色氨酸和蘇氨酸衍生化紅曲紅色素的穩(wěn)定性研究

何貝貝，劉彩，陳莎，高夢(mèng)祥，李利

（長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025）

紅曲色素是由紅曲菌發(fā)酵產(chǎn)生的一種安全的天然色素，已作為著色劑列入GB 2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》，允許用于乳、糕點(diǎn)、餅干、熟肉制品等食品類(lèi)別中。紅曲色素是一種混合物，包括紅、黃、橙3類(lèi)色素組分，其中紅曲橙色素中的紅斑紅曲素和紅曲玉紅素化學(xué)性質(zhì)比較活潑，可與伯胺發(fā)生親氨基反應(yīng)，生成紅曲橙色素衍生物（orange Monascus pigment derivates，OMPDs）[1-3]。OMPDs在顏色上為紅色，屬于紅曲紅色素范疇[4]。目前報(bào)道的49種不同結(jié)構(gòu)的天然紅曲紅色素化合物中，至少有26種為與氨基酸發(fā)生反應(yīng)而生成的OMPDs[5]，這類(lèi)紅曲紅色素稱(chēng)之為氨基酸衍生化的紅曲紅色素。

研究表明，氨基酸衍生化的紅曲紅色素具有多種生物活性[6-9]，在食品方面具有很好的應(yīng)用前景。其中，色氨酸衍生化的紅曲紅色素（red Monascus pigments derived with Trp，Trp-RMPs）和蘇氨酸衍生化的紅曲紅色素（red Monascus pigments derived with Thr，Thr-RMPs）對(duì)肥胖的預(yù)防和干預(yù)功效顯著，可用于開(kāi)發(fā)減肥功能性食品[9-14]。肥胖是一種以脂肪在體內(nèi)過(guò)度積累為特征的疾病，在全世界范圍內(nèi)普遍存在并呈快速增加的趨勢(shì)，能引發(fā)糖尿病、高血壓、心血管疾病及小腸癌等多種疾病[9，14]。研究表明，抑制脂質(zhì)代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶是降脂減肥的有效途徑之一，如抑制脂肪酶可減少腸道對(duì)膳食脂肪的水解吸收，抑制羥甲基戊二酸單酰輔酶A（3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A，HMG-CoA）還原酶能減少體內(nèi)膽固醇的合成[10-13，15]。Trp-RMPs和 Thr-RMPs通過(guò)參與不同的脂質(zhì)代謝途徑，達(dá)到預(yù)防和干預(yù)肥胖的效果，其中，Trp-RMPs具有較高的脂肪酶抑制活性，能使肥胖小鼠的體重、皮下脂肪及肝臟脂肪含量等顯著減少[10]，而Thr-RMPs具有較高的HMG-CoA還原酶抑制活性，能顯著降低C57BL/6小鼠血清中的總膽固醇水平和動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)[12]。

在功能性食品中，食品作為功效成分的載體，其pH值范圍多為3.5～7.0[16]，在加工過(guò)程中，通常需要巴氏殺菌等熱處理過(guò)程。而紅曲色素作為一種天然色素，容易受pH值、溫度等環(huán)境因素影響而發(fā)生顏色改變或降解[2，17-20]。為了解 Trp-RMPs和 Thr-RMPs兩種紅曲色素對(duì)pH值和溫度的耐受性，本研究通過(guò)體外衍生化反應(yīng)，用化學(xué)半合成的方法制備Trp-RMPs和Thr-RMPs，研究其在常見(jiàn)食品pH值范圍內(nèi)的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，為富含Trp-RMPs和Thr-RMPs的減肥功能性食品的開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅曲橙色素：長(zhǎng)江大學(xué)食品微生物及其產(chǎn)品開(kāi)發(fā)實(shí)驗(yàn)室提供，主要含紅斑紅曲素和紅曲玉紅素，二者含量比為1∶1.25；蘇氨酸、色氨酸（均為分析純）：天津市福晨化學(xué)試劑廠；甲醇、甲酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈（色譜純）：美國(guó)天地有限公司；C18固相萃取柱：天津市寶津科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（TU1900）：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；高效液相色譜儀（LC1200）：美國(guó)安捷倫公司；液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（TripleTOF 5600+）：美國(guó)AB Sciex公司。

1.3 方法

1.3.1 Trp-RMPs和Thr-RMPs的制備

色氨酸和蘇氨酸與紅曲橙色素的親氨基反應(yīng)參照劉彩等[19]的方法，反應(yīng)體系含50%甲醇，8 mmol/L色氨酸或蘇氨酸，0.1 mg/mL紅曲橙色素，反應(yīng)條件為30℃、250 r/min、2 h。反應(yīng)結(jié)束后，加入去離子水，將反應(yīng)液中甲醇調(diào)至20%，用C18固相萃取柱進(jìn)行凈化，最終用90%甲醇洗脫，洗脫液在40℃、100 r/min條件下進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥、稱(chēng)重，加入一定量的去離子水溶解，制備2 g/L色素衍生物的水溶液。該色素衍生物于4℃避光保存?zhèn)溆?，臨用前用去離子水稀釋至色價(jià)（2.0±0.1）U/mL，色價(jià)的計(jì)算參考劉彩等[19]的方法用最大吸收波長(zhǎng)處的吸光值A(chǔ)計(jì)算，色價(jià)/（U/mL）=A×稀釋倍數(shù)。

1.3.2 Trp-RMPs和Thr-RMPs的高效液相色譜分析

紅曲色素的高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HLPC）分析條件參照劉彩等[19]的方法，具體如下。

色譜柱：Inertsil ODS-3（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器（diode array detector，DAD）；檢測(cè)波長(zhǎng)：300nm～600nm；監(jiān)測(cè)波長(zhǎng)：380、470、520nm。流動(dòng)相A相：乙腈（含0.1%甲酸），B相：酸水（含0.1%甲酸）；梯度洗脫條件為0 min～ 18 min，15%A ～ 80%A；18 min ～ 30 min，80%A；30 min ～ 31 min，80%A ～ 15%A；31 min ～ 40 min，15%A，流速：1.0 mL/min。

1.3.3 Trp-RMPs和Thr-RMPs的液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析

紅曲色素的液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatography/mass spectrometry，LC/MS）分析條件參照劉彩等[19]的方法，具體如下。

色譜柱：Kinetex 2.6 μm F5（100 mm × 2.1 mm）；柱溫：30℃；流動(dòng)相：A相為酸水（含0.1%甲酸），B相為乙腈；梯度洗脫條件：0 min～1 min，95%A；1 min～8 min，95%A～15%A；8 min ～ 9 min，15%A；9 min ～9.1 min，15%A ～ 95%A；9.1 min ～ 11 min，95%A；流速：0.2 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；DAD 檢測(cè)波長(zhǎng)：300 nm ～600 nm；離子源：電噴霧電離，正離子模式；掃描范圍：質(zhì)荷比（m/z）100～ 1 000；電噴霧電壓：5 500 V；離子源溫度：550℃；霧化氣壓力379kPa；輔助氣壓力379kPa；氣簾氣壓力172 kPa。

1.3.4 不同pH值條件下Trp-RMPs和Thr-RMPs的顏色變化分析

將色價(jià)為（2.0±0.1）U/mL的Trp-RMPs或Thr-RMPs水溶液與0.1 mol/L的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液（pH 3、pH 5、pH 7）以體積比為1∶1的比例混合，25℃避光放置10 min，觀察溶液顏色的變化情況，并在350 nm～500 nm范圍內(nèi)掃描紫外可見(jiàn)吸收光譜，分析光譜的形狀和最大吸收波長(zhǎng)的變化情況。

1.3.5 不同pH值條件下Trp-RMPs和Thr-RMPs的熱穩(wěn)定性分析

將色價(jià)為（2.0±0.1）U/mL的Trp-RMPs或Thr-RMPs水溶液與0.1 mol/L的檸檬酸-磷酸鹽緩沖溶液（pH 3、pH 5、pH 7）以體積比為 1∶1 的比例混合，置于密封玻璃瓶中，分別在40、60、80℃下避光加熱處理，根據(jù)降解速度間隔取樣，其中40℃時(shí)間隔5 h或10 h取樣，60℃時(shí)間隔1 h或2 h取樣，80℃時(shí)間隔0.5 h或1 h取樣。測(cè)定紅曲紅色素的濃度和殘留率。

采用分光光度法測(cè)定紅曲紅色素濃度。配制系列濃度（5 mg/L～30 mg/L）的Trp-RMPs或 Thr-RMPs水溶液，在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值A(chǔ)，以濃度C為橫坐標(biāo)，以吸光值A(chǔ)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程。根據(jù)待測(cè)樣品的吸光值，通過(guò)線性回歸方程計(jì)算Trp-RMPs和Thr-RMPs的濃度。

式中：Ct為樣品熱處理t小時(shí)后和處理前的紅曲紅色素濃度，mg/L；C0為樣品處理前的紅曲紅色素濃度，mg/L。

根據(jù)紅曲紅色素的殘留率，計(jì)算一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)的速率常數(shù)（k）和半衰期（t1/2）公式如下。

式中：t為熱處理時(shí)間，h；Ct為樣品熱處理t小時(shí)后和處理前的紅曲紅色素濃度，mg/L；C0為樣品處理前的紅曲紅色素濃度，mg/L。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)均重復(fù)3次，取其平均值，采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Trp-RMPs和Thr-RMPs的衍生化制備及分析

在pH 7.0條件下將紅曲橙色素分別與色氨酸和蘇氨酸進(jìn)行親氨基反應(yīng)，反應(yīng)完成后溶液的顏色由橙色變成亮紅色，其HPLC檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 紅曲橙色素及其與色氨酸、蘇氨酸反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC分析結(jié)果Fig.1 The HPLC results of orange Monascus pigments and theirs reaction products with Trp and Thr

由圖1可知，色氨酸衍生化的紅曲色素溶液中檢出了2種主要組分Trp-1和Trp-2（圖1B），蘇氨酸衍生化的紅曲色素溶液中檢出了2種主要組分Thr-1和Thr-2（圖 1C），在 300 nm～600 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)上述4種組分最大吸收峰均在520 nm左右（圖1E和圖1F），與觀察到的溶液顏色相符。

進(jìn)一步對(duì)色氨酸和蘇氨酸衍生化的紅曲色素溶液進(jìn)行了液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 紅曲橙色素及其與色氨酸、蘇氨酸反應(yīng)產(chǎn)物中各色素組分的液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析結(jié)果Fig.2 The liquid chromatography-mass spectrometry results of orange Monascus pigments and their reaction products with Trp and Thr

由圖2C和圖2D可知，Trp-1和Trp-2對(duì)應(yīng)的準(zhǔn)分子離子[M+H]+峰分別為（m/z）541和569。由圖2E和圖2F可知，Thr-1和Thr-2對(duì)應(yīng)的準(zhǔn)分子離子[M+H]+峰分別為（m/z）456 和 484。

根據(jù)親氨基反應(yīng)原理[4，21]，紅斑紅曲素（O1）、紅曲玉紅素（O2）與色氨酸、蘇氨酸反應(yīng)產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和分子量見(jiàn)圖3。

圖3 色氨酸、蘇氨酸同紅斑紅曲素（O1）、紅曲玉紅素（O2）的親氨基反應(yīng)產(chǎn)物Fig.3 The products by aminophilic reaction between Trp，Thr and rubropunctain（O1），monascorubrin（O2）

由圖3可知，色氨酸與紅斑紅曲素（O1）、紅曲玉紅素（O2）的反應(yīng)產(chǎn)物Trp-1和Trp-2，以及蘇氨酸與紅斑紅曲素（O1）、紅曲玉紅素（O2）的反應(yīng)產(chǎn)物Thr-1和Thr-2的分子量與反應(yīng)液的質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果相一致（圖2），表明該體外親氨基反應(yīng)成功地合成了色氨酸衍生化的紅曲紅色素和蘇氨酸衍生化的紅曲紅色素。

2.2 pH值對(duì)Trp-RMPs和Thr-RMPs顏色的影響

為了解Trp-RMPs和Thr-RMPs兩種紅曲紅色素的pH值穩(wěn)定性，對(duì)其在不同pH值條件下的顏色特征進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 Trp-RMPs和Thr-RMPs在不同pH值下的顏色和紫外可見(jiàn)吸收光譜圖Fig.4 The ultraviolet-visible spectrum of Trp-RMPs and Thr-RMPs at different pH and color

研究發(fā)現(xiàn)，2種主要紅曲紅色素組分紅斑紅曲胺和紅斑玉紅胺的pH值穩(wěn)定性較差，顏色會(huì)隨著pH值的變化而發(fā)生改變，在pH值小于4時(shí)，顏色為紫紅色，最大吸收波長(zhǎng)為530 nm；在pH值大于6時(shí)，顏色為紅色，最大吸收波長(zhǎng)為502 nm[18]。由圖4可知，Trp-RMPs和Thr-RMPs在pH 3～pH 7范圍內(nèi)感官顏色未發(fā)生明顯變化，均為亮紅色；紫外可見(jiàn)吸收光譜的形狀和最大吸收波也未發(fā)生明顯改變，與感官顏色一致。結(jié)果表明，Trp-RMPs和Thr-RMPs顏色的pH穩(wěn)定性?xún)?yōu)于2種主要紅曲紅色素組分紅斑紅曲胺和紅斑玉紅胺，在常見(jiàn)食品的pH值范圍內(nèi)顏色穩(wěn)定一致。

2.3 Trp-RMPs和Thr-RMPs在不同pH值下的熱穩(wěn)定性

為進(jìn)一步研究Trp-RMPs和Thr-RMPs在pH 3～pH 7范圍內(nèi)的熱穩(wěn)定性，其在40、60、80℃熱降解曲線見(jiàn)圖5～圖7，半衰期（t1/2）見(jiàn)圖8。

圖5 40℃時(shí)Trp-RMPs和Thr-RMPs的熱降解曲線Fig.5 Thermal degradation curve of Trp-RMPs and Thr-RMPs at 40℃

圖6 60℃時(shí)Trp-RMPs和Thr-RMPs的熱降解曲線Fig.6 Thermal degradation curve of Trp-RMPs and Thr-RMPs at 60℃

圖7 80℃時(shí)Trp-RMPs和Thr-RMPs的熱降解曲線Fig.7 Thermal degradation curve of Trp-RMPs and Thr-RMPs at 80℃

圖8 Trp-RMPs和Thr-RMPs在不同pH值和不同溫度下的半衰期（t1/2）Fig.8 The half-life of Trp-RMPs and Thr-RMPs at different pH and temperature

由圖5～圖7可知，在40、60、80℃的避光條件下加熱處理，Trp-RMPs和Thr-RMPs會(huì)發(fā)生不同程度的褪色現(xiàn)象，色素的殘留率隨加熱時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，-ln（Ct/C0）與時(shí)間 t呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（R2＞0.976 4），說(shuō)明Trp-RMPs和Thr-RMPs的熱降解遵循一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)規(guī)律。

由圖8可知，Trp-RMPs和Thr-RMPs的半衰期隨著溫度的升高而急劇下降。40℃時(shí)，Trp-RMPs在pH 3、pH 5和pH 7條件下的半衰期依次為34.15、49.51、63.01 h，Thr-RMPs在 pH 3、pH 5 和 pH 7 條件下的半衰期依次為30.54、47.48、62.44 h。當(dāng)溫度從40℃升高至60℃，Trp-RMPs在pH 3、pH 5和pH 7條件下的半衰期分別降低了80.32%、82.69%和81.64%，Thr-RMPs在pH 3、pH 5和pH 7條件下的半衰期分別降低了81.30%、83.38%和82.26%，當(dāng)溫度從40℃升高至80℃，Trp-RMPs在pH 3、pH 5和pH 7條件下的半衰期分別降低了93.91%、94.85%和92.21%，Thr-RMPs在pH 3、pH 5和pH 7條件下的半衰期分別降低了94.47%、95.03%和95.28%。結(jié)果表明，高溫能加速Trp-RMPs和Thr-RMPs的降解，因此在加工和儲(chǔ)藏過(guò)程，應(yīng)避免長(zhǎng)時(shí)間高溫處理。

由圖8可知，在相同溫度下，Trp-RMPs和Thr-RMPs的半衰期均隨著pH值的升高而呈增大趨勢(shì)，表明pH值對(duì)Trp-RMPs和Thr-RMPs的熱穩(wěn)定性有較大影響，在pH 3～pH 7范圍內(nèi)，pH值越高，穩(wěn)定性越好。pH值為3時(shí)，Trp-RMPs的半衰期顯著大于Thr-RMPs（p＜0.05），此時(shí) Trp-RMPs比 Thr-RMPs更穩(wěn)定；而在pH值為5和pH值為7時(shí)，Trp-RMPs和Thr-RMPs的半衰期無(wú)顯著差異（p＞0.05），二者的穩(wěn)定性差異不大。

3 結(jié)論

利用親氨基反應(yīng)，在體外成功合成了兩種紅曲紅色素衍生物：色氨酸衍生化的紅曲紅色素Trp-RMPs和蘇氨酸衍生化的紅曲紅色素Thr-RMPs。Trp-RMPs和Thr-RMPs呈亮紅色，在常見(jiàn)的食品pH值范圍內(nèi)，不隨pH值的變化而發(fā)生顏色改變。Trp-RMPs和Thr-RMPs對(duì)熱敏感，熱降解符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型，40℃～80℃范圍內(nèi)半衰期隨著溫度的升高而急劇下降，在加工與儲(chǔ)藏過(guò)程中應(yīng)避免長(zhǎng)時(shí)間高溫處理。pH值對(duì)Trp-RMPs和Thr-RMPs熱穩(wěn)定性的影響顯著，在pH 3～pH 7范圍內(nèi)，pH值越高，穩(wěn)定性越好，更適合應(yīng)用于弱酸性至中性的食品中。Trp-RMPs的熱穩(wěn)定性在pH 3時(shí)顯著高于Thr-RMPs，而在pH 5～pH 7時(shí)Trp-RMPs和Thr-RMPs的穩(wěn)定性相差不大。本研究結(jié)果可為為富含Trp-RMPs和Thr-RMPs的食品加工提供參考。