宿主抗新孢子蟲(chóng)感染的免疫機(jī)制研究進(jìn)展

陶德良，趙姍姍，陳 曦，陳金銘，楊 新，宋軍科，趙光輝

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

新孢子蟲(chóng)(Neosporacaninum)是一種專(zhuān)性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲(chóng)，在世界范圍內(nèi)廣泛分布，可感染犬、牛、羊等多種哺乳動(dòng)物。新孢子蟲(chóng)感染會(huì)引起新生犢牛神經(jīng)系統(tǒng)紊亂以及孕畜的流產(chǎn)和死胎，是引起牛繁殖障礙的一種重要病原，給世界養(yǎng)牛業(yè)帶來(lái)了較為嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。研究發(fā)現(xiàn)，新孢子蟲(chóng)感染導(dǎo)致的流產(chǎn)與母胎界面的炎癥以及免疫反應(yīng)有關(guān)[1-2]，但具體的致病機(jī)制仍不夠清楚。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)于新孢子蟲(chóng)致病機(jī)制的研究集中在Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)、Nod樣受體(Nod-like receptors，NLRs)等先天免疫中的一些模式識(shí)別受體以及NF-κB(nuclear factor kappa-B)、MAPK(mitogen-activated protein kinase)等先天免疫中的經(jīng)典通路在新孢子蟲(chóng)感染中的作用，并且有研究表明一氧化氮(nitric oxide，NO)、γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)等在新孢子蟲(chóng)感染中也發(fā)揮著巨大的作用，但是關(guān)于新孢子蟲(chóng)與凋亡、自噬、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、氧化應(yīng)激以及microRNA等在新孢子蟲(chóng)感染中的調(diào)控作用的研究十分有限，仍需要大量的基礎(chǔ)科學(xué)研究來(lái)探討相關(guān)的機(jī)制。本文將在新孢子蟲(chóng)感染過(guò)程中宿主如何通過(guò)模式識(shí)別受體識(shí)別新孢子蟲(chóng)的感染、并進(jìn)一步調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路以及細(xì)胞免疫來(lái)抵抗新孢子蟲(chóng)感染方面作以概述，以期為新孢子蟲(chóng)病的研究提供參考。

1 模式識(shí)別受體在新孢子蟲(chóng)感染中的作用

先天免疫(innate immunity)是機(jī)體免疫系統(tǒng)的第一道防線(xiàn)，在抵抗病原感染與增殖中發(fā)揮著重要作用，同時(shí)參與抗原的識(shí)別與遞呈，并與獲得性免疫(adaptive immunity)應(yīng)答聯(lián)合作用來(lái)清除病原微生物感染。在先天免疫中，一些免疫細(xì)胞可以通過(guò)模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor，PRRs)識(shí)別病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)或者損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular pattern,DAMPs)，當(dāng)這些模式受體被激活后，可以產(chǎn)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活相應(yīng)的信號(hào)通路，并促使吞噬細(xì)胞聚集，產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子，同時(shí)PRRs也會(huì)參與誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫細(xì)胞(特別是T淋巴細(xì)胞)的共刺激信號(hào)[3]。目前研究的PRRs主要包括Toll樣受體、NOD樣受體、C型凝集素受體(C-type lectins receptors，CLRs)和RIG 樣受體(RIG-like receptors，RLRs)[3]。在新孢子蟲(chóng)感染中，TLRs中的TLR2和TLR3在抑制新孢子蟲(chóng)的增殖以及控制炎癥方面發(fā)揮著重要作用；NLRs家族中的成員可以組裝為炎癥小體參與新孢子蟲(chóng)的清除。目前對(duì)于CLRs與RLRs的研究十分有限，但也有研究發(fā)現(xiàn)，CLRs中的Dectin-1可以抑制新孢子蟲(chóng)的增殖以及控制炎癥的發(fā)展。

1.1 TLRs

TLRs是一類(lèi)跨膜糖蛋白，主要表達(dá)于單核巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞等免疫細(xì)胞，TLRs主要通過(guò)識(shí)別病原微生物一些固有成分來(lái)參與機(jī)體的先天免疫應(yīng)答。關(guān)于TLRs在新孢子蟲(chóng)感染中的作用研究日益增多，尤其集中在TLR2和TLR3。研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠巨噬細(xì)胞體外感染模型中檢測(cè)到TLR3和TRIF的上調(diào)，敲除TLR3和TRIF的小鼠出現(xiàn)新孢子蟲(chóng)荷蟲(chóng)量增加與炎癥病變加劇，表明TLR3-TRIF增強(qiáng)了小鼠對(duì)新孢子蟲(chóng)感染的抵抗力，并且當(dāng)TLR3-TRIF靶向宿主的溶酶體時(shí)，新孢子蟲(chóng)會(huì)激活TLR3依賴(lài)的Ⅰ型干擾素的免疫應(yīng)答[4]。在感染新孢子蟲(chóng)的牛羊中同樣檢測(cè)到TLR3的上調(diào)，新孢子蟲(chóng)感染的妊娠母牛在胎盤(pán)和脾臟組織以及胎兒中均可以檢測(cè)到TLR3/7/8的上調(diào)表達(dá)，這與滅活的可溶性全抗原或者重組NcSAG1、NcHSP20或NcGRA7蛋白免疫后的效果一致[1]；同樣Nc-Spain7和Nc-Spain1H這2種蟲(chóng)株感染牛均能夠上調(diào)TLR2的表達(dá)，這可能與新孢子蟲(chóng)的糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol，GPI)的毒性作用有關(guān)[5]。此外，暴露于新孢子蟲(chóng)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TLR2和TLR11表達(dá)上調(diào)，TLR2/MyD88依賴(lài)的抗原遞呈細(xì)胞成熟以及促炎因子增多[6]，且TLR11介導(dǎo)的MEK-ERK信號(hào)通路會(huì)迅速激活，進(jìn)而導(dǎo)致白細(xì)胞介素12p40(interleukin-12p40，IL-12P40)的上調(diào)表達(dá)[7]。由此可見(jiàn)，宿主TLRs在介導(dǎo)新孢子蟲(chóng)感染引起的免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，新孢子蟲(chóng)激活的TLRs可以通過(guò)MyD88依賴(lài)途徑以及TRIF依賴(lài)途徑等接頭分子來(lái)調(diào)控下游NF-κB、MAPK等信號(hào)通路以及促進(jìn)IFN、IL等一些炎性因子的表達(dá)來(lái)發(fā)揮抗新孢子蟲(chóng)感染的作用。目前關(guān)于新孢子蟲(chóng)與TLRs的研究集中在TLR2和TLR3。在TLRs中，TLR4介導(dǎo)的MyD88依賴(lài)途徑激活NF-κB在先天免疫中也是經(jīng)典途徑之一，那么新孢子蟲(chóng)會(huì)不會(huì)上調(diào)TLR4的表達(dá)來(lái)參與先天免疫呢？TLR9能夠識(shí)別一些CpG DNA，新孢子蟲(chóng)感染會(huì)不會(huì)導(dǎo)致一些低甲基化和非甲基化的DNA或者mtDNA到胞質(zhì)中從而激活TLR9誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的炎癥反應(yīng)仍有待探討。

1.2 NLRs

Nod樣受體又稱(chēng)核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體，是一類(lèi)胞漿病原模式識(shí)別受體，主要在一些免疫細(xì)胞中表達(dá)，如吞噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞，其功能與其他模式識(shí)別受體類(lèi)似，識(shí)別病原微生物的固有成分，從而激活先天免疫中的信號(hào)通路，目前有關(guān)Nod樣受體在新孢子蟲(chóng)中的研究有限，但是Nod 2在抵抗新孢子蟲(chóng)入侵中發(fā)揮著重要作用，小鼠巨噬細(xì)胞暴露于新孢子蟲(chóng)后，檢測(cè)到Nod 2表達(dá)上調(diào)并與胞內(nèi)納蟲(chóng)泡共定位；而敲除Nod 2小鼠的MAPK通路的激活被抑制以及新孢子蟲(chóng)的荷蟲(chóng)量增加[8]。除此之外，NLRs家族具有其他模式識(shí)別受體所不具備的功能，NLRs可以充當(dāng)支架蛋白，在胞質(zhì)內(nèi)招募ASC(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD)，ASC通過(guò)與caspase-1結(jié)合組裝形成炎癥小體(inflammasome)。對(duì)于新孢子蟲(chóng)而言，NLRP3炎癥小體是研究最多的，新孢子蟲(chóng)感染的骨髓源性巨噬細(xì)胞(bone marrow-derived macrophage，BMDM)激活NLRP3炎癥小體，血清中IL-18和IFN-γ升高，增強(qiáng)Th1型反應(yīng)，限制新孢子蟲(chóng)增殖，表明NLRP3有助于新孢子蟲(chóng)的清除[9]。

1.3 CLRs

C型凝集素受體也是機(jī)體內(nèi)一類(lèi)重要的PRRs，主要在一些抗原遞呈細(xì)胞中表達(dá)，如樹(shù)突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，參與介導(dǎo)多種生物學(xué)效應(yīng)，包括識(shí)別病原微生物、激活補(bǔ)體以及吞噬作用等[10]。研究發(fā)現(xiàn)，CLRs中的Dectin-1在新孢子蟲(chóng)感染中發(fā)揮著重要作用，新孢子蟲(chóng)感染的Dectin-1-/-小鼠的神經(jīng)系統(tǒng)炎癥與蟲(chóng)體荷蟲(chóng)量均出現(xiàn)下降，且IL-12p40也出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)[11]，提示Dectin-1與新孢子蟲(chóng)的清除有關(guān)。

1.4 其他相關(guān)受體

表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)具有內(nèi)在的酪氨酸激酶活性，當(dāng)EGFR被激活后，能夠活化其內(nèi)在的酪氨酸激酶活性，磷酸化下游的信號(hào)分子，激活包括PI3K/AKT、MAPK等在內(nèi)的多種信號(hào)通路，調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖與凋亡[2]。研究發(fā)現(xiàn)，新孢子蟲(chóng)感染會(huì)激活EGFR-AKT和EGFR-MAPK信號(hào)通路，進(jìn)而介導(dǎo)宿主細(xì)胞的凋亡，清除入侵的新孢子蟲(chóng)[2]，可能與凋亡在抵抗病原微生物中的作用有關(guān)。此外，在新孢子蟲(chóng)感染的小鼠中，趨化因子受體CCR5(CC-chemokine receptor 5)被激活，并誘導(dǎo)單核細(xì)胞遷移到感染部位，而敲除CCR5小鼠的自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell，NK)和樹(shù)突狀細(xì)胞的遷移率大大下降，且死亡率增加[12]，提示在新孢子蟲(chóng)入侵的過(guò)程中，CCR5對(duì)于炎癥的控制有一定的作用。

2 新孢子蟲(chóng)感染激活宿主先天免疫

2.1 NF-κB通路

NF-κB通路是天然免疫中一條經(jīng)典的炎癥相關(guān)通路，NF-κB家族包括5個(gè)成員，Rel A(p65)、Rel B、c-Rel、NF-κB1(p50)和NF-κB2(p52)，它們可形成同源或者異源二聚體入核調(diào)控相應(yīng)的靶基因來(lái)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，尤其是在炎癥反應(yīng)中，從病原體的識(shí)別到促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生都依賴(lài)NF-κB途徑[13]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB在原蟲(chóng)感染中發(fā)揮著重要作用，新孢子蟲(chóng)感染牛巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組分析表明，新孢子蟲(chóng)感染激活了NF-κB通路，而滅活的新孢子蟲(chóng)速殖子則不能激活NF-κB通路，提示NF-κB可能在新孢子蟲(chóng)入侵過(guò)程中引起巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)。有趣的是，新孢子蟲(chóng)致密顆粒蛋白6(NcGRA6)和14-3-3重組蛋白激活了NF-κB通路，引起核內(nèi)NF-κB/p65蛋白水平的升高[14-15]。

2.2 MAPK通路

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPKs)是細(xì)胞內(nèi)的一類(lèi)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在所有的真核細(xì)胞中均有表達(dá)，主要分為細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK1/2)、Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNKs)、p38 MAPK 和ERK5 4個(gè)亞家族。當(dāng)MAPK通路激活后，可以磷酸化下游蛋白，從而調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)分化、應(yīng)激與炎癥等過(guò)程[16]。研究發(fā)現(xiàn)，MAPK通路的激活與新孢子蟲(chóng)感染宿主的免疫應(yīng)答密切相關(guān)，新孢子蟲(chóng)果糖-1,6-二磷酸酶(NcFBPase)與14-3-3重組蛋白均可以激活MAPK途徑，顯著提高p38和ERK蛋白的磷酸化水平，并且誘導(dǎo)IL-12p40和TNF-α等細(xì)胞因子的釋放[15]，通過(guò)TLRs的串?dāng)_反應(yīng)也可以活化MAPK信號(hào)通路，新孢子蟲(chóng)感染激活TLR11-Myd88依賴(lài)的MEK-ERK信號(hào)途徑，增加促炎因子的表達(dá)，減少新孢子蟲(chóng)荷蟲(chóng)量[7]。這些研究說(shuō)明，MAPK信號(hào)通路在新孢子蟲(chóng)入侵中可能發(fā)揮著正向調(diào)節(jié)作用。

2.3 其他相關(guān)信號(hào)通路

Ca2+作為機(jī)體內(nèi)重要的第二信使，是機(jī)體內(nèi)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的重要一環(huán)，可通過(guò)鈣傳感蛋白調(diào)節(jié)不同的生物學(xué)效應(yīng)，尤其是在頂復(fù)門(mén)原蟲(chóng)的入侵過(guò)程中，Ca2+調(diào)控著蟲(chóng)體的滑行運(yùn)動(dòng)和微線(xiàn)體分泌等生理過(guò)程，而CDPKs(calcium-dependent protein kinases)是機(jī)體內(nèi)的一種鈣傳感蛋白，在頂復(fù)門(mén)寄生原蟲(chóng)鈣信號(hào)的傳導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用，CDPKs介導(dǎo)的鈣離子信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)于頂復(fù)門(mén)原蟲(chóng)(如瘧原蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)等)的入侵具有重要作用[17]。目前，關(guān)于鈣依賴(lài)蛋白激酶與新孢子蟲(chóng)的作用也有研究，鈣依賴(lài)蛋白激酶抑制劑處理的感染新孢子蟲(chóng)的孕鼠中，腦中寄生蟲(chóng)荷蟲(chóng)量降低并且幼崽的生存率提高[18]，提示CDPK可能是治療與防控新孢子蟲(chóng)病的一個(gè)新的靶點(diǎn)。感染新孢子蟲(chóng)的牛單核細(xì)胞的微陣列分析發(fā)現(xiàn)，STAT被磷酸化，JAK-STAT途徑上的相關(guān)基因出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，并且新孢子蟲(chóng)ROP16蛋白也能夠直接誘導(dǎo)STAT3發(fā)生磷酸化和核移位，最終引起細(xì)胞凋亡[19]。

2.4 中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)

中性粒細(xì)胞作為一種吞噬細(xì)胞，在先天免疫中發(fā)揮著巨大作用，如吞噬清除病原體以及形成中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps，NETs)等。NETs是宿主對(duì)抗病原微生物的感染以及炎癥反應(yīng)的一種新型效應(yīng)機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，NETs在脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物中廣泛存在，它不僅可以捕獲微生物與病毒，還可捕獲一些原蟲(chóng)，如惡性瘧原蟲(chóng)(Plasmodiumfalciparum)、微小隱孢子蟲(chóng)(Cryptosporidiumparvum)等[20]。新孢子蟲(chóng)同樣可以觸發(fā)NETs，在羊中性粒細(xì)胞中檢測(cè)到新孢子蟲(chóng)速殖子與NETs的共定位，且彈性蛋白、髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、鈣離子、ERK1/2和p38 MAPK等分子或信號(hào)通路均參與新孢子蟲(chóng)誘導(dǎo)的胞外誘捕網(wǎng)的形成，捕獲新孢子蟲(chóng)速殖子[21]，作為一種捕獲病原體的效應(yīng)機(jī)制，NETs可以通過(guò)不同的信號(hào)途徑被觸發(fā)在清除新孢子蟲(chóng)中發(fā)揮一定的作用。

2.5 活性氮

一氧化氮(nitric oxide,NO)作為一種炎癥分子，在抵抗新孢子蟲(chóng)入侵中發(fā)揮著重要的作用，尤其是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和降低新孢子蟲(chóng)的荷蟲(chóng)量，新孢子蟲(chóng)感染小鼠可以誘導(dǎo)NO的產(chǎn)生，進(jìn)而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，限制新孢子蟲(chóng)在小鼠體內(nèi)的增殖，而抑制一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)的活性，則會(huì)刺激新孢子蟲(chóng)的增殖[22]，說(shuō)明依賴(lài)于NO的殺傷作用對(duì)于新孢子蟲(chóng)的增殖具有抑制作用。

3 細(xì)胞免疫應(yīng)答

T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫(cellular immunity)對(duì)于病原微生物的清除十分重要，尤其是新孢子蟲(chóng)，作為一種胞內(nèi)寄生的原蟲(chóng)，體液免疫對(duì)其作用不大，細(xì)胞免疫才是關(guān)鍵。細(xì)胞免疫一方面可通過(guò)細(xì)胞因子來(lái)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，尤其是IFN-γ，被認(rèn)為是新孢子蟲(chóng)及其他胞內(nèi)寄生原蟲(chóng)感染機(jī)體的救命分子，在抗病原微生物以及控制炎癥過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[6]，另一方面，細(xì)胞免疫可由CD8+T細(xì)胞分泌穿孔素和顆粒酶，通過(guò)死亡配體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生細(xì)胞毒性殺傷，這對(duì)于胞內(nèi)病原微生物的殺傷十分重要。但是，T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的特征是出現(xiàn)以單核巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)為主的炎癥反應(yīng)和特異性的細(xì)胞毒性，這些強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)可能導(dǎo)致母畜妊娠期間流產(chǎn)。

模式識(shí)別受體不僅在先天免疫中發(fā)揮作用，TLR2還可以通過(guò)激活Th1型免疫應(yīng)答，促進(jìn)CD4+和CD8+T細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)γ干擾素、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和IL-12分泌，限制寄生蟲(chóng)增殖[6]。此外，新孢子蟲(chóng)14-3-3蛋白可以激活Th1型免疫應(yīng)答，促進(jìn)IFN-γ的分泌，對(duì)急性新孢子蟲(chóng)感染具有一定的保護(hù)作用[23]。研究發(fā)現(xiàn)，在新孢子蟲(chóng)感染的妊娠綿羊和奶牛中，胎盤(pán)中的CD4+和CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)以及IFN-γ顯著上調(diào)表達(dá)[24]。高毒力(Nc-Spain7)和低毒力(Nc-Spain1H)的犬新孢子蟲(chóng)株均可以導(dǎo)致外周血中CD4+與CD8+T細(xì)胞的增加，但妊娠后期炎癥免疫反應(yīng)弱于早中期[25]，這可能與新孢子蟲(chóng)病由急性期轉(zhuǎn)為慢性期有關(guān)。

4 展望

隨著CRISPR-CAS9、多組學(xué)測(cè)序分析等技術(shù)的廣泛應(yīng)用，學(xué)者們?cè)絹?lái)越關(guān)注新孢子蟲(chóng)與宿主的互作機(jī)制研究。盡管目前已發(fā)現(xiàn)宿主可通過(guò)多種途徑調(diào)控先天免疫和適應(yīng)性免疫來(lái)抵抗新孢子蟲(chóng)的感染，但關(guān)于新孢子蟲(chóng)的致病機(jī)制研究仍有許多未解之謎，如新孢子蟲(chóng)如何誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡以及逃避宿主免疫的方式、新孢子蟲(chóng)速殖子和緩殖子之間相互轉(zhuǎn)換的分子基礎(chǔ)、新孢子蟲(chóng)引起孕畜流產(chǎn)的分子機(jī)制以及導(dǎo)致新生兒神經(jīng)紊亂的機(jī)制等，這些科學(xué)問(wèn)題的解決將為發(fā)掘新的防控新孢子蟲(chóng)病藥物靶標(biāo)和疫苗候選分子提供重要理論指導(dǎo)。