牡丹花瓣凍干粉極細粉細胞破壁率的測定及營養(yǎng)成分分析

李雨欣，李 捷，謝艷華，羅歡歡，武俊生，林 奮，王四旺

(1.西北大學 生命科學與醫(yī)學部,陜西 西安 710069;2.空軍軍醫(yī)大學 中藥與天然藥物學教研室,陜西 西安 710032;3.陜西鳳丹正元生物科技有限公司,陜西 西安 710077)

牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)是毛茛科、芍藥屬植物,為多年生落葉灌木,別稱鼠姑、富貴花,是我國的國花,“花中之王”[1-2]。其觀賞價值極高[3], 千百年來深受中國人民的喜愛, 是我國傳統(tǒng)名貴花卉之一。 現(xiàn)代研究表明， 牡丹花還具有較高的可食用價值[4]。 牡丹花瓣制成的鮮花餅[5], 牡丹花炮制成的花茶[6], 牡丹花釀成的花酒[7], 深受人們的青睞。 在人口日益增漲的今天, 資源利用問題, 是擺在我們面前不容忽視的問題。 破壁率是提高生物利用度, 減少資源浪費必不可少的手段。 因此, 本實驗采用顯微定量和目測法[8-10], 以牡丹花瓣冷凍干燥細粉及其低溫破壁粉碎極細粉為受試物, 對其完整薄壁細胞進行計數(shù), 測定破壁率; 進行牡丹花瓣凍干粉主要營養(yǎng)成分含量測定, 有助于牡丹花資源進一步開發(fā)利用。

1 主要材料

1.1 試樣

牡丹花瓣凍干粉(DF),批號20190325,試樣均由陜西鳳丹正元生物科技有限公司提供。

1.2 試劑

水合氯醛、 氫氧化鈉、 硫酸銅、 碳酸氫鈉和甘油等(天津富宇化工)； 色譜甲醇(Fishers, 批號110301)、葡萄糖、3,5-二硝基水楊酸、碘、碘化鉀(天津科密歐化學試劑公司)；標準抗壞血酸和FeSO4標準品(中國藥品生物制品檢定所)；銅、鐵、鋅、錳標準儲備液(上海分析試劑有限公司)，均為分析純。

1.3 儀器

移液槍(德國Eppendorf公司);振動微粉碎機(SYFM-8型,濟南松岳機器有限責任公司)；顯微鏡(CX41型,奧林巴斯)；電子分析天平(BL310型,德國Sartorius公司);超聲波清洗儀(SBS-200型,上海必能信超聲儀器有限公司);凱式定氮儀(ATN-100型,上海洪紀儀器設備有限公司);快速水分測定儀(MB45型,美國奧豪斯);全自動脂肪測定儀(XD-SXT-210型,上海析達儀器有限公司);馬弗爐(KSX1700型,北京西尼特科技有限公司);微量元素分析儀(TC-3010C型,山東濟寧天成電子科技有限責任公司);高效液相色譜(LC-0AT，島津);JADE-PAKPEP色譜柱(250×4.6 mm,5 μm);紫外可見分光光度計(Alpha-1860A型,上海譜元儀器有限公司)。

2 方法與結果

2.1 樣品的制備

新鮮牡丹花瓣采摘自陜西省合陽地區(qū),低溫條件下,粉碎—冷凍干燥—粉碎—過80目篩,備用;牡丹花瓣凍干粉超細粉碎極細粉(CF)系取自DF，再使用低溫超微破壁粉碎機粉碎,過300目篩,得極細粉。

2.2 CF細胞破壁率測定

2.2.1 DF細胞計數(shù)及其標準曲線的繪制 精密稱取0.102 0,0.291 4,0.512 2,0.713 2,0.887 6,1.134 9 g DF,將DF分別放入25 mL的容量瓶中,加水合氯醛、超聲處理10 min,使DF分散均勻,定容至刻度。將DF液精密吸出30 μL,裝片應無氣泡,顯微鏡(40×)觀察。DF顯微特征包括薄壁細胞、導管、腺毛、花粉粒(見圖1)。它的薄壁細胞顯微鏡下觀察方便,可作為測定破壁率的檢測指標,即以DF中完整的薄壁細胞作為計數(shù)指標(1個視野為1個計數(shù)單位,每個濃度的溶液取8個計數(shù)單位的平均值),結果見表1。取DF的稱樣量為橫坐標,每個計數(shù)中完整的薄壁細胞平均數(shù)為縱坐標,繪制標準曲線,得回歸曲線方程Y=5.098 6x+1.822 4,R2=0.975 2,說明DF中的薄壁細胞在0.102 0～1.134 9 g范圍內線性關系良好,可用來作為顯微特征計數(shù)。

2.2.2 DF細胞的檢測計數(shù)方法學考察

1) 精密度實驗:精密稱取0.713 2 g DF,同方法制片,對6個視野進行了觀測,相對標準差(RSD)為9.80 %,表明該方法具有良好的精密度。

2) 穩(wěn)定性實驗:同方法制片,在顯微鏡下觀察0、3、6、9、12 h,每個時間點取3個視野平均值,分別計算5個時間點的相對標準差(RSD)為9.35 %,表明DF混懸劑在12 h內比較穩(wěn)定。

3) 重復性實驗:在常溫條件下放置同批DF 6份,在顯微鏡(40×)下觀察,6份相對標準差(RSD)為7.90 %,表明該方法重復性較好。

A 薄壁細胞; B 導管; C 腺毛; D 花粉粒圖1 DF顯微特征(400×)Fig.1 DF microscopic characteristics (400×)

CF細胞破壁率的檢測:分別取DF與CF,精密稱取,同法制片,于顯微鏡下觀察。分別觀察25個視野(代表性視野如圖2，3所示),按公式(1)計算DF和微粉CF的顯微特征個數(shù)。牡丹花瓣粉顯微特征(薄壁細胞)個數(shù)計算的相關參數(shù)(n=25),結果見表2。經計算可得CF的破壁率為100 %。

(1)

其中:X為每個蓋玻片下的薄壁細胞特征數(shù);V為牡丹花瓣粉混懸液總體積(mL);V′為蓋玻片下混懸液體積(mL);W為牡丹花瓣粉稱重量(mg)。再根據(jù)DF和CF的顯微特征個數(shù),按公式(2)計算細胞破壁率:

Y=(A-B)/A×100 %

(2)

其中：Y為細胞破壁率;A為DF顯微特征個數(shù);B為CF顯微特征個數(shù)。

圖2 DF顯微計數(shù)(200×)Fig.2 DF microscopic counting(200×)

圖3 CF顯微計數(shù)(200×)Fig.3 CF microscopic counting(200×)

2.3 牡丹花瓣凍干粉營養(yǎng)成分含量測定

2.3.1 常規(guī)理化指標測定方法 蛋白質測定方法按照GB 5009.5—2016[11]第一法;水分測定方法按照GB 5009.3—2016[12]第一法;脂肪測定方法按照GB 5009.6—2016[13]第一法;總灰分測定方法按照GB 5009.4—2016[14]第一法;鉛、砷、汞、鎘、鉻、鈦、銅、銻、硒、猛、鐵測定方法按照GB 5009.268—2016[15]第一法;維生素A、維生素E測定方法按照GB 5009.82—2016[16];維生素C測定方法按照GB 5009.86—2016[17]。

2.3.2 營養(yǎng)成分測定結果 如表3所示,蛋白質、水分、總灰分含量相對較高,脂肪含量偏低；維生素A、維生素E未檢出,維生素C含量最高。維生素C具有很好的抗氧化作用、抗壞血酸活性,是人體不可或缺的一類維生素。綜上,牡丹花瓣凍干粉具有一定的營養(yǎng)價值,可作為藥食同源物質進行開發(fā)利用。

2.3.3 礦物元素測定結果 由表4可知，鉛的含量超過國家規(guī)定的0.1 mg/kg,鉻未檢出,其他重金屬元素符合國家規(guī)范。從微量元素角度看,牡丹花瓣粉富含多種人體必需元素如鈦、銅、銻、硒、錳、鐵,牡丹花瓣粉如果直接作為食品使用,可能影響人體的健康。

表4 礦物元素測定結果Tab.4 Determination results of mineral elements

3 討論

本文首次對牡丹花瓣粉進行細胞破壁率的測定,以牡丹花瓣粉完整的薄壁細胞為特征計數(shù)物,用細胞計數(shù)法和目測法考察超細粉碎對牡丹花瓣細胞破壁率的影響,方法簡便,結果可靠,可用于CF破壁率的檢測。對于牡丹花瓣破壁的必要性還需大量的實驗證明,對其化學成分的含量分析,動物實驗的模型建立,未來應進一步完善。

結果表明,牡丹花瓣粉中的脂肪和灰分含量均處于較低水平,蛋白質含量相對較高；牡丹花瓣凍干粉中具有大量的維生素C,還富含人體必需元素如鈦、銅、銻、硒、錳、鐵,具有較高的營養(yǎng)價值和食用價值,但其鉛超過了國家規(guī)范標準。因此,在牡丹花瓣粉的開發(fā)利用過程中,應采取工藝規(guī)范鉛含量,才能開發(fā)成產品,供人體食用。牡丹花瓣作為富含微量元素的天然植物產品，它的開發(fā)仍有很多工作亟待開展。