納米技術抗耐藥菌的研究進展

洪 冕，黃佳敏，陳冬梅,2，謝書宇*

(1.華中農業(yè)大學國家獸藥殘留基準實驗室(HZAU)，武漢 430070；2.華中農業(yè)大學國家獸藥安全評價實驗室(HZAU)，武漢 430070)

細菌感染對動物健康造成了嚴重威脅，抗生素因具有高效抗菌特性而成為細菌性疾病治療的首選方案。自1928年亞歷山大·弗萊明發(fā)現青霉素以來，諸多抗生素被發(fā)現并用于細菌性疾病治療。20世紀30—60年代被稱為抗生素“黃金時代”，這個時期涌現出大批抗生素，但在之后幾十年新發(fā)現的抗生素種類大幅減少[1]。同時，由于抗生素的過度使用，耐藥細菌不斷出現，這使得細菌性疾病的發(fā)病率及死亡率不斷攀升。治療成本的增加和畜禽生產力的下降，給養(yǎng)殖業(yè)造成了高額經濟損失。2015年，世界衛(wèi)生組織(WHO)宣布將抗微生物藥物耐藥性(AMR)列為全球十大健康威脅之一[2]。

納米技術，即對納米材料的研究及運用。納米材料具有獨特的物理、化學和生物特性，可通過破壞細胞壁及細胞膜、抑制外排泵、抑制滅活酶以及阻礙生物被膜形成等機制來對抗耐藥細菌，提高抗菌藥物療效。將納米技術運用于抗菌藥物研發(fā)，可為對抗耐藥菌提供新途徑。本文將對納米技術的發(fā)展歷程、對抗耐藥細菌策略以及對抗耐藥性的機制進行總結，希望能為解決細菌耐藥性問題提供有效應對方案。

1 納米技術發(fā)展歷程

1959年，現代納米技術之父Richard Feynman在加州理工學院舉辦的美國物理學會年會上進行了名為“物質底層大有空間”的演講，并描述出一個利用微型元件構建分子水平儀器的愿景[3]。這是對納米概念的首次引入。1981年，掃描隧道顯微鏡(STM)的發(fā)明使得人們第一次觀察并操縱單個原子，這為促進納米領域研究發(fā)展提供了可視化的直接證據[4]。隨后，原子力顯微鏡(AFM)、掃描探針顯微鏡(SPM)等儀器的相繼發(fā)明更是推動納米觀測及加工研究的不斷深入。

“納米醫(yī)學”概念源于納米技術與醫(yī)學的融合。納米材料具有小尺度、電化學等性質并易于表面修飾，可通過改變溶解度、提高靶向性、緩釋、控釋等方式提高藥物治療效果。而隨著耐藥菌的不斷出現，納米材料也開始被廣泛應用于細菌性疾病的治療。最開始，人們將抗生素裝載于納米載藥系統(tǒng)中以提高其抗菌效果，常見納米載藥系統(tǒng)包括固體脂質納米粒、脂質體、聚合物納米粒、金屬納米粒、膠束聚合物、樹狀大分子、囊泡和量子點等[5]。然而，隨著越來越多抗菌納米材料被發(fā)現，利用納米材料制備不含抗生素的抗菌劑成為熱點。

1980年，Boman等第一次發(fā)現抗菌肽(AMP)天蠶素。AMP既可與納米載體結合，也可通過自組裝形成有序納米結構，其由于獨特抗菌機制、廣譜抗菌活性、低藥物殘留以及易于合成與修飾而有望作為抗生素替代品[6]。在1985—2004年，研究人員又陸續(xù)發(fā)現了3種新型碳納米材料——碳納米管、石墨烯、富勒烯及其相關的納米復合材料亦展現出了強大的抗菌性能[7]。而作為納米材料的重要分支，金屬納米材料也可直接作為抗菌劑使用，其抗菌性能多取決于大小、形狀及組成[8]。迄今為止，已有金、銀、銅、硫化銅、氧化鐵(III)、氧化鋅、氧化鎂、氧化銅、氧化鈣、二氧化鈦和氧化鎘等金屬或含金屬的納米材料被證明具有高效抗菌活性[9]。

2 納米技術對抗細菌耐藥性的策略

2.1 負載抗菌藥物

以納米材料作為載體，可在保護藥物不被降解的同時促進藥物進入細菌。這增強了藥物與細菌間的相互作用，亦減少了藥物用量，規(guī)避耐藥細菌產生。例如，將替考拉寧裝載于接枝金黃色葡萄球菌特異性配體的聚乳酸-羥基乙酸共聚物納米粒內，其對耐替考拉寧金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度(MIC)降低98%[10]。載有萬古霉素的納米囊泡因高比表面積而能更好分布和吸附至細菌表面，并可高效清除細菌生物被膜，其持續(xù)抗菌時間遠超萬古霉素，對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的MIC亦比萬古霉素低94%[11]。

2.2 自身直接抗菌

部分納米材料自身便具備較強的抗菌能力，可代替抗菌藥物用于治療耐藥細菌的感染。例如，4,6-二氨基-2-嘧啶硫醇修飾的金納米粒(AuNPs)可抑制大腸桿菌和銅綠假單胞菌中多重耐藥菌株的增殖，其既可以選擇性螯合細胞膜上Mg2+以破壞膜結構并泄漏胞內物質，又可以同核糖體和染色體結合以干擾DNA復制、轉錄以及蛋白質合成[12]。Gurunathan等[13]制備的銀納米(AgNPs)通過增強氧化應激反應并抑制抗氧化水平來對抗多重耐藥細菌，其對產黑色素假單胞菌、化膿性假單胞菌的MIC僅為0.8和1.0 μg·mL-1，而對生物被膜的抑制活性高達90%以上。

2.3 光介導抗菌

2.3.1 光熱抗菌 具有光敏活性的納米材料能吸收近紅外光(NIR)并轉換為熱量，其可導致細胞膜破裂、蛋白質變性以及細菌消融[14]。例如，表面修飾有苯硼酸糖聚合物的硫化銅納米粒在NIR照射下產生高熱，高溫抑制了細菌酶活性、細胞膜通透性以及蛋白質和核酸的合成[15]。試驗結果表明，其對耐藥銅綠假單胞菌的抗菌效率超過82%，同時可清除85%以上的生物被膜[15]。Yang等[16]將具有光熱特性的聚吡咯整合至陰離子囊泡上，該種納米材料在NIR照射10 min后可使小鼠組織溫度升高近20 ℃。體外試驗證明，其在NIR照射下顯著提升對鼠傷寒沙門菌耐藥菌株的生長抑制效果并有效阻止生物被膜的形成[16]。

2.3.2 光動力抗菌 光動力抗菌療法是通過納米材料實現無載藥抗菌的另一種策略。其機理多基于光敏劑的光化學反應，即光照條件誘導納米制劑生成大量ROS，進而損害細菌細胞膜、蛋白質以及胞內DNA[17]。例如，結合有二氫卟吩e6的納米粒在光照下產生大量ROS，可清除95%的耐藥銅綠假單胞菌及其70%的生物被膜[18]。有機磷光納米粒能與基態(tài)氧進行有效能量轉移，因此具備快速生產單線態(tài)氧的能力，其在光照5 min后便可殺死100%的MRSA[19]。

2.4 納米酶輔助殺傷

納米酶具備氧化酶、過氧化物酶和脫氧核糖核酸酶等天然酶性質，可促進氧化應激反應，導致細菌損傷[17]。多孔AgPd雙金屬合金納米籠具有氧化酶活性，可通過催化生成ROS來殺傷細菌，其對細菌的MIC在誘導傳代12次以后并未增加，而將其用作表面涂層添加劑時亦可有效抑制生物被膜形成[20]。pH響應性發(fā)光納米酶則是兼具氧化酶和過氧化物酶雙重活性，酸性條件下，其酶活性被激活以催化生成ROS，在pH=5.5的環(huán)境中可抑制99.2%的大腸桿菌、96.5%的金黃色葡萄球菌以及98.4%的MRSA生長[21]。

3 納米技術對抗耐藥細菌機制

3.1 損傷細胞壁及細胞膜

耐藥菌通過降低細胞膜通透性限制抗生素進入。由于細菌表面攜帶的負電荷要多于機體細胞，因此帶正電荷的納米材料可優(yōu)先同細菌大量結合，進而影響細胞壁和細胞膜結構，導致胞內容物流失[22]。例如，質子化伯胺修飾的低分子量聚合物通過自組裝形成具有高正電荷密度的有機納米粒，其導致耐氨芐西林大腸桿菌表面呈現破碎、倒塌及殘缺狀態(tài)[23]。由兩種季銨鹽前體合成左氧氟沙星碳點可吸附于細菌表面并誘導細胞膜穿孔、破裂，其對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的MIC在耐藥誘導38代時仍未發(fā)生改變，而鹽酸左氧氟沙星對這兩種菌的MIC分別在耐藥誘導10代和16代后增加[24]。

3.2 抑制外排泵

耐藥細菌中外排泵表達通常會上調，以便主動將抗菌藥物轉送至細菌外[22]。而納米材料可與細菌大量結合，其在目標部位的高濃度能抑制外排泵的主動清除作用。例如，將四環(huán)素和鹽酸林可霉素封裝于聚丙烯酸納米凝膠載體中，用陽離子聚電解質進行功能化修飾后可實現其在細胞壁上的累積并局部釋放藥物，其對四環(huán)素以及林可霉素高度耐藥菌的MIC比游離抗生素低87.5%[25]。多元醇包被的CuO、ZnO和CuZn納米粒可用作外排泵抑制劑，與抗生素聯用時表現出較好的協(xié)同抗菌作用。細菌外排試驗表明，其抑制了76.7%的溴化乙錠流出多重耐藥銅綠假單胞菌[26]。

3.3 抑制滅活酶

通過產生滅活酶來水解或修飾抗菌藥物是另一種細菌耐藥機制，常見滅活酶包括β-內酰胺酶、酯酶、氨基糖苷鈍化酶、氯霉素乙酰轉移酶、核苷轉移酶等[27]。如今，酶促失活已成為新一代抗生素類藥物實際應用主要難題。某些納米材料恰好可抑制滅活酶活性，從而保護抗菌藥物。例如，多功能金屬螯合膦酸鹽/FeO磁性納米粒能抑制66%的β-內酰胺酶活性，用其負載頭孢氨芐后可將頭孢氨芐的MIC降低75%[28]。一種由苯并惡唑和葡聚糖構成的納米制劑對β-內酰胺酶的抑制率可達77.5%，當其負載頭孢西丁鈉(CFS)時對耐CFS大腸桿菌的MIC僅為游離CFS的6.2%，可更快治愈耐藥細菌感染傷口[29]。

3.4 多重靶標

細菌上通常存在可被抗菌藥物識別的特定靶標，耐藥基因的表達可導致靶標數量減少或被化學修飾，從而干擾細菌與藥物結合，賦予細菌耐藥性。納米材料可識別并結合多個靶標，因此其誘導耐藥菌出現的可能性小，并且面對部分靶標突變時亦能發(fā)揮較強抗菌作用。例如，氫氧化鑭與氧化石墨烯構成的納米復合材料(La@GO)具有磷脂去磷酸化、脂質過氧化和肽聚糖破壞等胞外多重靶標殺傷機制。當大腸桿菌連續(xù)30 d暴露于亞MIC濃度的La@GO中時并不會出現繼發(fā)性耐藥，而諾氟沙星則導致細菌的耐藥性增加了64倍[30]。銀可通過靶向糖酵解、氧化磷酸戊糖途徑、氧化應激等多個基本通路殺死金黃色葡萄球菌。Wang等[31]將金黃色葡萄球菌連續(xù)暴露于AgNPs 16次未能誘導MIC增加，并且AgNPs可與多種抗生素產生協(xié)同抗菌作用，這意味著其能使耐藥細菌對抗生素重新敏感。

3.5 產生活性氧(ROS)

ROS是細胞氧化代謝副產物，包括超氧陰離子(O2-)、單態(tài)氧(1O2)、過氧化物(O22-)等，它們影響著細胞的分化、信號傳導、存活以及死亡。納米材料可自身產生ROS、誘導細胞器產生ROS以及同具有氧化還原活性的生物分子(如NADPH氧化酶)作用以氧化生成ROS[22]。由于細菌耐藥機制并未針對ROS，因此過量ROS對耐藥細菌仍能產生較好的抗菌作用。ROS一方面與蛋白質硫醇反應，使游離蛋白質及細胞壁受體失活；另一方面可氧化dCTP和dGTP池導致DNA雙鏈斷裂，使堿基誤入DNA，造成DNA損傷[22,32]。此外，ROS還可預防生物被膜形成并破壞已建立的生物被膜[33]。二硫化鉬納米片是一種光催化劑，其在太陽光照射下可產生大量ROS以殺死99.9%的耐藥細菌[34]。CuInS/ZnS量子點通過吸收NIR以產生ROS，其在光照10 min后可殺死82%的耐藥銅綠假單胞菌，并有效抑制生物被膜形成[35]。

3.6 損傷細胞成分

除生成ROS以外，納米材料還可直接損傷蛋白質、DNA等胞內成分，進而干擾耐藥細菌同質狀態(tài)、胞內信號通路以及細胞代謝。其常見損傷機制包括改變細菌基因表達、造成DNA損傷以及干擾蛋白質合成[22]。血小板膜偽裝納米?？蓽p弱MRSA內部F型ATP合酶活性，ATP水平的降低使得細菌因代謝能量不足而死亡，其負載萬古霉素后對MRSA的MIC是萬古霉素的1/4[36]?；預gNPs可中斷細菌ATP合成并誘導三羧酸循環(huán)等代謝途徑失調，研究表明，其增強了耐藥大腸桿菌對諾氟沙星的敏感性，使諾氟沙星治療劑量降低90%[37]。

3.7 對抗細菌生物被膜

基于適應性和自然耐受性，細菌從自由生活的生命形式(即浮游生物)轉變?yōu)楣讨亩鄬哟稳郝?即生物被膜)[38]。多糖、蛋白質、脂質以及胞外DNA等胞外聚合物構成生物被膜基質，可隔離或延緩吸收抗菌藥物[39]。同時，生物被膜中的“休眠細胞”代謝活性低、生長速度慢，因此對抗菌藥物存在一定抗性[38]。此外，生物被膜由于內部結構穩(wěn)定性和細菌緊密鄰近性而成為水平基因轉移的理想生態(tài)位，膜內各細菌之間相交換耐藥基因，促進耐藥細菌產生[40]。多物種生物被膜的形成將導致抗菌藥物最低生物被膜殺菌濃度(MBBC)增加。納米材料可增加抗菌藥物在生物被膜上的滲透性，也可借助光熱轉換等物理或生化作用破壞生物被膜完整性[41]。例如，Makabenta等[42]制備的聚合物納米粒可有效穿越生物被膜，其對雙物種生物被膜的MBBC無顯著增加，同時以劑量依賴性方式根除細菌并減少生物被膜生物量。He等[43]制備的高效光熱納米粒具有較強光熱轉化能力，在光照條件下可使生物被膜基質中的蛋白質、多糖等黏性成分失活，體外試驗表明其可根除75%的金黃色葡萄球菌生物被膜。

4 小 結

通過改變細胞膜通透性、表達滅活酶以及形成生物被膜等方式，細菌對抗菌藥物的抵抗力不斷增強。耐藥細菌的出現降低了傳統(tǒng)藥物小分子的臨床治療效果，而加大治療劑量又可能導致機體損傷與藥物殘留。因此，尋找新方法以對抗細菌耐藥性顯得尤為迫切。納米材料通過破壞細胞壁及細胞膜、抑制外排泵、抑制滅活酶等多種方式來對抗耐藥細菌。其具備廣闊設計空間，不僅粒徑、電位、形態(tài)可調，還能進行多種表面修飾。目前，利用納米材料制備抗菌劑已成為熱門。隨著納米技術的發(fā)展，具有多重抗菌機制的多功能復合納米不斷開發(fā)，將在抵抗細菌耐藥性領域具有更廣闊的發(fā)展前景。不過，盡管抗菌性能優(yōu)異，納米材料在臨床應用方面仍存在諸多挑戰(zhàn)。首先，多數抗菌納米材料通過靜電相互作用與表面帶負電荷的細胞結合，難以特異性區(qū)分細菌與機體細胞。人們需尋找能與細菌結合的特異性配體，以增強納米材料對細菌的靶向識別與結合能力。其次，對機體的潛在毒性是納米材料臨床應用的主要難題之一。一些納米材料可刺激樹突狀細胞以及其他免疫細胞釋放活性氧等介質，從而誘導機體產生超敏反應、自身免疫性疾病和炎癥反應[44]。因此，在確保納米制劑具有良好殺菌作用的同時也必須對其進行細胞毒性評估，并通過改變大小、形狀、表面電荷、制備方法以及表面修飾等方式來降低毒性作用。相信隨著納米技術的不斷拓寬與深入研究，其在對抗耐藥細菌方面的應用必將得到進一步發(fā)展。