流式細(xì)胞術(shù)和病理骨髓活檢在非霍奇金淋巴瘤骨髓侵犯的診斷價(jià)值比較

楊雯雯，查艷芳，毛 菊，胡世蓮，程 民

非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin′s lymphoma，NHL)是造血系統(tǒng)常見的惡性腫瘤。根據(jù)GLOBOCAN統(tǒng)計(jì)，2020年中國NHL的年齡標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)病率為4.3/105，死亡率為2.4/105[1]。NHL發(fā)生骨髓侵犯為臨床分期的Ⅳ期，預(yù)后較差[2]，發(fā)生率按不同亞型為18%～80%[3]。對(duì)于骨髓侵犯的NHL病例，臨床多結(jié)合病理骨髓活細(xì)胞檢查、流式細(xì)胞術(shù)免疫分型檢查和骨髓形態(tài)學(xué)檢查等綜合診斷。而部分NHL骨髓局域性侵犯，受取材部位所限，病理檢查可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果。流式細(xì)胞術(shù)作為一種敏感而快速的細(xì)胞及微粒的定量分析技術(shù)，對(duì)于NHL的診斷、分型、分期以及殘存病灶的監(jiān)測(cè)已成為不可缺少的依據(jù)。本文通過分析同批NHL病例的流式細(xì)胞術(shù)免疫分型和病理骨髓活組織檢查骨髓侵犯結(jié)果，比較兩種方法的敏感度和特異度等檢驗(yàn)效能，以及不同分類的NHL骨髓侵犯發(fā)生率，為NHL診斷提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧分析2019年9月至2020年12月于安徽省腫瘤醫(yī)院腫瘤分子實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)淋巴瘤免疫分型的初診病例標(biāo)本資料253例，全部標(biāo)本均由流式細(xì)胞術(shù)作分型檢測(cè)，采用自制Excel登記表，收集住院號(hào)、床號(hào)、姓名、性別、年齡、醫(yī)囑時(shí)間、流式免疫分型結(jié)果等信息，另收集同批病例的病理骨髓活檢結(jié)果和臨床診斷。流式和病理實(shí)驗(yàn)均遵醫(yī)囑，不對(duì)病人造成額外創(chuàng)傷。共檢測(cè)NHL病例253例，其中男146例，女107例；年齡4～90歲，中位年齡57(56.56±15.59)歲，60歲以下139例，60歲及以上114例；B細(xì)胞淋巴瘤(B-NHL)189例，T/NK細(xì)胞淋巴瘤(T/NK-NHL)64例。

1.2 流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)和檢測(cè)方法 采集病人骨髓標(biāo)本，肝素抗凝，取20 μL標(biāo)本與380 μL溶血素震蕩混勻，靜置10 min；取10 μL臺(tái)盼藍(lán)與10 μL溶血后的標(biāo)本在計(jì)數(shù)儀中計(jì)算有核細(xì)胞數(shù)(N×103個(gè)/微升)；用含有0.1%NaN3和1%～2%BSA的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗液進(jìn)行前處理；采用兩步法進(jìn)行抗體標(biāo)記：第一步標(biāo)記CD19、CD45、CD20、CD10、Kappa、Lambda、CD4、CD3、CD8、CD7、CD2、CD5初篩，判斷侵犯與否以及B系或T系，第二步根據(jù)系別標(biāo)記CD19、CD22、CD79b、CD34、CD23、CD38、CD138、CD200、CD56、CD103、CD25、FMC7、ki-67(膜內(nèi))、bcl-2(膜內(nèi))或CD16、CD56、CD25、CD34、TdT(膜內(nèi))、CD3(膜內(nèi))、CD1a、CD57、CD38、TCR αβ、TCR γδ進(jìn)一步分析亞型；使用Beckman Coulter Navios多色流式細(xì)胞儀自動(dòng)獲取標(biāo)本，同時(shí)進(jìn)行電壓和補(bǔ)償調(diào)節(jié)，一般獲取10萬個(gè)有核細(xì)胞；使用Kaluza Analysis軟件對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，診斷參照WHO 2008年造血和淋巴組織腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)[4]。

1.3 病理骨髓活組織檢查方法 于病人髂后上棘處穿刺并抽取活組織標(biāo)本，標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋制片后切片做形態(tài)學(xué)觀察和免疫組織化學(xué)檢查，診斷參照WHO 2008年造血和淋巴組織腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)[4]。

1.4 結(jié)果判斷 以臨床診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，綜合骨髓病理、淋巴結(jié)病理、骨髓流式免疫分型、骨髓形態(tài)學(xué)、B超、PET-CT、基因、熒光原位雜交(FISH)等檢查判斷。

1.5 統(tǒng)計(jì)方學(xué)法 采用χ2檢驗(yàn)。靈敏度=真陽性/(真陽性+假陰性)×100%，特異度=真陰性/(真陰性+假陽性)×100%；正確率=(真陽性+真陰性)/總計(jì)；陽性預(yù)測(cè)值=真陽性/(真陽性+假陽性)×100%，陰性預(yù)測(cè)值=真陰性/(真陰性+假陰性)×100%。

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞術(shù)與病理骨髓活檢NHL骨髓侵犯結(jié)果 流式細(xì)胞術(shù)的靈敏度(91.67%)高于病理骨髓活檢(82.29%)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.16，P>0.05)，2種方法的特異度均為100.00%(見表1、2)。

表1 流式細(xì)胞術(shù)和病理骨髓活檢NHL骨髓侵犯結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果比較(n)

表2 流式細(xì)胞術(shù)和病理骨髓活檢的診斷效能(%)

2.2 流式細(xì)胞術(shù)、病理骨髓活檢和金標(biāo)準(zhǔn)的骨髓侵犯率比較 套細(xì)胞淋巴瘤(MCL)的骨髓侵犯發(fā)生率較高，分別為84.00%(金標(biāo)準(zhǔn))、80.00%(流式細(xì)胞術(shù))和68.00%(病理骨髓活檢)，彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)的骨髓侵犯發(fā)生率較低，分別為23.75%(金標(biāo)準(zhǔn))、22.50%(流式細(xì)胞術(shù))和22.50%(病理骨髓活檢)；慢性淋巴細(xì)胞白血病/小細(xì)胞淋巴瘤(CLL/SLL)的病理骨髓活檢與金標(biāo)準(zhǔn)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.28，P<0.01)；MCL、CLL/SLL、濾泡細(xì)胞淋巴瘤(FL)、B-NHL未分類的骨髓侵犯率，流式細(xì)胞術(shù)較病理骨髓活檢為高，而T/NK-NHL，流式細(xì)胞術(shù)檢出的骨髓侵犯率偏低(見圖1、2及表3)。

表3 3種方法檢測(cè)不同類型淋巴瘤的骨髓侵犯發(fā)生率[n；百分率(%)]

3 討論

淋巴瘤為一組起源于淋巴結(jié)和結(jié)外淋巴網(wǎng)狀組織的惡性腫瘤，以淋巴結(jié)腫大或局部腫塊為先發(fā)，后可累及骨髓造血系統(tǒng)。淋巴瘤可分為霍奇金淋巴瘤(HL)和NHL兩大類，NHL約占全部淋巴瘤的90%，發(fā)病率高于HL，從惰性到侵襲性，范圍廣泛[5]，發(fā)病較隱蔽，易誤診誤治。WHO對(duì)淋巴瘤的界定依賴多種信息，如病理學(xué)、形態(tài)學(xué)、免疫表型、遺傳學(xué)、臨床表現(xiàn)等[6]，結(jié)合這些信息進(jìn)行分類、分型以及分期，對(duì)治療方案的選擇和預(yù)后有重要的指導(dǎo)作用。

NHL骨髓侵犯為臨床分期的Ⅳ期，生存期短，預(yù)后差[7]。病理骨髓活組織檢查之免疫組織化學(xué)染色是診斷骨髓侵犯的主要手段之一，該檢測(cè)顯示CD20或CD3一種抗原表達(dá)為主時(shí)提示腫瘤細(xì)胞侵犯骨髓[8]。但局域性侵犯時(shí)，受髂骨取材所限，可能造成假陰性的結(jié)果[9]。本文中NHL的病理骨髓活檢的假陰性結(jié)果高于流式細(xì)胞術(shù)，檢測(cè)靈敏度較低。雙側(cè)骨髓活檢可提高檢出率，但多次侵入式取材對(duì)病人傷害較大。

流式細(xì)胞術(shù)是一種敏感而快速分析細(xì)胞及微粒的定量分析技術(shù)，其多參數(shù)相關(guān)分析可以對(duì)細(xì)胞固有的性質(zhì)以及細(xì)胞的標(biāo)記測(cè)定特征同時(shí)進(jìn)行分析，必要時(shí)還可同時(shí)測(cè)定胞漿內(nèi)抗原、核內(nèi)抗原等，可以從一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞混合體中識(shí)別出某一特定的細(xì)胞亞群。淋巴瘤免疫分型采用的抗原標(biāo)志是表達(dá)于正常造血細(xì)胞不同分化發(fā)育階段的分化抗原，正常造血細(xì)胞不同階段的抗原表達(dá)是受一系列基因嚴(yán)密控制的，在一定的分化階段哪些抗原表達(dá)上調(diào)，哪些抗原表達(dá)下調(diào)，以及抗原表達(dá)量的多少存在著明顯的規(guī)律性，一部分淋巴瘤細(xì)胞反映了這種分化模式；但腫瘤細(xì)胞經(jīng)常出現(xiàn)異常的抗原表達(dá)，這些異常表型可以作為診斷的重要標(biāo)志，流式細(xì)胞術(shù)據(jù)此界定異常細(xì)胞的系別(B或T/NK系)以及成熟程度(前體細(xì)胞或成熟細(xì)胞)，靈敏度高，更易發(fā)現(xiàn)較小的骨髓侵犯。本文中NHL的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果的靈敏度、準(zhǔn)確率和陰性預(yù)測(cè)值均高于病理骨髓活檢，特異度和陽線預(yù)測(cè)值與病理骨髓活檢相同，提示兩種檢測(cè)方法的誤診率均低，流式細(xì)胞術(shù)的漏診率更低。

本文中流式細(xì)胞術(shù)、病理骨髓活檢和金標(biāo)準(zhǔn)三種方法檢測(cè)不同類型淋巴瘤的骨髓侵犯率提示，B-NHL中，MZL 100%侵犯，可能與樣本量較少有關(guān)。MCL為一種侵襲性淋巴瘤，占NHL的3%～10%，預(yù)后不佳，易復(fù)發(fā)[10]，文獻(xiàn)[8,10-11]顯示其骨髓侵犯發(fā)生率為88%～100%，本研究中MCL的骨髓侵犯發(fā)生率為84.00%(金標(biāo)準(zhǔn))、80.00%(流式細(xì)胞術(shù))和68.00%(病理骨髓活檢)，前二者與文獻(xiàn)接近。DLBCL是一種成人淋巴瘤的常見類型，約占NHL的25.00%[12]，骨髓侵犯發(fā)生率不高，文獻(xiàn)[13]中約為11%～34%，本文中DLBCL的骨髓侵犯發(fā)生率為23.75%(金標(biāo)準(zhǔn))、22.50%(流式細(xì)胞術(shù))和22.50%(病理骨髓活檢)，與文獻(xiàn)一致。CLL/SLL的診斷參考MOREAU等[14]提出的積分系統(tǒng)，病理骨髓活檢與金標(biāo)準(zhǔn)相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與病例數(shù)及取材次數(shù)較少有關(guān)。T/NK-NHL常見于東亞和拉丁美洲，約占NHL的10%[15]，結(jié)外受累多于骨髓侵犯[16]，文獻(xiàn)中骨髓侵犯發(fā)生率約為35.80%[17]。T/NK-NHL分類較復(fù)雜，分類標(biāo)準(zhǔn)常依賴形態(tài)學(xué)或受累部位來源，流式細(xì)胞術(shù)出現(xiàn)假陰性可能由于少量淋巴瘤細(xì)胞易與反應(yīng)性T細(xì)胞混合，不易被檢出[18]，一般需要結(jié)合臨床癥狀和其他檢測(cè)作出判斷，較難獨(dú)立診斷，且部分特異性抗體如TCR系列價(jià)格高昂，國內(nèi)大多實(shí)驗(yàn)室無法負(fù)擔(dān)。本文中流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T/NK-NHL的骨髓侵犯發(fā)生率(29.69%)較病理骨髓活檢(32.81%)和金標(biāo)準(zhǔn)(32.81%)為低，有上述緣故。

綜上所述，NHL骨髓侵犯需參考多種檢測(cè)結(jié)果綜合判斷，流式細(xì)胞術(shù)較骨髓病理活檢的檢驗(yàn)效能更高，是一種靈敏、高效的檢測(cè)方法，B-NHL較T/NK-NHL更易檢出骨髓侵犯。