恩施地區(qū)粉葛不同組織活性成分含量與抑菌活性分析

劉玉，袁名遠(yuǎn)，郭漢玖，郭杰，李宇*，何美軍*，羅凱

（1.湖北民族大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000；2.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中藥材研究所，湖北 恩施 445000；3.國家中藥材產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系恩施綜合試驗站，湖北 恩施 445000）

粉葛（Pueraria thomsonii Benth）為豆科葛屬多年生藤本蔓生植物，性甘、辛，味涼，具有解肌退熱、生津止渴、透疹、升陽止瀉、通經(jīng)活絡(luò)、解酒毒等功效[1-3]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，粉葛作為多年生藥食兩用植物，其有效活性成分主要為大豆苷元[4]、葛根素[5]、大豆苷[6]等異黃酮成分，具有改善心腦血管系統(tǒng)[7]、降血糖[8]、抗癌抗炎[9]、解酒護肝[10]等生理作用。粉葛的生長能力強，每公頃產(chǎn)量約為72 000 kg～108 000 kg，淀粉含量高達(dá)52%左右，未來有望成為世界第六大糧食作物[11-13]。粉葛加工成的葛粉含有多種維生素、蛋白質(zhì)、微量元素等，為優(yōu)良淀粉原料和羹湯糊料[14-15]。

目前粉葛活性成分研究與開發(fā)主要集中在根部，而對莖、葉部分的研究較少，造成了粉葛資源的浪費。因此，本文選取從恩施州粉葛產(chǎn)區(qū)采集粉葛全株，采用高效液相色譜外標(biāo)法分別對粉葛根、莖、葉部的葛根素、鷹嘴豆芽素、大豆苷、大豆苷元等4種活性成分的含量進行對比檢測分析，測定對11種供試菌的抑菌活性，為粉葛資源的開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

粉葛樣品：湖北省恩施市三岔鄉(xiāng)高山地區(qū)（海拔1 000 m～1 300 m）采集，由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中藥材研究所鑒定；葛根素、鷹嘴豆芽素、大豆苷、大豆苷元標(biāo)準(zhǔn)品：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇、乙腈（色譜純）：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia ATCC13883）、糞鏈球菌（Enterococcus faecalis ATCC 29212）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis ATCC 19659）、藤黃微球菌（Micrococcus luteus ATCC 4698）、蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis ATCC 10792）、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC 43300，MRSA）、多耐銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027）、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus ATCC 17749）、耐甲氧西林表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis ATCC 12228，MRSE）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC29213）、大腸桿菌（Escherichiacoli ATCC25922）：中國科學(xué)院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點實驗室鑒定提供。

1.1.2 儀器與設(shè)備

高速多功能粉碎機（XY-200型）：浙江省永康市松青五金廠；高效液相色譜儀（Agilent 1260配DAD檢測器）：安捷倫科技有限公司；冷凍離心機（3K15）：德國西格瑪公司；數(shù)控超聲波清洗器（KQ5200DE）：昆山市超聲儀器有限公司；電子天平（FA20048）：上海佑科儀器儀表有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱（101-4AS）：北京市永光明醫(yī)療儀器廠；酶標(biāo)儀（HF4500）：北京華安麥科生物技術(shù)有限公司；培養(yǎng)箱（CR-80CO2）：廣州市康恒儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-200A）：上海愛朗儀器有限公司；超凈工作臺（SW-CJ-2FD）：上海達(dá)平儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 供試液的制備與培養(yǎng)基配制

將粉葛全株洗凈除雜，根、莖、葉分別于60℃烘干、粉碎、過50目篩后，各取根、莖、葉2 g加入20 mL甲醇[1∶10（g/mL）]，200 W 超聲輔助提取 30 min。取2 mL提取液經(jīng)12 000 r/min離心15 min后，取上清液過0.45 μm微孔濾膜備用[16]。

LB培養(yǎng)基配制：酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.2～7.4，121℃滅菌 30 min（固體 LB 培養(yǎng)基加入瓊脂20 g/L）。

MH液體培養(yǎng)基配制：牛肉粉2 g/L，可溶性淀粉1.5 g/L，酸水解酪蛋白 17.5 g/L，pH 7.2～7.6，121 ℃滅菌30 min。

1.2.2 混合標(biāo)準(zhǔn)液的制備

分別稱取葛根素、鷹嘴豆芽素、大豆苷和大豆苷元4個標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，置于100 mL的容量瓶中，加入甲醇定容，配制成100.00 μg/mL的儲備母液。

4個標(biāo)準(zhǔn)品混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液：分別移取4種標(biāo)準(zhǔn)品儲備母液各0.25 mL于同一個5 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成4 μg/mL的儲備液。

系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別對混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液進行一系列濃度稀釋得到 5、8、10、12、15、18 μg/mL 系列混合標(biāo)準(zhǔn)液備用。

1.2.3 高效液相色譜條件

色譜柱：Phenomenex色譜柱（50 mm×4.6 mm，ODS 5 μm）；Agilent Poroshell反相色譜柱 120 EC-C18（4.6 mm × 150 mm，4 μm）；流動相水（A）、乙腈（B），梯度洗脫：0～20 min，B 0%～ 80%；20 min～27 min，B 80%～100%；27.1 min～30 min，B 0%；流速 1.0 mL/min；檢測波長 260、280、360 nm；柱溫 30 ℃；進樣量 5 μL。

1.2.4 粉葛活性成分高效液相色譜檢測

4種標(biāo)準(zhǔn)品葛根素、鷹嘴豆芽素、大豆苷、大豆苷元的線性關(guān)系考察，取1.2.2項敘述的稀釋系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2.3項敘述的色譜條件進行高效液相色譜檢測（high performance liquid chromatography，HPLC）進樣上述系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，每組樣品進樣6次重復(fù)。參照2020版藥典0512通則規(guī)定，測定儀器信噪比（S/N），當(dāng)各標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至信噪比3＜S/N＜10時，以該溶液濃度計算儀器檢出限（S/N=3）和定量限（S/N=10），得到4種標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線、R2、檢出限和定量限。對各標(biāo)準(zhǔn)品進行精密度和重復(fù)性試驗，每個混標(biāo)重復(fù)檢測6次，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。檢測加入標(biāo)量的各樣品的4種標(biāo)準(zhǔn)品的含量，計算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，重復(fù)檢測6次。HPLC外標(biāo)法檢測4種標(biāo)準(zhǔn)品的含量計算公式如下。

式中：Cx為粉葛中標(biāo)準(zhǔn)品的含量，μg/mL；CR為HPLC檢測的含量，μg/mL；m為樣品干重，μg。

1.2.5 粉葛不同部位抑菌活性研究

采用濾紙片法[17]測試粉葛不同部位對10株供試菌的抑菌活性，取20 μL培養(yǎng)至OD600為0.6的測試菌菌液，與20 mL LB固體培養(yǎng)基混合均勻倒平板。粉葛不同組織的提取物用二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解，取10 μL，分3次滴加于濾紙片（直徑為8.00 mm）上，將濾紙片置于混有菌液的培養(yǎng)基上，另設(shè)氨芐青霉素（100 mg/mL）作陽性對照、添加DMSO作陰性對照，37℃培養(yǎng)12 h，測抑菌圈直徑。參照抗生素藥敏標(biāo)準(zhǔn)：高敏（抑菌圈直徑＞20 mm）、中敏（10 mm～20 mm）、輕敏或耐藥（＜10 mm）。采用微量肉湯稀釋法測定粉葛不同組織對供試菌的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）值，按美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）M07-A10 的標(biāo)準(zhǔn)操作程序[18]進行操作，在12列8行規(guī)格的96孔板上依次添加以下內(nèi)容：第2～12列的每孔加入含不同濃度粉葛組織活性成分的MH液體培養(yǎng)基100 μL，分別將培養(yǎng)好的菌液稀釋1 000倍，每孔加入稀釋菌液100 μL。第1列為空白培養(yǎng)基對照組，加入MH液體培養(yǎng)基200 μL。另設(shè)氨芐青霉素（100 μg/mL）96孔板作陽性對照組，37℃培養(yǎng)16 h后使用酶標(biāo)儀HP4500檢測OD600，根據(jù)CLSI M100-S25標(biāo)準(zhǔn)[18]，與第2列比較，抑制80%細(xì)菌生長的藥物濃度為受試菌的MIC值。采用瓊脂培養(yǎng)基平板法，取MIC以上未見細(xì)菌生長的孔內(nèi)混合液與PDA固體培養(yǎng)基中均勻涂布，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，觀察有無細(xì)菌生長，以菌落數(shù)不超過5個的平板所對應(yīng)孔中的最低濃度為該藥物的最低殺菌濃度（minimal bactericidal concentration MBC）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗數(shù)據(jù)運用Origin 9軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制和線性關(guān)系考察

將 4 種不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)液（5、8、10、12、15、18 μg/mL）分別進樣5 μL，按1.2.3色譜條件進行分析。以峰面積為縱坐標(biāo)（y），標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)（x），進行線性回歸分析，求得線性回歸方程和線性范圍，結(jié)果見表1。

表1 線性回歸方程及線性范圍Table 1 Linear regression equation and linear range

由表1可知，葛根素、鷹嘴豆芽素、大豆苷和大豆苷元的線性方程分別為y葛根素=29.355 4x+50.621 7，R2=0.999 61；y鷹嘴豆芽素=62.340 5x+3.826 5，R2=0.999 34；y大豆苷=27.580 3x+19.720 2，R2=0.999 40；y大豆苷元=52.733 5x+0.740 6，R2=0.999 96。葛根素、鷹嘴豆芽素、大豆苷、大豆苷元均在5.00 μg/mL～18.00 μg/mL的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.2 精密度與回收率試驗

精密度結(jié)果見表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)品精密度試驗結(jié)果（n=6）Table 2 Results of standard precision detection（n=6）

通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得到葛根素、鷹嘴豆芽素、大豆苷、大豆苷元的含量，再計算出其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差值（relative standrd deviation，RSD）分別為 1.601%、3.587%、1.792%、2.245%，RSD值均＜5%，可見此法的精密度良好，滿足分析要求。

加樣回收率結(jié)果見表3。

表3 回收率試驗結(jié)果（n=3）Table 3 The results of recovery test（n=3）

4個標(biāo)準(zhǔn)品的平均回收率在97.37%～104.91%之間，葛根素的平均回收率為95.69%～97.96%，RSD為1.26%～2.14%；鷹嘴豆芽素的平均回收率為103.59～104.91%，RSD為0.84%～1.85%；大豆苷的平均回收率為103.28%～104.24%，RSD為0.38%～1.63%；大豆苷元的平均回收率為101.43%～103.12%，RSD為0.75%～2.31%，表明本方法準(zhǔn)確可靠，可以滿足測定的要求。

2.3 粉葛不同組織活性成分含量比較

粉葛不同組織活性成分含量見表4。

表4 粉葛不同組織活性成分含量（n=3）Table 4 Contents of active ingredients in different tissues of P.thomsonii（n=3）

由表4可知，粉葛不同組織中各活性成分含量有一定差異。大豆苷元、大豆苷2種黃酮活性成分在根中的含量最高，分別為（4.28±0.85）、（972.25±98.72）μg/g；葛根素在莖中的含量最高，為（7.37±1.14）mg/g；鷹嘴豆芽素在葉中的含量最高，為（33.48±4.01）μg/g。

2.4 抑菌活性測定

粉葛不同組織抑菌活性見表5。

表5 粉葛不同組織抑菌活性Table 5 Antibacterial activity of different tissues of P.thomsonii

如表5所示，濾紙片試驗結(jié)果顯示粉葛根部對金黃色葡萄球菌有中度敏感抑制作用（10 mm＜抑菌圈＜20 mm），抑菌圈直徑為（10.50±0.39）mm；粉葛莖部對金黃色葡萄球菌、糞鏈球菌、蘇云金芽孢桿菌、多耐銅綠假單胞菌有中度敏感抑制作用，抑菌直徑分別為（10.50±0.37）、（10.28±0.47）、（12.09±1.13）、（10.12±0.25）mm。粉葛葉對蘇云金芽孢桿菌有中度敏感抑制作用，抑菌圈直徑為（10.83±0.42）mm。采用微量肉湯稀釋法測定粉葛不同組織對供試菌的MBC與MIC值，粉葛莖對金黃色葡萄球菌、糞鏈球菌、蘇云金芽孢桿菌和多耐銅綠假單胞菌的MIC值分別為0.55、2.21、1.10、17.67 mg/mL，MBC 值 分 別 為 4.42、8.84、4.42、17.67 mg/mL。粉葛葉對蘇云金芽孢桿菌的MIC值為16.14 mg/mL，MBC值為64.57 mg/mL。

3 結(jié)論

本文通過HPLC檢測發(fā)現(xiàn)粉葛不同組織活性成分含量不同，大豆苷元、大豆苷在根含量最高；鷹嘴豆芽素在葉中含量最高；葛根素在莖中含量最高。粉葛根部對金黃色葡萄球菌有中度敏感抑菌效果，粉葛莖部對金黃色葡萄球菌、糞鏈球菌、蘇云金芽孢桿菌、多耐銅綠假單胞菌有中度敏感抑菌效果，粉葛葉對蘇云金芽孢桿菌有中度敏感抑菌效果。粉葛不同組織中根與莖的活性成分含量高于葉，同時粉葛莖部的抑菌活性優(yōu)于根部與葉。本研究為后期粉葛的開發(fā)利用提供了參考，對促進粉葛產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。