普通小麥川麥60-簇毛麥 3V(3D)代換系的分子細(xì)胞學(xué)鑒定

張 潔,蔣 云,郭元林,王 穎,鄧光兵,宣 樸,龍 海

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)核技術(shù)研究所，四川成都 610061； 2.農(nóng)業(yè)部西南地區(qū)小麥生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610066； 3.中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所，四川成都 610041； 4.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，四川成都 610066)

小麥條銹病是由小麥條銹菌(f.sp.)引起的一種常見(jiàn)的真菌性病害，具有變異程度高、流行程度廣等特點(diǎn)，發(fā)生時(shí)可嚴(yán)重影響小麥品質(zhì)和產(chǎn)量。因此，小麥條銹病是中國(guó)乃至全世界小麥生產(chǎn)上最具威脅的病害之一。培育抗病品種是防控小麥條銹病最經(jīng)濟(jì)、有效和對(duì)環(huán)境友好的策略。近年來(lái)，前人已從小麥及其近緣物種中鑒定到大量抗條銹病基因。但由于條銹生理小種與抗源的協(xié)同進(jìn)化，許多過(guò)去大量使用的基因(如、、等)對(duì)目前流行的條銹生理小種已經(jīng)失去了抗性。因此，亟需從小麥及其近緣物種中挖掘、篩選新的抗條銹基因，以滿(mǎn)足小麥生產(chǎn)的需要。

普通小麥(L.,2=6=42,AABBDD)的近緣物種是小麥的重要基因源。將其與普通小麥進(jìn)行雜交，可有效拓寬小麥的遺傳背景，豐富小麥的遺傳多樣性。一年生二倍體簇毛麥(L.，2=2=14,VV)起源于地中海地區(qū)東北部，是小麥重要的三級(jí)基因源，攜帶有多種抗性基因，如銹病、眼斑病、白粉病、全蝕病以及耐鹽脅迫等。其中，來(lái)自6VS染色體上的抗白粉病基因已被深入研究，并得到廣泛利用。但對(duì)于簇毛麥條銹病抗性基因的挖掘和利用的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

本課題組前期通過(guò)雜交創(chuàng)制了一個(gè)對(duì)小麥條銹病具有優(yōu)良抗性的普通小麥(中國(guó)春，CS)-簇毛麥3V(3D)二體代換系，命名為CD-3。通過(guò)對(duì)F代群體進(jìn)行遺傳分析，發(fā)現(xiàn)CD-3的條銹病抗性由一對(duì)隱性基因控制，且該基因位于簇毛麥3V染色體上，并將此基因命名為。川麥60(98-1231//貴農(nóng)21/生核3295)分別于2011年和2012年完成國(guó)家和四川省審定，具有高產(chǎn)、高抗條銹病、綜合性狀較好等優(yōu)點(diǎn)。但近年來(lái)，隨著條銹菌生理小種和抗源的協(xié)同進(jìn)化，川麥60的抗性已完全喪失。為進(jìn)一步利用簇毛麥3V染色體上的條銹病抗性基因，創(chuàng)制培育出綜合性狀優(yōu)良且可用于小麥遺傳育種的抗性材料，本研究通過(guò)傳統(tǒng)雜交手段，將3V染色體向川麥60背景中進(jìn)行轉(zhuǎn)移，在后代中篩選到一個(gè)高抗條銹病的株系，命名為1901-245，并從分子細(xì)胞學(xué)水平上對(duì)其進(jìn)行精確鑒定和評(píng)價(jià)，以期為小麥條銹病抗性改良育種提供優(yōu)良的資源材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究使用的小麥栽培品種川麥60由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所朱華忠研究員提供；CS-簇毛麥3V(3D)二體代換系(CD-3)由本實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)制；CS-簇毛麥1V、2V、4V～7V附加系(#3)由電子科技大學(xué)楊足君教授提供；誘發(fā)材料Sy95-71、簇毛麥ZC6由本實(shí)驗(yàn)室保存；川麥60與CD-3回交自交后代1901-245(從以川麥60作回交父本的BCF代中篩選得到)由本實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)制?？箺l銹病鑒定所用的條銹病混合生理小種CYR32、CYR33和CYR34由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。

1.2 分子標(biāo)記分析

取親本CD-3和川麥60、回交自交后代1901-245以及對(duì)照材料中國(guó)春、簇毛麥ZC6、CS-簇毛麥1V、CS-族毛麥2V、CS-族毛麥4V～7V附加系的幼嫩葉片，使用CTAB法提取總基因組DNA。用Li等報(bào)道的簇毛麥3V染色體特異引物(表1)對(duì)供試材料進(jìn)行檢測(cè)，引物由上海生工生物工程公司合成。PCR反應(yīng)體系為25 μL，包含Taq PCR mix預(yù)混液17.5 μL(生工生物工程公司，上海),基因組DNA (50～100 ng·μL) 1.8 μL，上下游引物(10 μmol·L)各 1.4 μL。配制好的PCR體系置于Biometra PCR儀(耶拿,德國(guó))上進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共34個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物使用濃度為1%的瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳，EtBr染色后在BIO-RAD紫外凝膠成像系統(tǒng) (加利佛尼亞,美國(guó))下進(jìn)行拍照。

表1 本研究所使用的3V特異引物Table 1 3V- specific primers used in the study

1.3 根尖細(xì)胞染色體FISH分析

待供試材料的根長(zhǎng)至1～2 cm時(shí)剪取根尖，按照Z(yǔ)hang等的方法對(duì)根尖進(jìn)行笑氣(NO)預(yù)處理。中期染色體制片方法按照Kato等報(bào)道的方法進(jìn)行。在寡聚核苷酸探針Oligo-pSc119.2和Oligo-pTa535的5′端分別連上熒光基團(tuán)6-FAM和6-TAMRA，以識(shí)別小麥A、B、D組染色體身份；在簇毛麥特異探針Oligo-Hv62-1的5′端連上Cy5，以識(shí)別簇毛麥3V染色體，所有探針由上海捷運(yùn)生物科技有限公司合成。FISH分析按照Fu等的報(bào)道進(jìn)行。DAPI染色后使用萊卡DM2500熒光顯微鏡拍攝圖片。每個(gè)材料調(diào)查3個(gè)中期分裂相以確定最終核型。

1.4 花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂期染色體配對(duì)分析

待花粉母細(xì)胞處于減數(shù)分裂中期I時(shí)，收集1901-245的花藥。用卡諾氏固定液無(wú)水乙醇∶氯仿∶冰醋酸(V∶V∶V=6∶3∶1)固定24 h后，使用95%的酒精沖洗花藥，之后將花藥轉(zhuǎn)入70%的酒精中，-20 ℃保存。在載玻片上用45%的醋酸壓片，隨后在液氮中揭片。熒光原位雜交的探針選擇、操作流程及圖像獲取同 1.3。每個(gè)材料觀察30個(gè)花粉母細(xì)胞以分析染色體配對(duì) 情況。

1.5 條銹病抗性鑒定

將親本CD-3、川麥60和10顆1901-245的種子種植于四川省農(nóng)科院郫縣試驗(yàn)基地。試驗(yàn)區(qū)塊周?chē)N上誘發(fā)行。連續(xù)兩年(2019和2020年)對(duì)上述材料進(jìn)行田間條銹病抗性鑒定。操作如下：在植株三葉期時(shí)，用牙簽蘸取含條銹菌生理小種CYR32、CYR33和CYR34的混合菌種，并將其涂抹于供試材料和誘發(fā)材料的心葉上，隨后適量噴濃度為0.01%的吐溫20進(jìn)行保濕。接種18～20 d后觀察植株抗性反應(yīng)。當(dāng)誘發(fā)材料發(fā)病嚴(yán)重度達(dá)到80%以上時(shí)，對(duì)1901-245及其親本CD-3和川麥60進(jìn)行成株期抗性調(diào)查，記錄其反應(yīng)型。隨后每隔10 d調(diào)查一次，一共調(diào)查3～4次。反應(yīng)型(IT)按照Mcintosh等的報(bào)道分為0～4級(jí)，分別為0(免疫)、0；(近免疫)、1(高抗)、2(中抗)、3(中感)和4(高感)。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子標(biāo)記分析結(jié)果

用引物3V-7、3V-11、3V-14、3V-21和3V-24對(duì)供試材料CS、川麥60、簇毛麥ZC6、CD-3、1901-245以及CS-簇毛麥1V、2V、4V～7V附加系進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果(圖1)表明，這5對(duì)引物均能在ZC6、CD-3和1901-245中擴(kuò)增出3V染色體的目標(biāo)條帶，而在CS、川麥60以及CS-簇毛麥1V、2V、4V～7V附加系中不能擴(kuò)增出簇毛麥3V染色體的目標(biāo)條帶(圖1)。另外，引物3V-21除了能擴(kuò)增出3V染色體特異條帶(圖1d)外，還能在CS、川麥60以及CS-簇毛麥1V、2V、4V～7V附加系中擴(kuò)增出小麥3D染色體的目標(biāo)條帶。

M：DNA marker Trans2K plus；1：中國(guó)春；2：川麥60；3：簇毛麥ZC6；4：CD-3；5：CS-簇毛麥1V附加系；6：CS-簇毛麥2V附加系；7：1901-245；8：CS-簇毛麥4V附加系；9：CS-簇毛麥5V附加系；10：CS-簇毛麥6V附加系；11：CS-簇毛麥7V附加系。a～e分別為用3V-7、3V-11、3V-14、3V-21和3V-24引物對(duì)供試材料的PCR擴(kuò)增結(jié)果。M:DNA marker Trans2k plus; 1:Chinese Spring(CS); 2:Chuanmai 60; 3:D.villosum ZC6; 4:CD-3; 5:CS-D.villosum 1V additional line; 6:CS-D.villosum 2V additional line; 7:1901-245; 8:CS-D.villosum 4V additional line; 9:CS-D.villosum 5V additional line; 10:CS-D.villosum 6V additional line; 11:CS-D.villosum 7V additional line.a-e indicate PCR amplicons of the wheat materials amplified by specific primers 3V-7,3V-11,3V-14,3V-21 and 3V-24,respectively.圖1 3V染色體特異引物對(duì)供試材料的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplicons of wheat materials by 3V-specific primers

2.2 親本染色體核型構(gòu)建及1901-245的染色體鑒定結(jié)果

用寡聚核苷酸探針Oligo-pSc119.2、Oligo-pTa535和簇毛麥特異探針Oligo-Hv62-1構(gòu)建CD-3(CS背景)、川麥60以及1901-245的標(biāo)準(zhǔn)核型，同時(shí)對(duì)1901-245的染色體構(gòu)成進(jìn)行鑒定。FISH核型分析顯示，Oligo-pSc119.2和Oligo-pTa535可有效區(qū)分21對(duì)小麥染色體(圖2a、圖2c、圖2d)，Oligo-Hv62可在簇毛麥3V染色體長(zhǎng)臂、短臂端部以及著絲粒區(qū)雜交出明顯的簇毛麥特異信號(hào)(圖2b、圖2e)。由FISH鑒定結(jié)果可知，1901-245攜帶一對(duì)簇毛麥3V染色體，而丟失了一對(duì)小麥3D染色體(圖2d～圖2f)。另外，由圖2f可知，CD-3中的小麥染色體和川麥60部分染色體之間存在FISH條帶多態(tài)性，如在2A染色體上， CD-3的長(zhǎng)臂端有較弱的Oligo-pSc119.2信號(hào)，而川麥60的長(zhǎng)臂端則不具有Oligo-pSc119.2信號(hào)；在4A染色體上，CD-3的長(zhǎng)臂端有強(qiáng)烈的Oligo-pSc119.2信號(hào)，而川麥60長(zhǎng)臂端僅有大范圍的Oligo-pTa535信號(hào)；在5A染色體上，CD-3的長(zhǎng)臂中部有強(qiáng)烈的Oligo-pTa535信號(hào)，而川麥60的長(zhǎng)臂中部Oligo-pTa535信號(hào)卻很弱，同時(shí)還具有Oligo-pSc119.2信號(hào)；在3B染色體上，CD-3的短臂端Oligo-pSc119.2有強(qiáng)烈的信號(hào)，而川麥60的短臂端Oligo-pSc119.2信號(hào)卻較弱(圖2F)。根據(jù)這些多態(tài)性，可初步判定其后代1901-245，2A和3B染色體來(lái)源于川麥60,而4A和5A染色體來(lái)源于CD-3。另外，核型比較還發(fā)現(xiàn)，1901-245的2D染色體長(zhǎng)臂與親本CD-3和川麥60都存在差異。

綠色、紅色和白色分別為探針Oligo-pSc119.2、Oligo-pTa535和簇毛麥特異探針Oligo-Hv62-1信號(hào)。a～b：CD-3的 FISH鑒定圖；c：川麥60的FISH鑒定圖；d～e：1901-245的FISH鑒定圖；f：CD-3、川麥60和1901-245的染色體FISH核型圖。 圖f中每一組三條染色體從左到右依次為CD-3、川麥60和1901-245，其中3V染色體為1901-245中的3V染色體，左為以O(shè)ligo-pSc119.2和Oligo-pTa535為探針的核型，右為簇毛麥探針Oligo-Hv62-1的核型。方框所示為親本間具有多態(tài)性的染色體，箭頭所示為1901-245 2D染色體與親本2D染色體的多態(tài)性。Green signals,red signals and white signals were probes Oligo-pSc119.2,Oligo-pTa535 and Oligo-Hv62,respectively.a-b:Image of chromosomes in CD-3 analyzed by FISH; c:Image of chromosomes in Chuanmai 60 analyzed by FISH; d-e:Image of chromosomes in 1901-245 analyzed by FISH; f:FISH karytypes of CD-3,Chuanmai 60 and 1901-245,and in every group,chromosomes from CD-3,Chuanmai 60 and 1901-245 were shown from left to right,respectively.Additionally,3V chromosome is originated from 1901-245 (The left is the chromosomal karyotype with probes Oligo-pSc119.2 and Oligo-pTa535,and the right is the chromosomal karyotype with V genome-specific probe of Oligo-Hv62-1).Rectangles indicate the obvious different karyotypes of the chromosomes,originated from its parents CD-3 and Chuanmai 60,respectively.Arrow indicates the different karyotype of 2D chromosome originated from 1901-245,compared with its parents CD-3 and Chuanmai 60.圖2 CD-3、川麥60和1901-245的FISH 分析圖及標(biāo)準(zhǔn)核型圖Fig.2 FISH analysis and karyotype of CD-3,Chuanmai 60 and 1901-245

2.3 花粉母細(xì)胞染色體減數(shù)分裂期的行為

用寡聚核苷酸探針Oligo-pSc119.2、Oligo-pTa535和簇毛麥特異探針Oligo-Hv62-1對(duì)1901-245花藥的37個(gè)花粉母細(xì)胞進(jìn)行染色體行為統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)1901-245花粉母細(xì)胞的染色體總數(shù)均為42，平均含有單價(jià)體0.11個(gè)，環(huán)狀二價(jià)體19.73個(gè)，棒狀二價(jià)體1.22個(gè)，未發(fā)現(xiàn)多價(jià)體。因此，1901-245花粉母細(xì)胞染色體平均構(gòu)型為：2=42=0.11I+(19.73環(huán)+1.22棒)Ⅱ。出現(xiàn)單價(jià)體的染色體分別為3B、4B和5A，未發(fā)現(xiàn)簇毛麥3V染色體出現(xiàn)單價(jià)體的情況(圖3a～3f)。另外，在減數(shù)分裂后期I也未發(fā)現(xiàn)落后染色體或染色體橋的出現(xiàn)(圖3g、3h)。

a～f：減數(shù)分裂中期I；g-h：減數(shù)分裂后期I。白色箭頭所示為單價(jià)體，黃色箭頭所示為簇毛麥3V染色體。a-f:Chromosome behaviors at meiotic metaphase I; g-h:Chromosome behaviors at meiotic telophase I.White arrows indicate the univalent,and yellow arrows indicate the 3V chromosomes of D.villosum.圖3 1901-245的花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂期染色體行為Fig.3 Chromosome behaviors in meiosis of 1901-245

2.4 田間條銹病抗性鑒定及植株表型觀察結(jié)果

用條銹病混合生理小種(含CYR32、CYR33 和CYR34)對(duì)誘發(fā)材料Sy95-71、簇毛麥ZC6、CS、親本川麥60和CD-3以及1901-245進(jìn)行人工接種，并連續(xù)兩年對(duì)其進(jìn)行田間條銹病抗性鑒定，結(jié)果(圖4c)表明，誘發(fā)材料Sy95-71和親本川麥60對(duì)條銹病混合生理小種表現(xiàn)為高感(IT=4)；CS表現(xiàn)為中感(IT=3)；CD-3和1901-245表現(xiàn)為高抗(IT=1)；簇毛麥ZC6表現(xiàn)為近免疫(IT=0；)。對(duì)植株形態(tài)進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，1901-245的株高與川麥60相似，但其植株形態(tài)和穗型更接近于CD-3(圖4a、圖4b)。對(duì)CD-3、1901-245和川麥60的籽粒大小進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，1901-245的粒寬和粒長(zhǎng)都與川麥60更相近(圖4d、圖4e)。

CM60：川麥60。a：植株形態(tài)圖；b：穗型圖；c：葉片抗性反應(yīng)圖；d和e：籽粒形狀。CM60:Chuanmai 60.a:Plant morphology; b:Spike shape; c:Leaf response to stripe rust; d and e:Seed shape.圖4 1901-245及其親本CD-3和川麥60的表型Fig.4 Phenotype of 1901-245 and its parents CD-3 and Chuanmai 60

3 討 論

3.1 一年生二倍體簇毛麥中抗病基因的研究 應(yīng)用

一年生二倍體簇毛麥因具有抗白粉病、銹病、眼斑病、全蝕病等多種小麥病害抗性，而被廣泛應(yīng)用于小麥抗性改良中。近年來(lái)有少量關(guān)于簇毛麥攜帶條銹抗性的報(bào)道，但對(duì)于簇毛麥3V染色體上條銹病抗性基因的挖掘與利用的研究尚未見(jiàn)有報(bào)道。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，CD-3的條銹病抗性由一對(duì)隱性基因控制，且該基因位于簇毛麥3V染色體上，為進(jìn)一步利用簇毛麥的條銹病抗性基因奠定基礎(chǔ)。

3.2 1901-245及其親本CD-3和川麥60染色體FISH核型的多態(tài)性

重復(fù)序列在染色體上的分布在一定程度上可以反映植物染色體組的結(jié)構(gòu)以及基因組進(jìn)化過(guò)程。目前，前人已基于重復(fù)序列開(kāi)發(fā)出大量寡聚核苷酸探針。這些探針可用于構(gòu)建小麥近緣物種的染色體核型，以識(shí)別小麥背景下的外源染色體(片段)。為準(zhǔn)確鑒定1901-245的染色體身份，我們構(gòu)建了基于寡聚核苷酸探針Oligo-pSc119.2和Oligo-pTa535的普通小麥川麥60以及CD-3(CS背景)的FISH核型，并使用簇毛麥特異探針Oligo-Hv62-1來(lái)特異追蹤來(lái)自簇毛麥的3V染色體。由FISH核型鑒定結(jié)果可知，寡聚核苷酸探針Oligo-pSc119.2和Oligo-pTa535聯(lián)合使用，可有效區(qū)分六倍體小麥A、B、D組的42條染色體，與Tang等報(bào)道的結(jié)果一致。Oligo-Hv62-1可在3V染色體臂端雜交出明顯的簇毛麥特異信號(hào)，與Li 等報(bào)道的結(jié)果一致。通過(guò)比較CD-3和川麥60的FISH核型發(fā)現(xiàn)，兩者在2A、4A、5A和3B染色體上存在FISH核型多態(tài)性。前人對(duì)小麥染色體FISH核型存在多態(tài)性已有較多報(bào)道。在本研究中，CD-3與川麥60的FISH核型多態(tài)性應(yīng)該與栽培種培育過(guò)程中的人工選擇有關(guān)。通過(guò)比較1901-245與兩個(gè)親本CD-3和川麥60的FISH核型，可初步判定1901-245的2A和3B染色體來(lái)源于川麥60,而4A和5A染色體來(lái)源于CD-3。這表明1901-245的創(chuàng)制過(guò)程中，川麥60的染色體并未完全替代CD-3的染色體，這提示我們應(yīng)將1901-245繼續(xù)與川麥60進(jìn)行回交。另外，1901-245的2D染色體與親本CD-3和川麥60的2D染色體長(zhǎng)臂端均存在顯著差異，這表明在雜交過(guò)程中2D染色體可能進(jìn)行了重排。在后期研究中，我們將持續(xù)關(guān)注2D染色體長(zhǎng)臂的變異，并進(jìn)一步利用分子標(biāo)記和基因組熒光原位雜交技術(shù)判定2D染色體長(zhǎng)臂結(jié)構(gòu)的變異情況。

3.3 1901-245的田間條銹病抗性及其應(yīng)用

本研究分子細(xì)胞學(xué)鑒定結(jié)果表明，1901-245材料攜帶一對(duì)簇毛麥3V染色體，但丟失了一對(duì)小麥3D染色體，說(shuō)明1901-245為普通小麥川麥60-簇毛麥3V(3D)代換系。對(duì)其花粉母細(xì)胞染色體行為進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，該材料染色體配對(duì)正常，來(lái)自簇毛麥的3V染色體未出現(xiàn)單價(jià)體，表明1901-245遺傳較為穩(wěn)定。另外，對(duì)其農(nóng)藝性狀和條銹病抗性調(diào)查結(jié)果顯示，1901-245籽粒較大，株高較矮，與川麥60相似；條銹病抗性表現(xiàn)為高抗，與CD-3一致，表明1901-245已具有部分川麥60的優(yōu)良性狀，且3V染色體上的條銹病抗性基因在1901-245的遺傳背景下也能正常表達(dá)。這一點(diǎn)說(shuō)明，來(lái)自于簇毛麥3V染色體上的條銹病抗性基因可向其他非CS背景的小麥中進(jìn)行轉(zhuǎn)移且保持其原有抗性，應(yīng)進(jìn)一步得到應(yīng)用。

CS作為地方小麥品種，具有較多的不良性狀，比如植株高、易倒伏、株型差、千粒重低等，因此，不易對(duì)其進(jìn)行遺傳改良。本研究中利用的CD-3是以CS為背景創(chuàng)制的高抗小麥條銹病的CS-簇毛麥3V(3D)代換系，但株型、株高、穗型、千粒重等主要農(nóng)藝性狀均與中國(guó)春一致。因此，在對(duì)CD-3的條銹病抗性利用上具有一定難度。本研究經(jīng)過(guò)將CD-3與四川推廣小麥品種川麥60進(jìn)行雜交并回交，經(jīng)過(guò)兩代自交后得到了一個(gè)抗性穩(wěn)定的高抗小麥條銹病株系1901-245。該材料在株高、粒長(zhǎng)和粒寬上相較于CS也有了較大改善。因此，1901-245是寶貴的高抗小麥條銹病的資源材料，可在小麥抗性改良中進(jìn)行深入研究與利用。鑒于其仍表現(xiàn)出部分CS性狀(如穗型、株型)，后期我們將繼續(xù)用1901-245與川麥60進(jìn)行回交，并加強(qiáng)分子細(xì)胞學(xué)的追蹤，以確保簇毛麥3V染色體穩(wěn)定遺傳。