至刻度線，制成1 mg/mL的母液，逐級(jí)稀釋成200、100、20、10、2、1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液

（5）取芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷對(duì)照品10 mg，置于5 mL容量瓶中，加入純甲醇至刻度線，制成2 mg/mL的母液，逐級(jí)稀釋成 1、500、200、50、20、10μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4.4 方法學(xué)考察

（1）專屬性考察。分別吸取1 mg/mL的百蕊草素Ⅰ、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、紫云英苷、山奈酚-7-O-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷100 μL，加入500μL純甲醇配制成混合對(duì)照品溶液，按1.4.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。

（2）線性關(guān)系考察。精密量取標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.4.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行回歸統(tǒng)計(jì)。

（3）精密度考察。精密量取供試品溶液，按1.4.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，同法平行操作6次，隨行標(biāo)曲，測(cè)定峰面積，計(jì)算其含量。

（4）穩(wěn)定性考察。取混合對(duì)照品溶液，分別在0、2、4、6、8、12、15、24 h進(jìn)樣，按1.4.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。

（5）重復(fù)性考察。取百蕊草粉末0.5 g，精密稱定，重復(fù)6份，按照2.1項(xiàng)下正交實(shí)驗(yàn)最優(yōu)超聲提取方法進(jìn)行樣品制備，按1.4.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。

（6）加樣回收率考察。采用加樣回收法，取已知含量的樣品粉末9份，每份0.5 g，精密稱定；分別加入百蕊草素Ⅰ、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、紫云英苷、山奈酚-7-O-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷對(duì)照品溶液高中低各400 μL，按照2.1項(xiàng)下正交實(shí)驗(yàn)最優(yōu)超聲提取方法進(jìn)行樣品制備，按1.4.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算測(cè)得回收率。

1.4.5 野生與人工種植百蕊草含量的測(cè)定 分別稱取安徽馬廠野生與人工種植百蕊草的地上、地下粉末0.5 g，重復(fù)6次，按照優(yōu)化的提取和UPLC測(cè)定方法對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2010軟件對(duì)數(shù)據(jù)整理、AI與PS繪圖軟件和SPSS 26.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得出結(jié)論。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果

從正交試驗(yàn)直觀分析結(jié)果可以看出（表3），各因素對(duì)百蕊草總黃酮總含量提取率的影響程度不同，3個(gè)因素對(duì)提取率的影響由大到小依次為料液比＞溶劑比例＞提取時(shí)間。直觀分析結(jié)果篩選出百蕊草黃酮類總含量的最優(yōu)提取方案為A1B2C2，即稱取百蕊草粉末，用10倍量的60%甲醇作提取溶劑，超聲(40 KHz)提取45 min。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 專屬性 混合對(duì)照品溶液、百蕊草供試品溶液的UPLC色譜圖如圖1，結(jié)果顯示百蕊草5種主要成分分析均不存在干擾，表明本實(shí)驗(yàn)UPLC方法專屬性良好。

圖1 色譜條件分析

2.2.2 線性關(guān)系 百蕊草5種成分的線性回歸方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)見表4，結(jié)果表明百蕊草5種成分所在考察范圍內(nèi)線性良好。

表4 線性方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)

2.2.3 精密度 百蕊草5種化學(xué)成分精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5，RSD值均小于1.25%，表明儀器精密度良好。

表5 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.4 穩(wěn)定性 百蕊草5種成分標(biāo)準(zhǔn)品溶液峰面積見表6，24 h內(nèi)RSD均小于1.8%，表明方法穩(wěn)定性良好。

表6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.5 重復(fù)性 百蕊草5種成分的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表7，RSD均小于3%，表明方法重復(fù)性良好。

表7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.6 加樣回收率 百蕊草5種化學(xué)成分的加樣回收率結(jié)果見表8，RSD均小于3.24%，說明本法準(zhǔn)確度良好。

表8 回收率結(jié)果表

2.3 野生與人工種植百蕊草含量的測(cè)定

由表9可知，百蕊草不同部位的化學(xué)成分含量不同，人工種植百蕊草地上部分的百蕊草素Ⅰ、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、紫云英苷、山奈酚-7-O-葡萄糖苷及芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的含量均顯著(P＜0.05)高于地下部分，分別是地下部分含量的4～20.69倍；野生百蕊草藥材地上部分百蕊草素Ⅰ、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、山奈酚-7-O-葡萄糖苷及芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的含量均顯著高于(P＜0.05)地下部分，分別是地下部分含量的2.64～6.14倍，紫云英苷含量有高于地下部分的趨勢(shì)，但是二者之間并無顯著性差異。

表9 人工種植與野生百蕊草藥材化學(xué)成分含量表(±SD,n=6)mg/g

表9 人工種植與野生百蕊草藥材化學(xué)成分含量表(±SD,n=6)mg/g

注：a，b表示人工種植地上與地下顯著性差異；c，d表示野生百蕊草地上地下顯著性差異；A，B表示人工與野生百蕊草地上顯著性差異；C，D表示人工與野生地下顯著性差異(P＜0.05)。

處理 百蕊草素Ⅰ 山奈酚-3-O-蕓香糖苷 紫云英苷 山奈酚-7-O-葡萄糖苷 芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷人工野生地上地下地上地下1 2.9 8±0.4 4 a A 1.4 4±0.1 7 b C 8.2 8±0.3 1 c B 2.4 3±0.1 4 d D 0.2 6±0.0 1 a A 0.0 2±0.0 2 b A 0.2±0.0 9 c A 0.0 5±0.0 5 d A 0.2 8±0.0 1 a A 0.0 7±0.0 2 b C 0.2±0.0 4 c B 0.1 5±0.0 5 c D 0.8 4±0.0 2 a A 0.1±0.0 2 b C 0.2 9±0.0 6 c B 0.1 1±0.0 6 d D 1 7.3 8±0.6 5 a A 0.8 4±0.1 b C 3.5±0.0 2 c B 0.5 7±0.0 8 d D

野生百蕊草與人工種植百蕊草地上部分化學(xué)成分相比，人工種植百蕊草藥材的百蕊草素Ⅰ、紫云英苷、山奈酚-7-O-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷含量均顯著(P＜0.05)高于野生百蕊草藥材，人工種植百蕊草藥材地上部分山奈酚-3-O-蕓香糖苷含量有高于野生百蕊草藥材地上部分的趨勢(shì)，但是沒有顯著性差異。

野生百蕊草藥材與人工種植百蕊草藥材地下部分化學(xué)成分相比，野生百蕊草藥材的百蕊草素Ⅰ含量、紫云英苷含量、山奈酚-7-O-葡萄糖苷含量均顯著(P＜0.05)高于人工種植百蕊草藥材，野生百蕊草藥材中山奈酚-3-O-蕓香糖苷有高于人工種植百蕊草藥材的趨勢(shì)，但是二者之間并無顯著性差異，人工種植百蕊草藥材的芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷含量顯著高于野生藥材。

3 結(jié)論與討論

百蕊草含有多種化學(xué)成分，其中黃酮類成分在百蕊草中含量最高，抑菌藥理活性最好[1]。目前，大多數(shù)對(duì)于百蕊草活性成分的報(bào)道主要針對(duì)黃酮類成分的研究[11]，市場(chǎng)上對(duì)百蕊草的質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)均以其黃酮醇苷的含量作為標(biāo)準(zhǔn)[12]。黃酮類化合物提取的方法多為醇提法[13]、水提取法[14]、堿性水提取或其他有機(jī)溶劑萃取法[15-16]，前期課題組預(yù)實(shí)驗(yàn)考察了水提取法、堿浸提法、有機(jī)溶劑提取法，最終確定有機(jī)溶劑提取效果最佳；通過考察振搖、回流、超聲提取方式，發(fā)現(xiàn)超聲與回流中各成分提取效果顯著(P＜0.05)優(yōu)于振搖提取，而超聲與回流提取之間各成分含量并無顯著性差異，因此從總體效益和時(shí)間成本綜合考慮，本研究選取超聲提取方法；通過考察乙酸乙酯、甲醇和乙醇等有機(jī)溶劑的超聲提取效果，最終發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯部位未能檢測(cè)出化學(xué)成分，且甲醇溶劑中各成分提取效果顯著(P＜0.05)優(yōu)于乙醇，故確定甲醇為百蕊草化學(xué)成分的超聲提取溶劑。通過正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，考察甲醇溶劑比例、超聲時(shí)間和料液比，最終確定百蕊草化學(xué)成分的提取方法為60%的甲醇溶液超聲提取45 min，料液比為1：10。

此外，本研究對(duì)百蕊草化學(xué)成分UPLC檢測(cè)方法進(jìn)行了摸索，分別對(duì)梯度洗脫方法、流動(dòng)相配比、色譜柱等進(jìn)行考察，采用0.5%甲酸水-甲醇溶液、0.1%甲酸水-乙腈溶液、0.5%甲酸水-乙腈溶液作為流動(dòng)相，采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×100 mm，1.7 μm)、Waters ACQUITY UPLC T3 C18(2.1×100 mm，1.7 μm)、Waters ACQUIT YUPLC BEHC18(2.1×50mm，1.7 μm)和Waters ACQUITY UPLC T3 C18(2.1×50 mm，1.7 μm)作為色譜柱進(jìn)行考察，結(jié)果顯示，0.5%甲酸水-乙腈溶液作為流動(dòng)相，Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×50 mm，1.7 μm)作為色譜柱，百蕊草各化學(xué)成分表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系(r＞0.9992)，色譜峰得到很好的分離，且無基質(zhì)干擾。儀器精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗(yàn)RSD均＜3%；百蕊草各化學(xué)成分平均回收率為97%，表明建立的UPLC檢測(cè)方法具有一定的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性和可靠性。

目前，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[17-18]的百蕊草藥材以及上市制劑“百蕊草顆粒、百蕊含片”等的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，多以山奈酚為測(cè)定指標(biāo)。唐慧文等[19]認(rèn)為百蕊草中主要活性成分為黃酮醇苷，通過對(duì)黃酮類成分的比較，確定以山奈酚為指標(biāo)成分；曹明成等[20]以高效液相色譜法測(cè)定百蕊草中的黃酮醇苷水解后的共同黃酮醇苷元山奈酚的含量，并以百蕊草中黃酮醇苷水解后的共同苷元山奈酚含量作為百蕊草質(zhì)量的評(píng)價(jià)指標(biāo)；羅夫來等[21]以百蕊草藥材中總黃酮、山奈酚、甘露醇、多糖等多種活性成分含量作為百蕊草藥材的內(nèi)在品質(zhì)評(píng)價(jià)指標(biāo)；徐國(guó)兵等[10]建立了百蕊草藥材中總黃酮和山奈酚的含量測(cè)定方法，對(duì)百蕊草藥材進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。但是，山奈酚主要是由黃酮苷水解后得到的苷元，因此，大多采用酸水解方法提取百蕊草中山奈酚，目的是使結(jié)合型黃酮類成分的酯鍵或糖苷鍵水解釋放多種形態(tài)游離型黃酮類成分[22]，但是酸水解的程度并不明確，其酸濃度、水解時(shí)間及加入量均是影響水解程度的關(guān)鍵因素，影響含量的準(zhǔn)確性[23-24]，此外，經(jīng)酸水解之后制備的供試液中，山奈酚的含量已非藥材天然含有的水平，不能真實(shí)反映藥材及制劑中真實(shí)的含量[25]。因此，本研究結(jié)合前期百蕊草代謝組學(xué)研究的基礎(chǔ)上，選定百蕊草素Ⅰ、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、紫云英苷、山奈酚-7-O-葡萄糖苷及芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷作為百蕊草的化學(xué)成分，通過對(duì)2批百蕊草藥材的研究發(fā)現(xiàn)，野生百蕊草和人工百蕊草中中百蕊草素Ⅰ與芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷含量均較高，且人工種植百蕊草中化學(xué)成分的含量高于野生種植的百蕊草。后期課題組將結(jié)合代謝組學(xué)和植物化學(xué)的方法分離提純百蕊草黃酮類成分并開展相應(yīng)藥效活性的研究，以期為百蕊草的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)成分鑒定提供借鑒。