153份四川小麥主推品種和后備品系抗病基因的分子檢測

張 華，任 勇，何員江，鄭首航，吳 舸，鄒鳳亮，雷加容，杜小英，陶 軍，歐俊梅

(綿陽市農業(yè)科學研究院/國家小麥改良綿陽分中心/廳市共建作物特色資源創(chuàng)制及應用四川省重點實驗室，四川綿陽 621023)

小麥條銹病、白粉病、赤霉病是分別由小麥條銹菌(f.sp.)、白粉菌(f.sp.)、亞洲鐮刀菌()和禾谷鐮刀菌()引起的三大真菌性病害，對我國的小麥生產造成嚴重影響，是濕潤多雨的四川麥區(qū)最主要的小麥病害。其中，條銹病和白粉病主要危害部位為小麥葉片，而赤霉病主要危害小麥穗部，相較于前兩種病害，赤霉病不僅會降低小麥的產量，同時病粒上所攜帶的赤霉毒素對人體還存在安全隱患。種植多抗性品種并合理布局是防治小麥病害最經濟、安全、有效的方法。因此，培育兼抗條銹病、白粉病和赤霉病的品種是四川小麥多抗性育種的主要目標。

病原菌新小種的不斷出現(xiàn)使許多小麥品種在生產過程中喪失抗性。為尋找優(yōu)質抗源，培育持久多抗品種，減輕小麥病原菌流行優(yōu)勢小種對我國小麥生產的危害，眾多學者對我國重要小麥核心種質材料進行了抗病性鑒定和基因挖掘。目前，國際上已正式命名了83個抗條銹病基因(～)、80多個主效抗白粉病基因(～、等)以及7個抗赤霉病基因(～)，許多未正式命名的抗病基因正在陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)和利用。在我國小麥育種領域，基于對小麥抗性基因的發(fā)掘和利用，培育出了一批持久抗性新品種并得到大面積推廣應用，為減少病害造成的損失以及保障國家糧食安全做出了重要貢獻。

明確小麥品種的抗病性和抗病基因是實現(xiàn)小麥品種合理布局、優(yōu)化小麥生產結構的關鍵環(huán)節(jié)和重要前提。長期以來，四川小麥抗病育種成效顯著，抗病小麥品種的推廣和種植，在一定程度上降低了當?shù)剞r民的生產成本，提高了小麥的產量和效益。但是，隨著環(huán)境的變化和小麥病原菌的變異，一些抗病品種的抗病性逐漸降低甚至完全喪失，一些新品種有效種植年限逐漸縮短，病害流行的風險逐漸增加。當前，小麥條銹病、白粉病和赤霉病仍然是威脅四川小麥生產的三大主要病害，但四川麥區(qū)主要推廣品種和后備品系的整體抗性水平和主要抗病基因還不清楚。因此，本研究通過對近幾年153份主要推廣品種和后備品系的條銹病成株期抗性進行鑒定，同時對抗條銹病基因(、、、、和)、抗赤霉病基因()和抗白粉病基因()進行檢測，以期明確不同品種的抗條銹性以及抗條銹病、赤霉病和白粉病基因的分布，為抗源的合理利用和多抗小麥品種的培育推廣提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

153份供試小麥材料、感條銹病對照品種Avocet S、感赤霉病對照品種矮抗58以及含有已知抗赤霉病基因的品種蘇麥3號由四川省綿陽市農業(yè)科學研究院小麥所提供，含有已知抗條銹病基因的品系(Avocet S*6/、Avocet S*6/、Avocet S*6/、Avocet S*6/、 Avocet S*6/、Avocet S*6/)、含有已知抗白粉病基因的品種南農9918，以及感白粉病對照品種Chancellor由中國農科院植物保護研究所麥類真菌病害課題組提供。

條銹菌流行混合小種(以CYR32、CYR34為主)由甘肅省農科院植物保護研究所提供。

1.2 成株期抗條銹性鑒定

成株期抗性鑒定分別于2018-2019和 2019-2020年度在綿陽市農業(yè)科學研究院科研基地完成。每個品種種植2行，行長1 m，行距 0.28 m，垂直于多行品種種植一行感病對照SY95-71作為誘發(fā)行，于每年的1月20日至30日，小麥進入拔節(jié)期時，將條銹菌新鮮的夏孢子和 0.05%吐溫20水溶液按照一定的比例(夏孢子1 g·1 000 mL)配制孢子懸浮液，然后均勻噴撒在誘發(fā)行小麥葉片上，晾干后，覆蓋薄膜保濕過夜，第2天清晨揭膜，觀察田間土壤濕度并適當灌水，保持田間濕度利于病菌進行再侵染，于當年3月下旬至4月上旬，待感病對照品種Avocet S充分發(fā)病時，調查病害的普遍率、嚴重度和侵染型，每隔7 d調查1次，共調查2～3次，以最高侵染型作為病情發(fā)病的級數(shù)，抗條銹病鑒定的方法與分級標準參考小麥抗條銹病評價技術規(guī)范。

1.3 抗病基因的分子檢測

葉片DNA的提取和分子標記檢測試驗于2018年12月至2019年1月在中國農業(yè)科學院植物保護研究所麥類病害課題組實驗室完成。分別取153份小麥材料的5～6粒種子，播種在溫室育苗盤中，待小麥長至2～3片葉的幼苗時，采用CTAB法提取小麥幼苗葉片的DNA，備用。檢測抗條銹病(、、、、、)、白粉病()和赤霉病()基因所用的的分子標記引物(表1)均由上海生工生物工程有限公司合成。PCR檢測采用25 μL體系，包括EasyTapPCR SuperMix 12.5 μL，上、下游引物(100 ng·μL)各1 μL，模板DNA 1 μL，ddHO 9.5 μL。各基因的PCR擴增程序按照、、、、、、、相應參考文獻進行。PCR產物均用2.0%的瓊脂糖凝膠進行檢測，并在WSE-5200一體式凝膠成像系統(tǒng)上觀察并保存圖像。

表1 用于檢測小麥抗病基因的引物Table 1 Primes for the detection of resistant genes

2 結果與分析

2.1 成株期條銹病抗性鑒定結果

由表2可知，2018-2019年度，153份供試材料中，成株期對條銹菌表現(xiàn)為中抗及以上的材料有137份，占供試材料的89.5%，其中，川麥93、川麥602、川育34等117份材料對條銹菌表現(xiàn)為高抗，占供試材料的76.5%；對條銹病表現(xiàn)為感病的材料有10份，占供試材料的6.5%，其中，綿麥54、綿麥367、綿雜麥1101等7份材料表現(xiàn)為中感，博麥1531、綿雜麥1302和蜀麥1751共3份材料表現(xiàn)為高感。2019-2020年度，成株期對條銹菌表現(xiàn)為中抗及以上的材料有122份，占供試材料的79.7%；對條銹菌表現(xiàn)為感病的材料有25份，占供試材料的16.3%，其中，川育26、川育35、科城麥9號等9份材料表現(xiàn)為中感，綿麥51、綿麥54、綿麥367等17份材料表現(xiàn)為高感。兩年度對條銹菌均表現(xiàn)為中抗及以上的材料有122份，占供試材料的79.7%，表明四川小麥品種對條銹病的抗性總體較好。其中，綿麥827、綿麥903、綿麥907等107份材料在兩年度均表現(xiàn)為高抗，表明這些品種的條銹病抗性較穩(wěn)定，可以在生產上繼續(xù)推廣種植，也可以作為小麥抗病育種的重要親本。

表2 153份小麥品種成株期抗條銹病的鑒定結果和抗病基因的檢測結果Table 2 Identification of resistance to strip rust at adult stage and detection of resistance gene in 153 wheat varieties(lines)

(續(xù)表2 Continued table 2)

(續(xù)表2 Continued table 2)

(續(xù)表2 Continued table 2)

2.2 抗條銹病基因 Yr5、 Yr9、 Yr10、 Yr15、 Yr18和 Yr26的分子檢測結果

利用感病材料Avocet S為陰性對照，對供試材料的抗條銹病基因、、、、和進行檢測。結果(表2)發(fā)現(xiàn)，利用Avocet S*6/為陽性對照，發(fā)現(xiàn)川麥87、綿麥161、綿麥319等12份材料可以擴增出100 bp的條帶，說明這些材料可能攜帶；利用Avocet S*6/為陽性對照，發(fā)現(xiàn)川育30、綿麥1403、綿麥54等25份材料可以擴增出1 500 bp的條帶，說明這些材料可能攜帶；利用Avocet S*6/為陽性對照，發(fā)現(xiàn)南麥391、玉麥2號、川育34等77份材料可以擴增出543 bp的條帶，說明這些材料可能攜帶；利用Avocet S*6/為陽性對照，發(fā)現(xiàn)川麥83、川農38、綿麥903等12份材料可以擴增出190 bp的條帶，說明這些材料可能攜帶；利用Avocet S*6/為陽性對照，發(fā)現(xiàn)綿麥56、川麥1063、川育34等4份材料可以擴增出150 bp的條帶，說明這些材料可能攜帶；利用Avocet S*6/為陽性對照，發(fā)現(xiàn)6007、綿麥51、綿麥58等90份材料可以擴增出500 bp的條帶，說明這些材料可能攜帶。對供試的153份小麥材料進行分子標記檢測結果表明，可能攜帶、、、、和的小麥材料分別占供試材料的7.8%、16.3%、50.3%、7.8%、 2.6%和58.8%。

2.3 抗白粉病基因 Pm21的分子檢測結果

利用Chancellor為陰性對照、南農9918為陽性對照，用引物SCAR1265對供試材料的抗白粉病基因進行檢測，結果(表2)發(fā)現(xiàn)，川育30、川麥93、綿麥51等40份材料可以擴增出1 265 bp的條帶，說明這些材料可能攜帶，占供試材料的26.1%。

2.4 抗赤霉病基因 Fhb1的分子檢測結果

利用矮抗58為陰性對照、蘇麥3號為陽性對照，對供試材料的抗赤霉病基因進行檢測，結果(表2)發(fā)現(xiàn)，川麥607、川麥608、綿麥5695等12份材料可以擴增出122 bp的條帶，說明這些材料可能攜帶，占供試材料的7.8%。表明四川小麥品種的赤霉病抗性水平不高，需要加快抗赤霉病育種步伐。

M：DL2000；1：ddH2O；2：Avocet S；3：Avocet S*6/ Yr9；4：川育30；5：綿麥1403；6：綿麥54；7：川麥86；8：川麥97；9：西科麥26；10：川育25；11：渝麥17；12：川育26；13：博麥1531；14：川麥611；15：川農38；16：蜀麥1742；17：蜀麥1763。

M：DL2000；1：ddH2O；2：Avocet S；3：Avocet S*6/ Yr10；4：南麥931；5：蜀麥 126；6：川育29；7：川農36；8：綿麥54；9：內麥141；10：蜀麥1605；11：中科麥13；12：川農33；13：玉麥2號；14：蜀麥1610；15：川農37；16：川育34；17：川輻18。

M：DL2000；1：ddH2O；2： Chancellor；3：南農9918；4：綿麥367；5：綿麥51；6：綿麥58；7：綿麥319；8：綿麥902；9：綿麥906；10：綿麥907；11：綿麥908；12：川麥901；13：川育30；14：科成麥4號；15：蜀麥114；16：西科麥11號；17：中科麥17。

M：DL2000；1：ddH2O；2：矮抗58；3：蘇麥3號；4：南麥660；5：綿麥602；6：川麥607；7：綿麥1419；8：川麥88；9：中科麥90；10：綿麥367；11：川育30；12：綿麥1403；13：科成麥4號；14：南麥931；15：西科麥11號；16：川育30；17：內麥141。

3 討 論

3.1 四川小麥品種抗條銹性分析

目前，四川小麥生產上對條銹病具有全生育期抗性的已知基因主要有和。本研究在供試的153份材料中發(fā)現(xiàn)川麥87、綿麥161、綿麥319等12份材料可能攜帶，川麥83、川育34、綿麥903等12份材料可能攜帶，這些品種在生產上均表現(xiàn)為高抗，表明和仍然具有較好的抗病性，且在四川小麥品種中所占比例不高，可作為抗源進一步利用。本研究還發(fā)現(xiàn)，有25份材料可能含有，該基因在20世紀90年代已被條銹菌小種CYR29克服，但一些可能含有的品種目前對條銹病仍然表現(xiàn)出較好的抗性，如綿麥1403、川育25、蜀麥1742等。這一現(xiàn)象說明過去已經喪失抗性的可能對現(xiàn)在的條銹菌流行小種重新具有了抗病性。周 陽等研究發(fā)現(xiàn)，這些材料在含有抗條銹病基因的同時也可能攜帶、和。在供試的小麥材料中，有77份可能攜帶。Chen等通過試驗對分子檢測結果進行驗證，結果表明，用分子標記篩選的具有該抗性標記條帶的材料不一定具有該抗性基因，檢測材料中實際含有的抗性基因出現(xiàn)的頻率可能低于分子檢測標記出現(xiàn)的頻率，因此，對的檢測結果還需要進一步驗證。成株期抗條銹病基因位于//位點，該位點對小麥條銹病、葉銹病和白粉病等病害均勻產生部分抗性，具有抗病譜廣且抗性持久的特點。李敏州等的研究結果表明，中國小麥材料中含有基因的品種較少。曾慶東等以單基因系材料分別接種當前流行小種CYR32、CYR33和新致病類型G22，研究結果表明，在苗期均都表現(xiàn)為感病，在成株期均表現(xiàn)為抗病，表明對國內流行小種在成株期的抗性是有效的。本研究結果表明，有4份小麥材料可能攜帶，分別是川麥1603、蜀麥1705、川育34和綿麥56，其抗病的持久性還有待進一步檢驗。在供試材料中，有90份可能攜帶，占參試材料的58.8%。該基因于2009年在四川首次報道喪失抗性后，至今已有10年時間，但從檢測結果看，四川近幾年新育成的小麥品種中可能攜帶的比例仍然較高，說明了該基因在四川小麥育種中使用的普遍性。值得注意的是，來源于同一組合的品種綿麥51(1275-1/99-1522)和綿麥367 (1275-1/99-1522)，均由攜帶的品種綿麥37(1275-1)和川麥43(99-1522)作親本雜交育成。兩個品種自2006年穩(wěn)定成系以來，多年田間成株期抗病性均表現(xiàn)為抗條銹病或慢病性，但2019-2020年度綿麥51和綿麥367的田間誘發(fā)成株期抗性均表現(xiàn)為高感，這一現(xiàn)象說明，四川小麥生產上可能已經出現(xiàn)新的條銹菌致病類型。

3.2 四川小麥品種抗病基因分析

利用已知抗病基因的分子標記對153份供試材料進行抗條銹病、白粉病和赤霉病基因檢測，結果顯示，同一份供試材料可能同時攜帶不同的抗病基因。如綿麥907、綿麥1419、南麥660等6份材料可能同時攜帶抗條銹病基因、抗白粉病基因和抗赤霉病基因，川麥93、綿麥51、綿麥312等26份材料可能同時攜帶和，川麥607、川麥608、綿麥602等4份材料可能同時攜帶和，這些材料均屬于多效抗性材料。同時，由于四川小麥育種歷來比較重視品種的條銹病抗性，本研究分子標記檢測結果表明，一些抗病品種同時聚合了多個抗條銹病基因，有71份材料同時攜帶2～4個基因。如蜀麥1705(+++)同時攜帶4個抗條銹病基因，科成麥12(++)、川育34(++)、綿麥1501(++)等12份材料同時攜帶3個抗條銹病基因，川麥93(+)、川麥605(+)、川農38(+)等58份材料同時攜帶2個抗條銹病基因。另外，川農33、川農39、國豪麥6號等15份材料未檢測到所測抗病基因，但仍然表現(xiàn)出較好的抗條銹性，這些材料可能含有其他已知抗條銹病基因或未知新基因。

抗白粉病基因對國內大部分地區(qū)的白粉病混合菌種均具有抗性，抗性強、抗譜廣，在育種中利用率較高。本研究結合分子標記和田間自然發(fā)病調查，發(fā)現(xiàn)川麥93、川麥901、綿麥902等40份材料可能攜帶抗性基因，這些品種在生產上均表現(xiàn)為高抗白粉病，表明對白粉病具有穩(wěn)定持久抗性。

國內外對赤霉病抗性遺傳進行了大量研究，已經定位了約100個抗赤霉病QTL，分布在小麥所有染色體上，其中抗病基因～已被正式命名，抗性最強且穩(wěn)定，在高病害壓力下仍可平均降低赤霉病嚴重度20%左右。我國小麥所含的主要來自蘇麥3號和寧麥9號(揚麥6號/西風)，并以后者為主。在本研究的供試材料中，有12份可能攜帶抗赤霉病基因，包括川麥607、川麥608、綿麥602等。由于2018-2019和2019-2020兩年度川北麥區(qū)赤霉病自然發(fā)病不明顯，其赤霉病抗性還有待進一步鑒定。