外周血單個核細胞TLR4基因表達水平與AS、RA病情活動性的關(guān)系分析

錢 臣，徐 揚，蔣逸秋

強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)、類風濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)均為臨床常見的慢性炎性自身免疫性疾病[1-2]，其具體發(fā)病機制均尚未闡明。TOLL樣受體4(TOLL-like receptors 4，TLR4)作為參與非特異性免疫的一類重要蛋白質(zhì)分子，是連接非特異性免疫與特異性免疫的橋梁，既往報道[3-4]顯示其在慢性免疫性炎癥疾病如AS、RA中扮演重要角色。但TLR4在AS、RA病人中的表達是否存在差異或與AS、RA的臨床與實驗室指標是否存在相關(guān)性尚缺乏明確報道。故本文擬測定TLR4基因在AS、RA病人中的表達情況及其與病情活動性、有關(guān)實驗室指標的關(guān)系?，F(xiàn)作報道。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年5月至2017年5月常州市武進人民醫(yī)院骨科確診的AS、RA病人各40例，分別為AS組、RA組；另選取30名同期入院體檢的健康志愿者為對照組。AS組中，男女性別比為3∶2，年齡28～67(44.92±9.55)歲，體質(zhì)量指數(shù)19～28(24.54±2.27)kg/m2，病程4～9(6.40±1.54)年；RA組中，男女性別比為5∶3，年齡35～70(48.59±10.61)歲，體質(zhì)量指數(shù)19～29(24.66±2.40)kg/m2，病程2～9(5.86±1.69)年；對照組中，男女性別比為3∶2，年齡29～65(45.88±9.75)歲，體質(zhì)量指數(shù)19～28(24.39±3.05)kg/m2。3組性別構(gòu)成比、年齡、體質(zhì)量指數(shù)差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，且AS組和RA組對應病程差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本次研究經(jīng)我院醫(yī)學倫理會審核通過。

1.2 對象納入及排除標準 納入標準：(1)性別不限，年齡18～70歲；(2)AS、RA組病人符合相關(guān)診斷標準[5]；(3)所有研究對象在知情本實驗研究的情況下簽署知情同意書。排除標準：(1)合并嚴重的心肝肺腎等重要臟器功能損傷及血液系統(tǒng)疾病；(2)既往長期服用解痙鎮(zhèn)痛類藥物、糖皮質(zhì)激素類藥物；(3)合并頸胸段后凸畸形或其他原因?qū)е碌年P(guān)節(jié)強直，重疊其他風濕性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征及嚴重骨關(guān)節(jié)炎等；(4)合并有感染、其他自身免疫性疾病、嚴重糖尿病、高血壓及嚴重肝腎疾??；(5)有精神、心理疾病或妊娠、哺乳期婦女。

1.3 病情評估 AS、RA病情活動性分別采用Bath強直性脊柱炎病情活動指數(shù)(Bath ankylosing spondylitis disease activity index，BASDAI)評分[6]、28個關(guān)節(jié)病情活動指數(shù)(disease activity score in 28 joints，DSA28)積分[7-8]評估，其中BASDAI評分≤4分、>4分分別為AS穩(wěn)定期、活動期；DAS28積分<2.6分、≥2.6分分別為RA穩(wěn)定期、活動期。

1.4 外周血單個核細胞TLR4 mRNA檢測 所有對象抽取空腹靜脈血3 mL，肝素抗凝，以Ficoll密度梯度離心處理提取單個核細胞，調(diào)整細胞數(shù)為5×109個/升，接種于24孔細胞培養(yǎng)板后置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。取1 mL培養(yǎng)后的細胞懸液，以TRIzol一步法提取總mRNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，取等量逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行TLR4 mRNA熒光定量PCR測定。反應條件：94 ℃預變性5 min后，94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30次循環(huán)；72 ℃延伸5 min后，4 ℃ 5 min。引物由大連Takara生物公司設計并合成，引物序列：上游5′-ACT TGG ACC TTT CCA GCA AC-3′，下游5′-TTT AAA TGC ACC TGG TTG GA-3′。取PCR產(chǎn)物置于2%瓊脂糖凝膠中，120 V電壓電泳30 min。以β-acttin與TLR4的吸光度比值作為TLR4 mRNA的相對表達量。

1.5 實驗室指標檢測 所有對象另抽取空腹靜脈血3 mL，室溫靜置20 min后進行離心處理，3 000 r/min離心20 min，離心半徑15 cm，收集上層血清標本置于-80 ℃冰箱保存統(tǒng)一待測。采用乳膠凝集試驗法測定血清類風濕因子(RF)水平，Western法測定血清紅細胞沉降率(ESR)水平，速率散射比濁法測定C反應性蛋白(C-reactive protein，CRP)水平，酶聯(lián)免疫吸附法測定白介素(Interleukin，IL)-17水平；另采用流式細胞儀檢測人白細胞抗原(HLA)-B27，結(jié)果在正常范圍(0～20%)內(nèi)為陰性，否則為陽性。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用t(或t′)檢驗、χ2檢驗、方差分析、q檢驗和Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 各組外周血單個核細胞TLR4 mRNA比較 外周血單個核細胞TLR4 mRNA表達水平比較，AS組>RA組>對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(見表1)。

表1 各組外周血單個核細胞TLR4 mRNA比較

2.2 穩(wěn)定期和活動期病人TLR4 mRNA的差異 AS組病人平均BASDAI評分為(5.10±1.85)分，包括穩(wěn)定期21例、活動期19例，TLR4 mRNA分別為0.19±0.04、0.26±0.08，差異有統(tǒng)計學意義(t′=3.44，P<0.01)；RA組病人平均DSA28積分為(4.24±0.99)分，包括穩(wěn)定期14例、活動期26例，TLR4 mRNA分別為0.14±0.03、0.20±0.05，差異有統(tǒng)計學意義(t=4.65，P<0.01)。

2.3 各組實驗室指標檢測結(jié)果比較 RA組血清ESR、RF、CRP、IL-17水平顯著高于AS組、對照組(P<0.01)；AS組ESR、CRP、IL-17水平顯著高于對照組(P<0.01)，RF與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；AS組HLA-B27陽性率顯著高于RA組、對照組；RA組、對照組HLA-B27陽性率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表2)。

表2 各組實驗室指標檢測結(jié)果比較

2.4 相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)性分析顯示，AS組病人中，外周血單個核細胞TLR4 mRNA表達與BASDAI評分及血清ESR、CRP、IL-17水平呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05～P<0.01)，與RF水平、HLA-B27陽性率無相關(guān)性(P>0.05)；RA組病人中，外周血單個核細胞TLR4 mRNA表達與DSA28積分及血清ESR、RF、CRP、IL-17水平呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05～P<0.01)(見表3)。

表3 AS及RA病人病情活動性相關(guān)實驗室指標與外周血單個核細胞TLR4 mRNA的相關(guān)性分析

3 討論

1994年就已在人體細胞中發(fā)現(xiàn)了TLRs，其分為胞膜外區(qū)、胞質(zhì)區(qū)和跨膜區(qū)三部分，是天然免疫系統(tǒng)中具有特異性的一類Ⅰ型跨膜受體及病原模式識別受體。既往報道[9-10]顯示，TLRs可識別并結(jié)合外源性或內(nèi)源性配體，組成復合物后活化TLR介導的信號轉(zhuǎn)導通路，誘導細胞分泌IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子及趨化型的細胞因子，發(fā)生免疫反應，啟動抗微生物防御。TLR4是人類發(fā)現(xiàn)的第一個TLRs相關(guān)蛋白，最初發(fā)現(xiàn)TLR4僅于髓源性細胞(如單核巨噬細胞)上表達，隨著研究的深入，許多學者發(fā)現(xiàn)心臟、呼吸道上皮細胞和軟骨細胞也均有TLR4的表達[11]。此后逐漸有報道論證了TLR4參與了機體多項病理生理過程，尤其在急性炎癥反應、細胞信號轉(zhuǎn)導及細胞凋亡中扮演了重要角色。對于慢性自身免疫性疾病而言，TLR4在系統(tǒng)性紅斑狼瘡病人外周血單個核細胞和滑膜組織中表達顯著升高，且其疾病的活動性與TLR4的上調(diào)密切相關(guān)。近年來，逐漸有學者[12-13]發(fā)現(xiàn)TLR4基因表達與AS、RA有關(guān)，TLR4主要表達于細胞膜表面，在滑膜細胞細胞中也有表達，可引起持續(xù)的炎性細胞激活，從而放大滑膜炎癥，加快RA[5]病情進展。國內(nèi)研究[14-16]中證實LPS/TLR4可激活NF-κB信號途徑，誘導炎癥反應，繼而加重RA，因此TLR4主要通過促進機體炎癥反應參與RA的發(fā)生發(fā)展。

本研究發(fā)現(xiàn)AS組、RA組、對照組外周血單個核細胞TLR4 mRNA表達水平存在明顯差異，AS組、RA組活動期病人TLR4 mRNA表達水平顯著高于穩(wěn)定期病人，證實了AS、RA病人外周血單個核細胞TLR4 mRNA表達明顯上調(diào)，AS上調(diào)尤其顯著，并可能與疾病活動性有關(guān)。分析原因為，AS肌腱附著點炎癥突出、RA滑膜組織炎性增生和炎癥細胞浸潤顯著，最終均可引起關(guān)節(jié)組織結(jié)構(gòu)的破壞與功能障礙，而且RA的發(fā)生發(fā)展與T細胞過度活化、B細胞過度刺激引起的大量自身抗體產(chǎn)生有關(guān)。TLR4具有跨膜信號轉(zhuǎn)導功能，能夠同時介導觸發(fā)髓樣細胞分化因子88的依賴性與非依賴性途徑，導致基因編碼的促炎細胞因子和趨化因子的激活。還有學者[17-19]認為，AS、RA病人外周血單個核細胞處于活化狀態(tài)，通過TLR4可啟動機體炎癥反應，合成和釋放炎癥因子，最終導致關(guān)節(jié)組織和骨組織的破壞。此外，肽聚糖、脂磷壁酸、脂多糖等外源性配體可與TLR4結(jié)合，增強IL-6、IL-17等促炎細胞因子和趨化因子在AS、RA病人滑膜成纖維細胞和外周血單個核細胞中的表達，繼而觸發(fā)關(guān)節(jié)軟骨的炎癥或退化。

本研究結(jié)果表明AS組病人外周血單個核細胞TLR4 mRNA表達與BASDAI評分及血清ESR、CRP、IL-17水平正相關(guān)，RA組病人外周血單個核細胞TLR4 mRNA表達與DSA28積分及血清ESR、RF、CRP、IL-17水平正相關(guān)，提示AS、RA病人外周血單個核細胞TLR4 mRNA表達與病情活動性及炎性指標具有相關(guān)性。但TLR4基因影響AS、RA病人病情活動性及炎性反應的具體機制還需進一步深入探討，相關(guān)結(jié)論仍需擴大樣本量、多中心的研究進一步論證。