TUBB8 基因突變相關(guān)女性不孕的研究進展

李曈月，翁靜

女性受孕過程涉及多種細(xì)胞的多次分裂分化及精細(xì)的激素調(diào)節(jié)。我國學(xué)者已對環(huán)境、生活習(xí)慣、自身抗體、生殖系統(tǒng)疾病與女性不孕的關(guān)系進行了豐富的研究[1]，但近年研究逐漸明確基因突變是導(dǎo)致多種疾病的最根本因素，至今已發(fā)現(xiàn)多種與妊娠過程有關(guān)的基因，如透明帶1（zona pellucida 1，ZP1）、ZP2和ZP3 基因與透明帶的形成直接相關(guān)[2]，泛連接蛋白1（recombinant pannexin 1，PANX1）基因介導(dǎo)卵細(xì)胞死亡[3]，WEE2 與受精有關(guān)[4]等。王磊團隊于2016 年明確了β-微管蛋白8（tubulin beta eight class Ⅷ，TUBB8）基因與女性不孕的關(guān)系[5]。之后相關(guān)研究不斷推進，至今有幾十篇關(guān)于TUBB8 基因突變可能會導(dǎo)致女性不孕的文獻(xiàn)報道。以往女性非生殖器官異常的不孕被認(rèn)為是由生活方式或身體調(diào)節(jié)不宜而導(dǎo)致的，而基因突變與女性不孕的關(guān)系的明確使不孕相關(guān)研究的方向更加精確，可以更好地指導(dǎo)不孕的治療。

1 TUBB8 的概述

TUBB8 是靈長類動物中一種特有的TUBB。TUBB 與α-微管蛋白（tubulin alpha，TUBA）的異二聚體動態(tài)組裝成微管，為細(xì)長、中空的圓柱管狀結(jié)構(gòu)，是真核細(xì)胞骨架的關(guān)鍵元件，參與支撐細(xì)胞、紡錘體與染色體運動等多種正常生理活動。

現(xiàn)已知人類有8 種TUBA 和9 種TUBB 基因亞型，主要通過蛋白羧基尾部的不同來區(qū)分[6]。9 種TUBB 基因亞型分別為TUBB（TUBB5）、TUBB1、TUBB2A、TUBB2B、TUBB3、TUBB4A、TUBB4B、TUBB6和TUBB8。不同微管蛋白亞型的表達(dá)存在時間和空間的差異[7]。微管蛋白基因亞型及微管的結(jié)構(gòu)在進化過程中高度保守，在維持細(xì)胞形態(tài)、胞內(nèi)物質(zhì)運輸和信號傳導(dǎo)過程中均有重要作用[8-9]。若編碼微管蛋白的基因有大量、多種的突變，則有些突變會導(dǎo)致一系列破壞性的發(fā)育障礙，統(tǒng)稱為小管?。╰ubulinopathies），其中已知TUBB1、TUBB2A、TUBB2B、TUBB3、TUBB4A和TUBB4B 在神經(jīng)元中高表達(dá)，其單個或多個點突變可以涉及神經(jīng)元缺陷及神經(jīng)類疾病[10-11]。

編碼TUBB8 的基因的功能直到2016 年才開始明確，有研究顯示卵母細(xì)胞TUBB8 突變可導(dǎo)致微管和運動蛋白無法正確組裝或形成分裂兩極，使得紡錘體組裝與染色體動力學(xué)異常，直接影響卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂過程[12]。目前普遍觀點認(rèn)為，女性青春期后，成熟卵泡開始進行減數(shù)分裂，發(fā)育為成熟卵母細(xì)胞，這一過程中會發(fā)生一系列形態(tài)學(xué)和分子事件，包括生發(fā)泡破裂、減數(shù)分裂紡錘體組裝、卵母細(xì)胞排出第一極體的不對稱分裂等，均需要由正確的微管結(jié)構(gòu)輔助完成。基因突變可能導(dǎo)致微管的行為缺陷，使得卵母細(xì)胞成熟停滯，受精或早期胚胎發(fā)育失敗[13]。

2016 年王磊團隊的研究報道中將攜帶TUBB8突變的卵母細(xì)胞主要分為3 類：紡錘體受損的第一次減數(shù)分裂中期（MⅠ）卵母細(xì)胞（p.S176L、p.T238M和p.V255M 等）；功能異常但具有明顯紡錘體特征的MⅠ卵母細(xì)胞（p.T143Dfs*12 和p.E27A33del 等）；形態(tài)為第二次減數(shù)分裂中期卵母細(xì)胞（MⅡ），但缺乏可識別的紡錘體，或含有受損的紡錘體（p.I210V、p.T238M 和p.N348S 等），一些形態(tài)上可識別為MⅡ但紡錘體受損的卵母細(xì)胞可以受精和分裂，但這些胚胎在后來的發(fā)育過程中受阻[5]。因此，TUBB8 若發(fā)生非良性突變則可能會影響α/β-微管蛋白異二聚體的折疊和組裝途徑，改變微管動力學(xué)，進而破壞微管在人卵母細(xì)胞中的表達(dá)，影響微管的正常功能。

后續(xù)研究主要通過家譜調(diào)查聯(lián)合基因測序及變異篩選的方法，研究突變的位點及遺傳方式；通過光鏡和偏光顯微鏡檢查卵母細(xì)胞是否排出第一極體及形成紡錘體；通過免疫熒光染色查看紡錘體的完整情況。通過以上方法擴展突變基因庫、推理出致病機制。

另有研究報道將TUBB8 的突變引入TUBB5中，研究異常微管表型范圍；根據(jù)卵母細(xì)胞發(fā)育過程中mRNA 清除的動態(tài)變化認(rèn)為人類的M-衰變不會受到TUBB8 突變引起的減數(shù)分裂缺陷的損害[14]；用野生型或突變型的TUBB8 互補RNA（complementary RNA，cRNA）處理小鼠卵母細(xì)胞，研究野生型TUBB8 cRNA 的額外表達(dá)是否可以改善體外和體內(nèi)胚胎發(fā)育[15]，對理論走向臨床有重要的指導(dǎo)意義。

2 TUBB8 突變及對生殖的影響

2.1 TUBB8 突變

2.1.1 外顯子及結(jié)構(gòu)域改變TUBB8 含有4 個外顯子（見圖1），核酸改變會發(fā)生于不同的外顯子區(qū)域。2020 年有學(xué)者對TUBB8 已發(fā)現(xiàn)的所有突變進行統(tǒng)計，其中80%為外顯子4 突變，8%為外顯子1突變，6%為外顯子2 突變，6%為外顯子3 突變[16]。

TUBB8 蛋白有2 個重要功能區(qū)域（見圖1），分別是GTP 酶結(jié)構(gòu)域和微管蛋白羧基端結(jié)構(gòu)域（tubulin C-terminal domain）。其中47%的突變是在GTP 酶結(jié)構(gòu)域，30%突變是在微管蛋白C 端結(jié)構(gòu)域，在這2 個重要功能區(qū)域突變的比例很高，因此大部分突變會引起重大的功能缺陷；3%突變位于GTP 酶結(jié)構(gòu)域前，10%突變位于兩結(jié)構(gòu)域間，10%突變位于C 端結(jié)構(gòu)域后，雖然這3 個位置突變比例較小，但因為這些位置有重要的介導(dǎo)調(diào)控作用，所以突變也會導(dǎo)致疾病[16]。

圖1 TUBB8 結(jié)構(gòu)示意圖[17]

2.1.2 基因突變TUBB8 區(qū)域核酸改變，微觀上看突變可能發(fā)生于不同的外顯子或功能區(qū)，但宏觀上講，TUBB8 基因突變可以分為錯義突變、無義突變、移碼突變和同義突變等。錯義突變發(fā)生最多，其中又包括雜合錯義突變、純合錯義突變和復(fù)合雜合錯義突變。這些突變的來源主要可以分為兩類，一類是家庭遺傳，另一類是自身突變。

雜合錯義突變是指子代含有突變和未突變的一對等位基因，子代為患者，則此種突變常屬于顯性遺傳，突變基因有顯性負(fù)效應(yīng)，因為患者母親可正常受孕，故突變基因常來自于父方（見圖2A），此種突變?yōu)樽畛Ｒ姷耐蛔冃问?，在至今?016 至今）的突變個次中占30%[16]。

純合錯義突變指子代含有2 個相同的突變基因，若突變由家庭遺傳而來，則父母均含有相同突變基因，為隱性遺傳（見圖2B），且此種突變很可能有單倍體劑量不足效應(yīng)，在父母身上不顯示出疾病，比如具有純合p.P70L（c.C209T）和p.C12Y（c.G35A）突變的患者父母具有雜合錯義突變，這表明雜合p.P70L 和p.C12Y 突變不影響女性生育能力。即意味著這2 個突變是單倍體劑量不足效應(yīng)，而不是顯性負(fù)效應(yīng)。p.A54V（c.C161T）和p.E108K（c.G322 A）突變有單倍劑量不足效應(yīng)[17-18]。而此種突變需要父母雙方含有相同的突變基因，實際概率較小，1 個或2 個基因的自身突變是此種突變的常見原因。

復(fù)合雜合錯義突變，指父母各含有1 個不同的突變基因，子代患者基因上有2 個突變位點，子代在受孕過程中可能受到多重影響（見圖2C），如2019年報道的1 例患者含有p.E108K（c.G322A）和p.T143Dfs*12（c.426dupG）突變就為復(fù)合雜合突變[19]。除了遺傳獲得的突變基因，有20%患者的突變基因是自身全新突變而來，具有顯性負(fù)效應(yīng)[20-21]。

圖2 TUBB8 突變類型及遺傳方式示意圖

另外，還有移碼插入、移碼缺失、片段缺失和全基因缺失等突變，但這些缺失突變約占所有突變個次的10%；還有個別突變不會產(chǎn)生氨基變化，個體不孕可能是受其他基因的影響[22]。

2.2 TUBB8 基因突變的后果

2.2.1 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變DNA 的突變可導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄的氨基酸變化，如果該變化出現(xiàn)在微管蛋白結(jié)構(gòu)或功能形成的重要部位，就會改變TUBB 折疊、異二聚體組裝以及與驅(qū)動蛋白和其他微管相關(guān)蛋白的相互作用，進而影響紡錘體的組裝及減數(shù)分裂，導(dǎo)致卵母細(xì)胞成熟異常。

TUBB8 突變患者具有p.E108K（c.G322A）突變，谷氨酸變化為賴氨酸，谷氨酸在此位置高度保守，賴氨酸被谷氨酸取代，可以影響TUBA 與TUBB 結(jié)合，破壞TUBA/TUBB 的相互作用。p.N347K（c.C1041A）突變患者的第347 天冬氨酸被賴氨酸取代，導(dǎo)致微管蛋白結(jié)構(gòu)異常[22]。2017 年發(fā)現(xiàn)的一系列突變體中有7 個（p.R2、p.M330、p.I4L、p.V353、p.P70、p.E205和p.C12）位于TUBB 亞單位內(nèi)。它們的突變可能影響折疊/蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，或者在某些情況下影響核苷酸結(jié)合（p.C12Y、p.P70L 和p.E205K）[18]。另外2 個受影響的殘基p.E194 和p.M415 位于微管表面，可能與微管相關(guān)蛋白相互作用，從而干擾調(diào)節(jié)和穩(wěn)定性。而在位點c.G1054T 的突變患者蛋白（p.A352S）中的氨基酸從疏水性丙氨酸殘基轉(zhuǎn)變?yōu)橛H水性絲氨酸殘基，而p.A352S 位于先前發(fā)現(xiàn)的雜合錯義突變p.V353I 旁，p.A352 和p.V353 位于TUBB 結(jié)構(gòu)中，這些氨基酸的突變可以影響TUBB 的折疊或穩(wěn)定性，從而通過顯性負(fù)效應(yīng)影響微管行為和紡錘體組裝，導(dǎo)致微管形態(tài)異常[23]。而有些突變位點會導(dǎo)致TUBB8 表達(dá)量顯著下降[24]。這些發(fā)現(xiàn)均提示位置相近或所處功能結(jié)構(gòu)相同的氨基酸變異可能會導(dǎo)致相似的不良影響，可以作為基因突變影響預(yù)測的部分依據(jù)。

2.2.2 對生殖階段的影響目前已發(fā)現(xiàn)TUBB8 突變可對整個受孕過程的不同環(huán)節(jié)產(chǎn)生不良影響。主要包括以下7 種：①卵母細(xì)胞在未成熟階段完全停滯，特別是在MⅠ期（p.P358L、p.F367L、p.M403Hfs*3等）；②卵母細(xì)胞成熟不完全，極體較大[25]；③可以獲得成熟卵母細(xì)胞，但受精失?。╬.E108K、p.Q424*、p.I4L 等）；④異常受精，多精子受精或卵母細(xì)胞減數(shù)分裂失敗，產(chǎn)生多原核（multiple pronuclear，p.V175A、p.I4L、p.V349I 等）[26-27]；⑤成熟卵母細(xì)胞可受精，但受精卵不能發(fā)生卵裂（p.V255M、p.P61T、p.V353I 等）；⑥成熟卵母細(xì)胞可受精，受精卵可發(fā)生卵裂，但很快出現(xiàn)異常（p.F200L、p.R391C、p.Q334E 等）；⑦有著床潛能的正常胚泡，但著床后不能繼續(xù)發(fā)育（p.D295H、p.D417Y、p.V353I 等）[19]。

值得注意的是，一種突變可能導(dǎo)致多方面的不良影響，說明TUBB8 突變對整個妊娠過程有著重要作用；相同位點突變也可能導(dǎo)致不同的影響，說明除了TUBB8 可能還有其他基因影響卵母細(xì)胞成熟及受精過程。目前TUBB8 突變對受孕過程的不同環(huán)節(jié)的影響機制尚未明確。

3 TUBB8 基因突變研究的臨床應(yīng)用

3.1 疾病診斷及病因探究研究表明，不孕患者中有30%以上的患者TUBB8 發(fā)生突變，而正常受孕者突變概率極低。因此，TUBB8 突變可以作為卵母細(xì)胞成熟停滯的不孕婦女病因的首要因素[19]，且可對患者卵母細(xì)胞質(zhì)量進行臨床預(yù)測[12]。

3.2 對輔助生殖技術(shù)的幫助因為TUBB8 突變也顯示出較強的遺傳性。因此在施行輔助生殖技術(shù)前可對配偶雙方該基因突變情況進行檢測，并盡量在胚胎的篩選中選擇無突變的優(yōu)質(zhì)胚胎植入母體，以避免遺傳性基因突變遺傳給后代的情況。

人工卵母細(xì)胞激活技術(shù)（artificial oocyte activation，AOA）可以適度提高Ca2+濃度以促進紡錘體微管的分解，并通過機制調(diào)節(jié)染色體移向紡錘體極點[28]，使卵細(xì)胞質(zhì)內(nèi)單精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）失敗的患者獲得臨床妊娠[29]。因此，因TUBB8 突變而不孕的個體可以考慮AOA 技術(shù)的輔助。

3.3 改善不孕癥有研究表明，在表達(dá)突變體TUBB8 的小鼠卵母細(xì)胞中額外表達(dá)野生型TUBB8 cRNA，可以成功地挽救胚胎發(fā)育缺陷，生產(chǎn)足月子代[5]。但該方面的應(yīng)用現(xiàn)階段仍處于理論和實驗階段，向TUBB8 突變且發(fā)生成熟停滯的卵母細(xì)胞中介入正常蛋白質(zhì)是否可以改善其停滯狀況仍需要更多符合倫理學(xué)規(guī)定的實驗進一步探討。

4 結(jié)語和展望

目前已發(fā)現(xiàn)TUBB8 多種突變形式及百余個突變位點；涉及7 種導(dǎo)致不孕的機制，包括MⅠ期停滯、不能受精、異常受精、合子不能分裂、早期胚胎停滯和著床后未能繼續(xù)發(fā)育。TUBB8 在女性生殖中的重要作用已經(jīng)明確，但目前對于TUBB8 的研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足。首先，大量不孕患者TUBB8 位點沒有突變，表明人類卵母細(xì)胞成熟停滯可能是由其他基因缺陷引起的，也可能是由多種基因突變共同作用所致，但這些基因仍未被發(fā)現(xiàn)。其次，幾乎所有報道均只針對TUBB8 的編碼區(qū)甚至外顯子區(qū)域，并未研究內(nèi)含子區(qū)域以及非編碼區(qū)的突變情況對卵母細(xì)胞成熟的影響。再次，對于已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的諸多不孕相關(guān)基因，這些基因的相互聯(lián)系作用機制也尚未清晰建立。最后，不孕的TUBB8 突變患者病例報道較少，突變位點也常各不相同，很難對某一種突變的影響有靶向的深入研究，需要更多動物實驗的補充。

由于TUBB8 基因是靈長類動物特有的基因，若應(yīng)用鼠類作為實驗動物則需要采取復(fù)雜的注入TUBB8 cRNA 等方式，且小鼠和人類之間在生殖方面存在巨大的形態(tài)和遺傳差異，為解決這些問題，近期有研究提出了干細(xì)胞衍生模型可以成為代替人類胚胎的模型系統(tǒng)，可為人類早期發(fā)育提供最有用的見解[30]。隨著用于產(chǎn)生干細(xì)胞衍生的胚胎樣結(jié)構(gòu)的技術(shù)的改進，這些生物結(jié)構(gòu)將更接近地模仿人類胚胎，并可以大量獲得，但隨之也會產(chǎn)生胚胎倫理問題需要學(xué)者們的思考和約束。