甲狀腺素轉運蛋白對卵巢癌細胞株的影響及機制研究

李婧，劉昀昀，周暉，林仲秋，盧淮武

卵巢癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，也是死亡率最高的婦科惡性腫瘤。在世界范圍內，每年約有225 500 例新診斷的卵巢癌患者，而其中因卵巢癌死亡的患者高達140 200 例[1]。種植轉移是卵巢癌最常見的轉移方式，也是影響卵巢癌手術徹底性和預后的重要因素，研究種植性轉移的發(fā)生機制可能有助于改善卵巢癌的治療效果。甲狀腺素轉運蛋白（transthyretin，TTR）又稱前白蛋白（prealbumin，PA），是一種由127 個氨基酸組成的四聚體蛋白質，其主要作用是作為轉運甲狀腺素及視黃醇的載體蛋白。有研究發(fā)現，TTR 的異常表達與諸多疾病有關，如多發(fā)性神經性損害[2]和阿爾茨海默病[3]等。還有研究發(fā)現，TTR 可在卵巢癌[4]、結直腸癌[5]、胰腺癌[6]、肝癌[7]、胃癌[8]和腎癌[9]等腫瘤中作為有效的腫瘤標志物。但關于其在腫瘤中的作用及其機制鮮有研究，本研究旨在探討TTR 在卵巢癌細胞中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 研究試劑RPMI-1640（HyClone 公司）和胎牛血清（fatal bovine serun，FBS，BI 公司）；青霉素和鏈霉素（Themo 公司）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒、山羊抗兔IgG 抗體、RIPA 裂解液（上海碧云天生物技術有限公司）；Lipofectamine 2000（Invitrogen 公司）；ECL 發(fā)光液（Millipore 公司）；聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF，Millipore 公司）；Transwell小室（Corning 公司）；基質膠（BD 公司）；TTR、Wnt1、β 連環(huán)素（β-catenin）、基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP-2）、MMP-9、β-actin 抗體（Cell Signaling Technology 公司）；TTR 小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）和non-target siRNA（蘇州吉瑪基因股份有限公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)與轉染SKOV-3 及OVCAR-3 細胞株購自中國科學院上海細胞庫，在含100 U/mL 青霉素和100 U/mL 鏈霉素及10%FBS 的RPMI-1640 中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱設置成37 ℃和5%CO2。根據參考文獻[10]設計TTR siRNA，陰性對照組采用國際通用與所有基因均無同源性序列的non-target siRNA。按說明書方法，用Lipofectamine 2000TM脂質體法搭載TTR siRNA 及non-target siRNA 入細胞中，24 h 后提取RNA 或者進行后續(xù)功能實驗。

1.3 細胞遷移實驗將約2.5×105個轉染后細胞接種于6 孔板，各小孔被單層細胞鋪滿后進行劃痕，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗3 遍，加入無血清培養(yǎng)基，放入細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，0、24 h 后拍照，使用ImageJ 軟件計算劃痕面積及傷口愈合率。每個實驗重復3 次。

1.4 細胞侵襲實驗Transwell 小室上室加入濃度為1 μg/μL基質膠100 μL，細胞培養(yǎng)箱孵育約4 h。上室加入約5×104個轉染后細胞和無血清培養(yǎng)基，將600 μL 含10%胎牛血清的培養(yǎng)基加入下室，于細胞培養(yǎng)箱孵育24 h。PBS 清洗3 遍后置入4%多聚甲醛中固定15 min，后置入0.1%結晶紫染料中15 min，PBS 再次沖洗3 遍，用棉簽抹去上室細胞，于顯微鏡觀察拍照，重復3 次。

1.5 蛋白質印跡法（Westernblotting）檢測蛋白表達 用RIPA 裂解液提取轉染48 h 后細胞的總蛋白，SDS-PAGE 電泳行蛋白分離，用濕轉法將蛋白轉至PVDF 膜。5%脫脂奶粉搖床孵育1 h，分別加入一抗TTR（1∶1 000）、Wnt1（1∶1 000）、β-catenin（1∶1 000）、MMP-2、MMP-9（1∶1 000）和β-actin（1∶2 000）。4 ℃搖床過夜，TBST 清洗后加入二抗（1∶2 000），于常溫搖床孵育1 h，加入ECL 化學發(fā)光試劑于凝膠成像系統(tǒng)中拍照，采用ImageJ 軟件分析各實驗組細胞蛋白條帶灰度值，計算目的蛋白相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學方法采用SPSS 21.0 軟件及GraphPad Prism 軟件對研究數據進行統(tǒng)計分析。定量資料采用Kolmogorov-Smirnov 檢驗對其進行正態(tài)性檢驗，定量資料采用均數±標準差（）表示，組間比較采用兩獨立樣本均數的t 檢驗。所有檢驗均以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 下調TTR表達對卵巢癌細胞遷移能力的影響TTR siRNA 組和對照組SKOV-3 細胞傷口愈合率分別為（57.00±5.03）%和（87.33±1.20）%，差異有統(tǒng)計學意義（t=5.862，P=0.004）。見圖1。TTR siRNA 組和對照組OVCAR-3 細胞傷口愈合率分別為（64.67±5.55）%和（84.33±1.45）%，差異也有統(tǒng)計學意義（t=3.429，P=0.027）。見圖2。

圖1 SKOV-3 細胞株轉染TTR siRNA 及non-target siRNA 序列后劃痕實驗結果

圖2 OVCAR-3 細胞株轉染TTR siRNA 或non-target siRNA 序列后劃痕實驗結果

2.2 下調TTR表達對卵巢癌細胞侵襲能力的影響TTR siRNA 組SKOV-3 及OVCAR-3 細胞侵襲能力較對照組減弱，TTR siRNA 組小室穿透的細胞數分別是對照組的（61.00±4.16）%（P=0.013）及（46.33±8.37）%（P=0.003），差異均有統(tǒng)計學意義。見圖3。

圖3 轉染TTR siRNA 后對細胞侵襲的影響

2.3 下調TTR在卵巢癌細胞中的作用機制研究Western blotting 實驗結果顯示，在卵巢癌SKOV-3及OVCAR-3 細胞，TTR siRNA 組TTR、Wnt1、βcatenin、MMP-2 和MMP-9 表達都低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（SKOV-3 細胞，P 分別為0.002、0.000、0.010、0.000 和0.003；OVCAR-3 細胞，P 分別為0.003、0.000、0.000、0.000 和0.000）。見圖4。

圖4 SKOV-3 及OVCAR-3 細胞轉染TTR siRNA 或non-target siRNA 序列后Western blotting 實驗結果

3 討論

既往關于TTR 的研究，多與營養(yǎng)狀態(tài)評估、腫瘤標志物等相關，而關于TTR 在腫瘤中的生物學行為及其作用機制的研究較少。有研究表明，siRNA 沉默TTR 基因后，對前列腺癌細胞的生長、侵襲具有明顯的抑制作用，同時可誘導細胞的凋亡，且與重要癌基因信號通路c-Myc 相關[10]。還有研究顯示，TTR能促進小鼠胎盤滋養(yǎng)細胞的遷移和侵襲，并且在高血壓小鼠中上調TTR 表達后，MMP-2/9 的表達增高，認為TTR 可作為子癇前期的診斷標志物[11]。Lee等[12]的研究顯示，TTR 是Stat3 下游分子，在肺癌中高表達，可能通過活化蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（protein kinase B/mammalian target of rapamycin，Akt/mTOR）和核因子κB（nuclear factorκB，NF-κB）通路促進肺癌細胞增殖、遷移和侵襲。

本研究顯示，2 種卵巢癌細胞轉染TTR siRNA后，TTR 蛋白表達相對于對照組表達下降，表明TTR siRNA 可高效沉默TTR 在卵巢癌細胞中的表達。抑制TTR 的表達后，卵巢癌細胞的遷移、侵襲能力顯著下降，說明TTR 可能是促進卵巢癌遷移、侵襲過程中重要的分子。這與以上相關研究結論一致。

本研究還發(fā)現，抑制TTR 的表達后，Wnt1、βcatenin 表達下降，說明抑制TTR 可能抑制了Wnt1/β-catenin 通路激活。Wnt1 蛋白是一種分泌信號蛋白，主要受體為Frizzled 家族和協同受體低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6（low density lipoprotein receptorrelated protein 5/6，LRP5/6）[12]。當Wnt1 蛋白與細胞膜上的受體結合后進入細胞質，抑制糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）、1 型酪蛋白激酶（casein kinase1，CK1）的活性，從而使βcatenin 不能被磷酸化，β-catenin 在細胞質內大量積累并遷移到細胞核內，與T 細胞因子/淋巴增強因子（T-cell factor/lymphoid enhancing factor，Tcf/Lef）等轉錄因子相結合，促進c-Myc 等基因轉錄，從而促進腫瘤發(fā)生[13]。既往研究表明，Wnt/β-catenin 信號通路在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著關鍵作用[14]。本研究發(fā)現下調TTR 后，可能抑制Wnt1/β-catenin 通路，從而影響卵巢癌細胞的生物學功能。MMPs 是結構相關的鋅依賴性內切肽酶家族，MMPs 通過破壞腫瘤細胞周圍物理屏障、重塑細胞間黏附力等方式促進腫瘤細胞的侵襲生長[15]，MMP-2 和MMP-9 是MMPs家族的關鍵分子，在癌癥的侵襲和轉移中發(fā)揮重要作用[16]。本研究還顯示，抑制TTR 后，MMP-2、MMP-9表達水平降低，說明TTR 可能是通過抑制MMP-2、MMP-9 來抑制卵巢癌細胞的侵襲和遷移。MMP-2和MMP-9 皆為Wnt1/β-catenin 下游重要分子，研究發(fā)現，β-catenin 可通過調節(jié)MMP-2 的表達影響卵巢癌細胞的遷移和侵襲[17]。另有研究表明，沉默βcatenin 能明顯抑制子宮內膜組織MMP-9 的表達[18]。因此，TTR 可能通過抑制Wnt1/β-catenin 通路關鍵蛋白的表達，使MMP-2、MMP-9 表達水平降低，從而抑制卵巢癌細胞的遷移和侵襲。本研究表明TTR 能夠抑制卵巢癌細胞侵襲和遷移，可能的作用機制為抑制Wnt1/β-catenin 通路關鍵分子的表達，然而其具體的相關機制仍需進一步研究。調節(jié)Wnt1/β-catenin通路活性是目前治療癌癥的重要潛在手段，未來靶向TTR/Wnt1/β-catenin 可能會成為治療卵巢癌的新策略。