皮膚源性前體細(xì)胞的分離及其向神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的誘導(dǎo)分化研究

蘆小剛，鮑全偉

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)后的功能恢復(fù)是醫(yī)學(xué)的難點(diǎn)之一，目前臨床尚無(wú)有效治療手段，有報(bào)道[1]稱(chēng)采用鞘內(nèi)注射甲潑尼龍方法治療不全性SCI獲得了一定療效。干細(xì)胞移植被認(rèn)為是修復(fù)SCI功能損傷最有前景的方法之一[2-5]。由于來(lái)源受限、組織相容性和倫理道德等方面的原因，胚胎干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞等在臨床的應(yīng)用前景受到一定的限制[3-5]。皮膚是機(jī)體最大的器官，位于體表，易于取材，目前已經(jīng)證實(shí)可從人、豬、山羊、小鼠和大鼠等真皮組織中分離到一種神經(jīng)嵴來(lái)源的前體細(xì)胞，即皮膚源性前體細(xì)胞(skin-derived precursors,SKPs)，在適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)條件下，向神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞有較高的分化率，顯示其在脊髓損傷修復(fù)中良好的應(yīng)用前景[4-7]。本研究擬觀察可否從截癱病人背部皮膚分離到SKPs，并能否被誘導(dǎo)為神經(jīng)元和施萬(wàn)細(xì)胞等神經(jīng)系細(xì)胞，以明確其在脊髓損傷病人的自體細(xì)胞移植中是否具有應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料 胰酶、Neurobasal培養(yǎng)基、胎牛血清、培養(yǎng)瓶等細(xì)胞培養(yǎng)用品購(gòu)自美國(guó)Hycolone公司，堿性細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2(fibroblast growth factor-2,FGF2)、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3(Neurotrophin-3,NT-3)購(gòu)自BD公司。維甲酸購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，heregulin β購(gòu)自R&D Systems公司，一抗抗fibronectin、nestin、vimentin、cytokeratin、CNPase、GFAP、βIII-tubulin和PE或FITC結(jié)合的二抗均購(gòu)自Santa-Cruz公司。Hoechst 33258購(gòu)自碧云天公司。

1.2 SKPs的分離培養(yǎng) 6例胸椎骨折伴截癱病人，其中男4例，女2例，年齡26～51歲；6例不伴截癱病人，其中男5例，女1例，年齡32～49歲；在進(jìn)行脊柱的手術(shù)時(shí)從切口邊緣切取0.5 cm×4 cm的皮膚，該操作均未影響病人切口愈合。在進(jìn)行此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)前，均告知病人實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，并簽署同意書(shū)。實(shí)驗(yàn)通過(guò)陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院臨床倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

獲得皮膚后，聚維酮碘消毒后磷酸緩沖液(phosphate-buffered saline,PBS)沖洗后組織剪將皮膚剪成1～2 mm3碎片，0.5%胰酶37 ℃消化4 h。然后去除表皮層，吹打后過(guò)濾離心收集細(xì)胞，加入含40 ng/mL FGF2和20 ng/mL EGF的Neurobasal培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。大約14 d后，可有懸浮細(xì)胞球生長(zhǎng)，進(jìn)行常規(guī)的傳代和擴(kuò)增。

1.3 SKPs向神經(jīng)系細(xì)胞的誘導(dǎo)分化 向神經(jīng)元分化的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為Neurobasal培養(yǎng)基+10%FBS+10 ng/mL BDNF+10 ng/mL NT-3+ 6 ng/mL維甲酸，向施萬(wàn)細(xì)胞分化的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為Neurobasal培養(yǎng)基+10%FBS+10 ng/mL heregulin β。收集第三代的SKPs并制備成細(xì)胞懸液后以3×104/cm2的密度接種到培養(yǎng)板中，使用的培養(yǎng)基為Neurobasal培養(yǎng)基+10%FBS。24 h后細(xì)胞大部分呈貼壁生長(zhǎng)，更換為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，以后每3 d左右更換一次誘導(dǎo)培養(yǎng)基。誘導(dǎo)約2周后進(jìn)行熒光免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)。

1.4 細(xì)胞免疫熒光組織化學(xué) 使用細(xì)胞免疫熒光組織化學(xué)檢測(cè)SKPs的細(xì)胞表型以及誘導(dǎo)后SKPs的分化情況。對(duì)于SKPs，將100 μL含SKPs的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到蓋玻片上，自然晾干后95%乙醇固定進(jìn)行組織化學(xué)檢測(cè)；對(duì)于誘導(dǎo)后的SKPs，直接95%乙醇固定進(jìn)行組織化學(xué)檢測(cè)。固定后，PBS漂洗3次，然后加非特異性封閉血清封閉后加一抗，4 ℃孵育過(guò)夜。PBS漂洗3次后加入相對(duì)應(yīng)的二抗，室溫孵育1 h。如果進(jìn)行雙標(biāo)，同樣的方法進(jìn)行第二種抗體的檢測(cè)。激光共聚焦顯微鏡或普通熒光顯微鏡觀察和攝像。為了計(jì)算每種抗原陽(yáng)性細(xì)胞的比例，用Hoechst 33258復(fù)染細(xì)胞核，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞占所用Hoechst 33258陽(yáng)性細(xì)胞的百分比。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 SKPs的形態(tài)觀察 從截癱及非截癱病人獲得皮膚進(jìn)行原代培養(yǎng)后的最初幾天內(nèi)，大多細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，只有少量原代細(xì)胞懸浮；約7 d后，出現(xiàn)懸浮細(xì)胞組成的小球狀細(xì)胞團(tuán)塊；12～14 d，懸浮的細(xì)胞球體積變大。此時(shí)，進(jìn)行常規(guī)的傳代和擴(kuò)增，可見(jiàn)細(xì)胞球得以成功擴(kuò)增。經(jīng)過(guò)3次擴(kuò)增后，從每個(gè)皮膚標(biāo)本可以獲得約3×105懸浮的細(xì)胞球，截癱病人和非截癱病人的SKPs形態(tài)大小差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)表1、圖1)。

表1 SKPs懸浮細(xì)胞球直徑大小比較

2.2 SKPs的細(xì)胞表型 通過(guò)細(xì)胞熒光組織化學(xué)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)從截癱和非截癱病人皮膚分離所得的SKPs均為Nestin和Fibronectin陽(yáng)性，Vimentin弱陽(yáng)性，Cytokeratin陰性(見(jiàn)圖2)，以Nestin陽(yáng)性的SKPs來(lái)計(jì)算SKPs總獲得率，截癱病人和非截癱病人的SKPs總獲得率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)表2)。

表2 Nestin陽(yáng)性細(xì)胞率情況[n；百分率(%)]

2.3 SKPs向神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的定向分化 經(jīng)過(guò)2周的誘導(dǎo)分化，可見(jiàn)從截癱和非截癱病人皮膚分離所得的SKPs均可被誘導(dǎo)為βⅢ-tubulin陽(yáng)性細(xì)胞(潛在的神經(jīng)元細(xì)胞，見(jiàn)圖3)和CNPase與GFAP共陽(yáng)性細(xì)胞(潛在的施萬(wàn)細(xì)胞，見(jiàn)圖4)。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析表明二者向神經(jīng)元和施萬(wàn)細(xì)胞分化的比率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)表3)。

表3 SKPs向神經(jīng)元細(xì)胞及施萬(wàn)細(xì)胞分化情況[n；百分率(%)]

3 討論

由于具有取材方便、來(lái)源豐富、可進(jìn)行自體移植等特點(diǎn)，皮膚來(lái)源的干細(xì)胞移植用于治療SCI具有神經(jīng)干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞等不具備的優(yōu)勢(shì)。目前，已有多種類(lèi)型的干細(xì)胞從皮膚中分離，如SKPs[4-7]、真皮間充質(zhì)多能干細(xì)胞[8]、表皮干細(xì)胞[9]、真皮纖維母細(xì)胞[10]等，它們均可在適當(dāng)?shù)臈l件在被誘導(dǎo)為神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞，在脊髓損傷等神經(jīng)損傷修復(fù)中有良好的應(yīng)用前景。但從誘導(dǎo)為神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的比率看，SKPs向神經(jīng)元和施萬(wàn)細(xì)胞分化的概率明顯高于其他幾種類(lèi)型的干細(xì)胞，這可能與其是神經(jīng)嵴來(lái)源有關(guān)[6-7]。將SKPs直接移植或誘導(dǎo)為施萬(wàn)細(xì)胞后移植到挫傷脊髓處，結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植后12周，移植的細(xì)胞存活，可減少脊髓損傷形成的空洞，再髓鞘化宿主的軸突，可吸引內(nèi)源性的SC到損傷局部，并伴有良好的神經(jīng)功能恢復(fù)[11]。因而，SKPs是自體細(xì)胞移植治療SCI的較好選擇。

在富含毛囊的面部和頭部皮膚中，SKPs數(shù)量眾多，分離較為容易。在背部皮膚中，神經(jīng)嵴來(lái)源的細(xì)胞局限于含膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)末梢等部位，數(shù)量相對(duì)較少[12]。本文的結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)3次傳代后，可獲得約3×105懸浮的細(xì)胞球，略低于從人面部和頭皮中獲得SKPs懸浮球的數(shù)量[13]。但由于背部皮膚可以在手術(shù)時(shí)從切口邊緣獲得，不會(huì)對(duì)病人造成二次創(chuàng)傷，較從面部和頭皮取材容易被病人接受。且截癱病人與非截癱病人背部皮膚均可獲得SKPs，其獲得率無(wú)明顯差異，這也為截癱病人自體干細(xì)胞移植提供了理論基礎(chǔ)。

SHERMAN等[6]使用含5%FBS的基礎(chǔ)培養(yǎng)基誘導(dǎo)SKPs，發(fā)現(xiàn)其向神經(jīng)元分化的概率約為6%，向膠質(zhì)細(xì)胞分化的概率約為10%(多為星形膠質(zhì)細(xì)胞)，而向施萬(wàn)細(xì)胞分化的能力極弱。而向誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入BDNF、NT3和維甲酸后，向神經(jīng)元分化的概率可增加到9.4%左右[7]。heregulin β是神經(jīng)嵴微環(huán)境的相關(guān)信號(hào)蛋白，將其加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基后，可增加SKPs向施萬(wàn)細(xì)胞的分化概率[9]。使用類(lèi)似的誘導(dǎo)條件，我們發(fā)現(xiàn)從截癱病人背部皮膚中分離所得的SKPs向神經(jīng)元分化的概率約為10.4%，向施萬(wàn)細(xì)胞分化的概率約為5.9%，同JOERY等[7，13]報(bào)道的分化概率接近，即截癱病人自體的SKPs在適當(dāng)條件誘導(dǎo)下仍然具有良好的分化潛能。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)可從截癱病人背部皮膚中分離得到SKPs，并可在適當(dāng)?shù)臈l件下被誘導(dǎo)為神經(jīng)元和施萬(wàn)細(xì)胞，表明在SCI自體細(xì)胞移植中具有良好的應(yīng)用前景。