外泌體介導(dǎo)的miR-18b-5p調(diào)控NEDD9對乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響

楊 碩，楊清玲

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一[1]，近年來綜合治療方法如治療乳腺癌的圍手術(shù)期化療和基因治療蓬勃發(fā)展，乳腺癌的療效有了很大提高，但是腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲的存在導(dǎo)致病人的生存率依然不高，深入研究促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和轉(zhuǎn)移的分子機制對病人的診斷和預(yù)后具有重要意義。microRNA(miRNA)的異常表達(dá)在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程中起到重要作用，miRNA是一種非常小的RNA分子，通過直接作用于mRNA的3′-UTR來抑制其表達(dá)[2]。miRNA即可作為一種致癌因子也可作為一種抑癌因子[3]，可以調(diào)控癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和凋亡等生物學(xué)活動[4]。miRNA-18b在結(jié)直腸癌[5]、卵巢癌[6]、乳腺癌[7]等腫瘤中異常表達(dá)的報道表明，其通過調(diào)節(jié)關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，影響腫瘤的增殖與侵襲，但其在乳腺癌中的作用及其基本的分子機制目前尚不完全清楚。

外泌體是一種細(xì)胞分泌的直徑40～100 nm的微小囊泡，可通過細(xì)胞分泌到受體，通過向靶細(xì)胞轉(zhuǎn)移各種生物活性分子如膜受體、蛋白質(zhì)、核酸(mRNA、miRNA及其他非編碼RNA)[8]作為信號分子傳遞給其他細(xì)胞，特別是外泌體可以攜帶參與癌細(xì)胞增殖、分化和凋亡的miRNA[9]，且外泌體中的特異性miRNA 水平升高與癌癥進(jìn)展有關(guān)[10]。如乳腺癌來源外泌體miR-448通過靶向NEAT1促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲[11]。但是，外泌體攜帶的miR-18b-5p在各類型癌癥中的作用鮮見探究。靶基因預(yù)測軟件發(fā)現(xiàn)神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)下調(diào)蛋白9(NEDD9)可能是miR-18b-5p的靶基因。已知NEDD9是一種轉(zhuǎn)錄因子，在多種類型的癌癥如乳腺癌[12]、膠質(zhì)瘤[13]等中發(fā)揮功能，抑制NEDD9表達(dá)會促進(jìn)腫瘤發(fā)生[14]。本研究探討乳腺癌細(xì)胞來源外泌體對乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，進(jìn)一步驗證乳腺癌細(xì)胞外泌體中的miRNA-18b-5p通過靶向調(diào)控NEDD9對乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的作用，從而為乳腺癌的治療及預(yù)后提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 乳腺癌上皮細(xì)胞MCF-10A和乳腺癌細(xì)胞株SKBR-3購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫；胎牛血清和DMEM高糖培養(yǎng)基購自Hlyclone公司；Trizol試劑和Lipofectamine2000購自Invitrogen公司；miR-18b-5p inhibitor、miR-18b-5p mimics 和靶向NEDD9的過表達(dá)載體以及PCR所用引物均購自上海GenePharma公司；熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)試劑購自Takara公司；所有引物合成由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；熒光素酶試劑盒(Promega,美國)；BCA 蛋白含量檢測試劑盒和細(xì)胞凋亡試劑盒(凱基，中國)；無外泌體血清(SBI，美國)；一抗CD63、TSG101、NEDD9及二抗購自Affinity公司；CCK8試劑盒購自吉瑪公司；Transwell小室購自Corning公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用紫杉醇誘導(dǎo)SKBR-3細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生，使SKBR-3細(xì)胞處于25 μg/mL的濃度中穩(wěn)定生長。乳腺癌細(xì)胞株接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5% CO2和95%飽和濕度條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。其乳腺癌細(xì)胞生長至細(xì)胞融合度達(dá)到60%～70%密度時，用無外泌體血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，48 h后，收集細(xì)胞上清液并儲存于-80 ℃直至實驗使用。

1.2.2 乳腺癌細(xì)胞外泌體的提取、分離及鑒定 正常乳腺癌上皮細(xì)胞MCF-10A及乳腺癌細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)到80%時，更換為無外泌體血清培養(yǎng)基。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液于室溫2 000 g 4 ℃離心30 min；收集上清液繼續(xù)在10 000 g 4 ℃ 離心30 min；最后得到上清液再100 000 g 4 ℃離心70 min。將沉淀重懸于1×PBS中，使用0.22 μm 孔徑過濾器過濾。繼續(xù)100 000 g 4 ℃離心70 min。棄去上清液，1×PBS重懸，放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用Western blotting檢測外泌體標(biāo)志物CD63和TSG101的表達(dá),對所提取的外泌體進(jìn)行分析。

1.2.3 Transwell實驗檢測miR-18b-5p對細(xì)胞侵襲和遷移的影響 SKBR-3/PR細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-18b-5p inhibitor后，提取外泌體，與SKBR-3細(xì)胞共培養(yǎng)。分組為:NC組和miR-18b-5p inhibitor組。取不同分組細(xì)胞100 μl置于上室，下室加入含10%胎牛血清的DMEM 600 μL,培養(yǎng)24 h取出小室，4%甲醛固定，吉姆薩染色并計數(shù)。

1.2.4 CCK-8法檢測乳腺癌細(xì)胞的增殖活性 將處于對數(shù)生長期的SKBR-3細(xì)胞接種于96 孔板(細(xì)胞密度為1×104個/孔)，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48和72 h后向每孔加入10 mL CCK-8溶液，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)3 d，根據(jù)CCK-8 試劑盒說明書檢測細(xì)胞增殖情況，酶標(biāo)儀檢測并記錄450 nm波長處吸光度值。

1.2.5 qRT-PCR檢測miR-18b-5p的表達(dá)水平 qRT-PCR 檢測MCF-10A細(xì)胞和2種乳腺癌細(xì)胞SKBR-3和SKBR-3/PR中miR-18b-5p表達(dá)水平。上述細(xì)胞中加入Trizol裂解液獲得總RNA。在提取總RNA時按照說明書進(jìn)行實時熒光定量PCR法，95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s，72 ℃ 34 s，40個循環(huán)。獲得的數(shù)據(jù)運用2-ΔΔCt的方法計算表達(dá)量。以U6作為內(nèi)參。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.6 Western blotting法檢測CD63、TSG101蛋白表達(dá) 收集處于對數(shù)生長期的SKBR-3細(xì)胞，加入RIPA裂解液，冰浴30 min，4 ℃條件下經(jīng)12 000 r/min離心30 min，提取細(xì)胞總蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度。取30 μg蛋白樣品與上樣緩沖液充分混勻后點樣進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉，加入CD63、TSG101一抗稀釋液(1∶1 000)，4 ℃孵育24 h，洗膜，加入二抗稀釋液(1∶2 000)室溫孵育2 h，ECL顯影，應(yīng)用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?首先將NEDD9 3′-UTR序列進(jìn)行擴增，構(gòu)建NEDD9野生型3′-UTR熒光素酶質(zhì)粒pmirGLO-WT和突變型質(zhì)粒pmirGLO-Mut。將pmirGLO-WT、pmirGLO-Mut與miR-18b-5p模擬物和陰性對照轉(zhuǎn)染進(jìn)SKBR-3細(xì)胞，24 h后去除培養(yǎng)基，以PBS清洗細(xì)胞3次，棄去PBS，每孔加入100 μL 被動裂解液，室溫下將培養(yǎng)板置于平板搖床上，輕微晃動15 min。待細(xì)胞裂解后，將每組20 μL樣本轉(zhuǎn)移至發(fā)光用96孔板上，并置于超級酶標(biāo)儀的檢測板上，分別分裝100 μL的LARⅡ和Stop&Glo試劑。測量時，使用1～2 s延遲和5～10 s讀數(shù)。如此循環(huán)操作直至所有樣本檢測完畢。使用酶標(biāo)儀配套軟件分析結(jié)果。相對熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。

1.2.8 Transwell實驗檢測NEDD9對細(xì)胞遷移和侵襲影響 對SKBR-3轉(zhuǎn)染 NEDD9過表達(dá)序列，實驗分為NC組和NEDD9過表達(dá)組。通過Transwell實驗檢測 NEDD9對細(xì)胞侵襲和遷移的影響。具體操作同前。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用t檢驗、單因素方差分析和q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 miR-18b-5p在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá) 與正常乳腺癌上皮細(xì)胞MCF-10A比較，乳腺癌細(xì)胞系中miR-18b-5p相對高表達(dá)(P<0.01)，其中在SKBR-3/PR細(xì)胞中表達(dá)量最高(P<0.01)(見表2)。

表2 在MCF-10A、SKBR-3和SKBR-3/PR細(xì)胞中miR-18b-5p表達(dá)水平比較

2.2 外泌體鑒定 外泌體組CD63和TSG101表達(dá)均高于對照組(P<0.01)(見表3)。

表3 外泌體蛋白標(biāo)志物CD63、TSG101的表達(dá)

2.3 轉(zhuǎn)染miR-18b-5p inhibitor對SKBR-3細(xì)胞遷移能力的影響 與NC組比較，轉(zhuǎn)染了miR-18b-5p inhibitor的SKBR-3/PR細(xì)胞外泌體組SKBR-3細(xì)胞侵襲與遷移能力明顯降低(P<0.01)(見表4),表明下調(diào)miR-18b-5p 能抑制SKBR-3細(xì)胞侵襲、遷移能力。

表4 miR-18b-5p inhibitor對SKBR-3細(xì)胞遷移能力的影響

2.4 轉(zhuǎn)染miR-18b-5p inhibitor 對SKBR-3細(xì)胞增殖的影響 相對于NC組，轉(zhuǎn)染了miR-18b-5p inhibitor的SKBR-3/PR細(xì)胞外泌體組抑制細(xì)胞的增殖(P<0.01)(見表5)，表明下調(diào)miR-18b-5p可抑制SKBR-3細(xì)胞增殖能力。

表5 miR-18b-5p inhibitor對SKBR-3細(xì)胞的增殖抑制作用

2.5 miR-18b-5p靶向調(diào)控NEDD9 生物信息學(xué)軟件 Target Scan 預(yù)測結(jié)果顯示，NEDD9 3′UTR上存在潛在的與 miR-18b-5p 靶向結(jié)合的位點(見圖1)，說明NEDD9可能是miR-18b-5p的靶基因。根據(jù)雙熒光素酶活性檢測結(jié)果顯示，與NC組比較，miR-18b-5p mimic組wt-NEDD9細(xì)胞中熒光素酶活性降低(P<0.05)，而mut-NEDD9細(xì)胞中熒光素酶活性不受影響(P>0.05)(見表6)。

表6 雙熒光素酶報告實驗

2.6 過表達(dá)NEDD9對SKBR-3侵襲、遷移能力的影響 與NC組比較，NEDD9過表達(dá)組侵襲的細(xì)胞與遷移能力明顯降低(P<0.01)(見表7)，過表達(dá)NEDD9能夠顯著抑制SKBR-3細(xì)胞侵襲、遷移能力。

表7 過表達(dá)NEDD9對SKBR-3侵襲、遷移能力的影響

3 討論

乳腺癌是成年女性最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率較高，也是女性最常見的死亡原因之一[14]。雖然通過化療使非轉(zhuǎn)移性病人5年存活率達(dá)到60%～70%，但因化療藥物不良反應(yīng)較大并且容易發(fā)生耐藥，所以找到一種更有前途的治療策略是非常迫切和必要的。外泌體近年來成為研究熱點，其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移過程中起到重要作用。腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體攜帶特異性小分子或RNA，能夠影響其他細(xì)胞的生物學(xué)功能，從而調(diào)節(jié)癌癥進(jìn)程[15]。miRNAs 因其能夠作為癌癥生物標(biāo)志物，以及與腫瘤發(fā)生、細(xì)胞增殖、分化和凋亡等多種生理和病理發(fā)展密切相關(guān)而備受關(guān)注[16-17]。同時靶向關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因和異常表達(dá)的miRNA可能是預(yù)防惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的有效策略，因此miRNA可充當(dāng)一種有效的分子靶向藥物對腫瘤進(jìn)行治療[18]。研究[19]表明miR-18b-5p在膽囊中過表達(dá)并作為轉(zhuǎn)移形成的重要介質(zhì)。XUE等[6]發(fā)現(xiàn)miR-18b-5p在卵巢癌中呈過表達(dá)并靶向VMA21促進(jìn)腫瘤的增殖、侵襲和遷移。LI等[5]提出上調(diào)miR-18b-5p可通過下調(diào)Akt途徑促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長，而miR-18b-5p在乳腺癌中的表達(dá)及作用有待研究。

本研究通過qRT-PCR檢測了miR-18b-5p在乳腺癌細(xì)胞SKBR-3和SKBR-3/PR和正常乳腺癌上皮細(xì)胞MCF-10A中的表達(dá)情況，結(jié)果表明miR-18b-5p在2種乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平均明顯增高，隨后選取SKBR-3/PR細(xì)胞提取外泌體，并將外泌體與SKBR-3細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-18b-5p inhibitor外泌體對SKBR-3細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力顯著降低，表明miR-18b-5p具有調(diào)控SKBR-3細(xì)胞的能力。Target Scan靶基因預(yù)測軟件證明NEDD9是miR-18b-5p的靶基因之一，熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果表明miR-18b-5p通過靶向結(jié)合NEDD9的3′-UTR，繼而抑制了NEDD9的表達(dá)，提示NEDD9可能是乳腺癌潛在的治療靶點。過表達(dá)NEDD9可抑制乳腺癌細(xì)胞SKBR-3的侵襲與遷移能力。因此，外泌體中的miR-18b-5p可能通過靶向NEDD9調(diào)控乳腺癌SKBR-3細(xì)胞增殖、侵襲、遷移。NEDD9是核受體家族的一員，在肺癌組織與肺癌細(xì)胞系中低表達(dá)，而且 NEDD9的減少與腫瘤進(jìn)展和肺癌預(yù)后不良有關(guān)[20]。WANG等[21]研究表明 NEDD9 可以調(diào)節(jié)并控制肝癌的侵襲。同時，有研究[22]發(fā)現(xiàn)，NEDD9在胃癌中呈低表達(dá)并抑制胃癌細(xì)胞增殖。miRNA通常通過靶向調(diào)控下游mRNA，影響其在細(xì)胞中的水平，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)功能。本研究證實了外泌體miR-18b-5p可靶向調(diào)控NEDD9。由于NEDD9介導(dǎo)了細(xì)胞的接觸抑制作用，抑制了腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和增殖，因此 NEDD9蛋白表達(dá)被抑制后乳腺癌細(xì)胞的增殖與侵襲能力增強，促進(jìn)了乳腺癌的轉(zhuǎn)移。

綜上所述，miR-18b-5p在SKBR-3/PR來源的外泌體中高表達(dá)，外泌體通過上調(diào)SKBR-3 細(xì)胞中miR-18b-5p水平靶向抑制NEDD9表達(dá)，促進(jìn)SKBR-3細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲，因此miR-18b-5p可能是乳腺癌治療的潛在分子靶點，為乳腺癌的診斷和治療帶來了積極影響。