芩補(bǔ)牙周緩釋凝膠的制備及藥劑學(xué)研究

劉 瑾, 仇冬冬, 孫俊毅,3,楊冬梅,裴丹丹,4,茍建重,李 昂

(1.西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院 陜西省顱頜面精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西 西安 710004; 2.西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院 牙周科,陜西 西安 710004;3.西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院 特診特需科,陜西 西安 710004; 4.西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院 修復(fù)科,陜西 西安 710004)

藥物應(yīng)用是牙周炎治療不可或缺的輔助手段,其中，中藥治療可避免西藥長(zhǎng)期使用造成的口腔菌群失調(diào)和細(xì)菌耐藥性,同時(shí)具備效果穩(wěn)定、副作用小、多靶點(diǎn)治療等優(yōu)點(diǎn),成為現(xiàn)代中醫(yī)藥研究的熱點(diǎn)之一[1-3]。研究表明,黃芩、骨碎補(bǔ)等中藥煎煮劑可明顯改善牙周炎癥狀下的菌群失調(diào),促進(jìn)牙周組織新附著形成[4]。黃芩、骨碎補(bǔ)的有效成分與其他中藥配伍用藥可明顯降低牙周炎大鼠齦溝液、唾液及血液中PGE2和CRP水平，促進(jìn)局部牙槽骨再生[5-8]。本課題組在前期研究中也發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合應(yīng)用骨碎補(bǔ)中的活性成分柚皮苷與黃芩中的活性成分黃芩素，可明顯增強(qiáng)人牙周膜細(xì)胞 (human periodontal ligament cells, hPDLCs) 的增殖、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性并促進(jìn)礦化[9]。

局部緩釋制劑作為牙周局部藥物治療的重要方式,是指將藥物置于牙周袋內(nèi)緩慢釋放以減少給藥次數(shù)，提供比較平穩(wěn)的藥物濃度制劑。在目前常用的幾種牙周緩釋劑型中,原位凝膠制劑因具有使用方便、患者感覺舒適、藥物活性穩(wěn)定、流動(dòng)性好等特點(diǎn)，較為廣泛地應(yīng)用于臨床[10-13]。

因此, 本研究通過檢測(cè)不同中藥配比下hPDLCs產(chǎn)生ALP的含量,獲得黃芩提取物與骨碎補(bǔ)提取物最佳配伍質(zhì)量比;進(jìn)一步制備芩補(bǔ)中藥緩釋凝膠,并通過對(duì)形態(tài)學(xué)、pH值、流變學(xué)、穩(wěn)定性、回收率及藥物體外釋放率等指標(biāo)的考察,篩選藥物最佳緩釋濃度,為進(jìn)一步考察芩補(bǔ)中藥緩釋凝膠用于實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型體內(nèi)治療的藥效學(xué)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

倒置相差顯微鏡(Nikon,日本);TL-40B低速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);78HW-1恒溫磁力攪拌器(杭州儀表電機(jī)廠);AA-250電子分析天平(Denver,美國(guó));LC-2010高效液相色譜儀(日本島津);SB5200DTD型超聲震蕩儀(寧波新芝生物科技股份有限公司);KDC-16H高速離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司);酸度計(jì)PHS-3C(雷磁,上海)。

1.2 試藥

骨碎補(bǔ)提取物(四川中藥研究所,活性成分柚皮苷含量30.71%);黃芩提取物(陜西飛達(dá)生物有限公司,活性成分黃芩素含量80%);DMEM/F12(Dulbecco eagle′s minimum essential medium,DMEM);I型膠原酶、L-抗壞血酸-2-磷酸鹽(Sigma公司,美國(guó)); 胎牛血清 (fetal bovine serum,FBS,Gibco公司,美國(guó)); 胰蛋白酶(1∶10)(Hyclone公司,美國(guó)); L-谷氨酰胺(華美生物工程公司); Antibiotic-Antimycotic (Atlanta Biologicals公司,美國(guó));SABC 免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒、角蛋白單克隆抗體、波形蛋白單克隆抗體(博士德,武漢); 羥乙基纖維素(hydroxyethyl cellulose,HEC,天津愛勒易醫(yī)藥材料有限公司);聚丙烯酸樹脂(Eudragit RS PO,羅姆公司);甘油(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);三乙酸甘油酯(glycerol triacetate,GTA,北京精求化工有限責(zé)任公司)。

2 方法

2.1 黃芩、骨碎補(bǔ)提取物溶液配制

分別稱取黃芩提取物、骨碎補(bǔ)提取物1 mg,用DMSO溶解成母液,過濾備用。用含10%FBS的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基配制成終濃度為黃芩提取物(以黃芩素為濃度監(jiān)測(cè)指標(biāo))100、10、1.0、0.l、0.01 mg·L-1的溶液;骨碎補(bǔ)提取物(以柚皮苷為濃度監(jiān)測(cè)指標(biāo))10、1.0、0.l mg·L-1的溶液,過濾除菌備用。

DMEM 培養(yǎng)基的配比:在超凈臺(tái)中,于成品DMEM培養(yǎng)基中加入10%的FBS,1%三抗,1% L-谷氨酰胺,1%Vitamin C,混勻,封口膜封口,4℃保存。

2.2 hPDLCs培養(yǎng)及鑒定[14]

在患者及家屬知情同意下, 選取 12～29 歲患者的健康正畸牙或阻生牙, 所選牙齒均無齲壞、 根尖周炎及牙周炎, 術(shù)前根尖片顯示所拔除牙齒根尖無明顯骨質(zhì)吸收、 牙周膜清晰完整。 采用酶消化結(jié)合組織塊法進(jìn)行hPDLCs原代培養(yǎng): 拔牙后立即放入無菌含雙抗的PBS液中， 轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)后反復(fù)沖洗牙冠及牙根表面, 用無菌刀片刮除根中1/3牙周膜組織并剪碎, 11 200 r·min-1離心5 min, 移至小培養(yǎng)皿, 加入3 mg·mL-1Ⅰ型膠原酶1 mL,恒溫消化30 min。加入DMEM,1 000 r·min-1離心3 min,棄上清,加入含體積分?jǐn)?shù)為20%FBS、三抗的DMEM培養(yǎng)基5 mL,吹打混勻移入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng), 3～4 d 換液去除未貼壁組織, 倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。 待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底約80%, 即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。 將第3代hPDLCs制備成細(xì)胞爬片,HE 染色和sABC免疫組化染色后在光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),進(jìn)行細(xì)胞鑒定。

2.3 ALP法檢測(cè)黃芩、 骨碎補(bǔ)提取物復(fù)方對(duì)hPDLCs成骨的影響

單味藥物實(shí)驗(yàn)分組

1) 黃芩提取物組:黃芩素(100、10、1.0、0.l、0.01 mg·L-1)；

2) 骨碎補(bǔ)提取物組:柚皮苷(10、1、0.1 mg·L-1)。

復(fù)方藥物實(shí)驗(yàn)分組

1) 1.0 mg·L-1黃芩提取物+骨碎補(bǔ)提取物(10、1、0.1 mg·L-1)；

2) 0.1 mg·L-1黃芩提取物+骨碎補(bǔ)提取物(10、1、0.1 mg·L-1)；

3) 0.01 mg·L-1黃芩提取物+骨碎補(bǔ)提取物(10、1、0.1 mg·L-1)。

取第 4 代 hPDLCs, 消化后調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105mL-1,按照每孔200 μL 細(xì)胞懸液接種于96 孔板,標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下孵育24 h。按照上述分組外加1個(gè)陰性對(duì)照組,每組4個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)組每孔加藥物培養(yǎng)液200 μL,對(duì)照組為 DMEM 液(含10%FBS)。作用5 d 后, 收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。 按照ALP試劑盒使用說明,在測(cè)定管、標(biāo)準(zhǔn)管、空白管中加入顯色劑1.5 mL混勻后,空白管調(diào)零,在波長(zhǎng)520 nm下,用紫外分光光度儀測(cè)定各管吸光度(A520)值,再換算出各個(gè)樣本 ALP 的活性,并采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件做獨(dú)立樣本單因子變異數(shù)分析。

2.4 芩補(bǔ)中藥緩釋凝膠的制備

以羥乙基纖維素、甘油、聚丙烯酸樹脂、三乙酸甘油酯為主要輔料，分別制備了濃度為2%、4%、6%的芩補(bǔ)中藥緩釋凝膠(即黃芩、骨碎補(bǔ)提取物復(fù)方占總凝膠成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%、4%、6%)。制備過程如下:

1) 取處方量的甘油保持90℃～100℃恒溫,加入處方量羥乙基纖維素,高速攪拌至完全溶解后降溫至45℃～50℃,按質(zhì)量比1∶1的比例加入處方量黃芩、骨碎補(bǔ)提取物,低速攪拌至溶解;

2) 另取處方量的三乙酸甘油酯保持45℃～50℃恒溫,攪拌下加入處方量聚丙烯酸樹脂,至完全溶解后,低速攪拌加入到步驟1)中,45℃～50℃保溫條件下攪拌至均質(zhì)即得芩補(bǔ)中藥緩釋凝膠。

2.5 芩補(bǔ)中藥緩釋凝膠制劑學(xué)考察

2.5.1 形態(tài)學(xué)考察 按2.4方法制備芩補(bǔ)中藥緩釋凝膠,觀察其物理性狀。

2.5.2 pH值考察 取緩釋凝膠0.5 g,置于50 mL純化水中,靜置1～7 d,使用酸度計(jì)每日檢測(cè)pH值。

2.5.3 穩(wěn)定性考察

1) 冷凍試驗(yàn):將復(fù)方中藥緩釋凝膠置于-20℃冰箱,24 h后復(fù)融,觀察凝膠有無分層及顏色改變。

2) 加熱試驗(yàn):將復(fù)方中藥緩釋凝膠置于50℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)3個(gè)月,觀察凝膠有無分層及顏色改變。

3) 離心試驗(yàn):將復(fù)方中藥緩釋凝膠置于離心管中,3 500 r·min-1離心30 min,觀察凝膠是否分層。

4) 流動(dòng)性試驗(yàn):采用目測(cè)方法,觀察不同濃度復(fù)方中藥緩釋凝膠的流動(dòng)性。

2.5.4 體外釋放率的測(cè)定 色譜條件:色譜柱(shimadzu VP-ODS 柱),流動(dòng)相：甲醇∶水(體積分?jǐn)?shù)0.4%冰醋酸,體積分?jǐn)?shù)0.2%三乙胺)=40∶60,流速0.8 mL·min-1,柱溫37℃,檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，進(jìn)樣量10 μL。

對(duì)照品配置:分別精密稱取柚皮苷、黃芩素標(biāo)準(zhǔn)品10 mg置10 mL容量瓶中,加甲醇溶解并定容,搖勻作為對(duì)照品貯備液。

1) 系統(tǒng)適應(yīng)性考察:精密吸取對(duì)照品溶液、藥物緩釋液、空白凝膠緩釋液各10 μL,在上述色譜條件下檢測(cè)。

2) 線性試驗(yàn):分別吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL的對(duì)照品貯備液于10 mL容量瓶中,用甲醇將其稀釋成10、20、30、40、50 μg·mL-1的系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別進(jìn)樣測(cè)定,記錄色譜圖,進(jìn)行線性分析。以峰面積A為橫坐標(biāo),濃度C為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸。

3) 精密度試驗(yàn):精密吸取同一對(duì)照品溶液,在280 nm處連續(xù)測(cè)5次。記錄峰面積,并計(jì)算峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation, RSD)值。

4) 回收率試驗(yàn):取黃芩、骨碎補(bǔ)提取物適量,精密稱定,用甲醇溶解定容至刻度,分別制成含黃芩素、柚皮苷濃度為30、40、50 μg·mL-1的樣品溶液。在280 nm條件下檢測(cè)并按照線性回歸方程計(jì)算濃度。

5) 體外緩釋試驗(yàn):取約0.5 g制備好的芩補(bǔ)中藥緩釋凝膠注入自制的擴(kuò)散池中均勻鋪開,將其加入含50 mL去離子水的燒杯中,加蓋密封,放入恒溫空氣浴搖床(37℃,轉(zhuǎn)速40 r·min-1)中,分別于1～7 d后將容量瓶中溶液全部取出,再補(bǔ)加相同溫度的釋放介質(zhì)50 mL,放回。取釋放介質(zhì)液20 μL,40 μmm濾膜過濾,用HPLC法檢測(cè)釋放液中藥物的含量,計(jì)算出一定時(shí)間點(diǎn)黃芩素、柚皮苷的釋放率和累積釋放率。

3 結(jié)果

3.1 hPDLCs培養(yǎng)及鑒定

采用酶消化結(jié)合組織塊法,1周即可看到hPDLSs從組織塊周圍爬出并貼壁生長(zhǎng);4周后細(xì)胞生長(zhǎng)速度加快并呈一定方向排列(見圖1A，B); HE染色后,光鏡下觀察到細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形或多角形,有數(shù)個(gè)長(zhǎng)短不一的突起,胞體豐滿,胞漿著紅色，胞核著藍(lán)紫色(見圖1C);免疫組化染色后,可見抗波形蛋白染色陽性胞漿呈棕黃色(見圖1D),角形蛋白染色陰性(見圖1E)，說明所培養(yǎng)的細(xì)胞來源于外胚層間充質(zhì),而非上皮組織。結(jié)合取材部位及細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察可以確定是 hPDLCs。

A 原代培養(yǎng)1周：組織塊周圍長(zhǎng)出的hPDLCs(200×)；B 原代培養(yǎng)4周：待傳代的hPDLCs呈放射狀及漩渦狀(200×)；C HE染色：細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形或多角形，有數(shù)個(gè)長(zhǎng)短不一的突起(1 000×)；D 波形蛋白染色陽性(1 000×)；E角形蛋白染色陰性(1 000×)圖1 hPDLCs的培養(yǎng)及鑒定 Fig.1 Culture and identification of hPDLCs

3.2 ALP法檢測(cè)黃芩、骨碎補(bǔ)提取物復(fù)方對(duì)hPDLCs成骨的影響

不同配比的黃芩和骨碎補(bǔ)提取物復(fù)方對(duì)細(xì)胞ALP活性的影響不同,但普遍高于單味藥物對(duì)細(xì)胞ALP活性的促進(jìn)作用。其中，ALP活性值最高的組方為1 mg·L-1黃芩提取物與1 mg·L-1骨碎補(bǔ)提取物(質(zhì)量比1∶1),其明顯高于對(duì)照組及單味藥組的促進(jìn)作用,且有顯著性差異(*p<0.05;**p<0.01)(見表1)。

表1 不同濃度和配比的黃芩提取物和骨碎補(bǔ)提取物對(duì)hPDLCs堿性磷酸酶活性的影響Tab.1 Effect of naringin and baicalin combination on ALP activity of

續(xù)表1

3.3 芩補(bǔ)中藥緩釋凝膠制劑學(xué)考察

3.3.1 形態(tài)學(xué)考察 黃芩、骨碎補(bǔ)提取物按黃芩素與柚皮苷質(zhì)量比1∶1制備2%、4%、6%不同濃度的緩釋凝膠,外觀為黃褐色乳膏狀,具有一定的稠度,呈非自由流動(dòng)的流體狀態(tài)(見圖2)。

圖2 4%濃度的芩補(bǔ)緩釋凝膠Fig.2 4% concentration of qinbu sustained-release gel

3.3.2 pH值考察 制備的2%、4%、6%凝膠pH值為7.2～7.4(見表2),符合《中國(guó)藥典》2020版規(guī)定的凝膠制劑pH值不超過8.0的要求。

表2 不同濃度的芩補(bǔ)緩釋凝膠pH值Tab.2 pH values of qinbu sustained-release gel at different concentrations

3.3.3 穩(wěn)定性考察 由表3可知,2%、4%、6%三種濃度的凝膠離心、冷凍、加熱后均不分層、不變色,其中2%、4%的凝膠流動(dòng)性較好,但6%芩補(bǔ)中藥緩釋凝膠流動(dòng)性及通針性差,故選擇2%、4%濃度的芩補(bǔ)中藥緩釋凝膠用于下一步實(shí)驗(yàn)。

表3 2%、4%、6%濃度的芩補(bǔ)中藥緩釋凝膠穩(wěn)定性考察Tab.3 Stability of qinbu sustained-release gel with different concentrations of 2%, 4%，6%

3.3.4 體外釋放率的測(cè)定

1) 系統(tǒng)適應(yīng)性考察:藥物緩釋液和對(duì)照品液在相應(yīng)的位置上均出現(xiàn)色譜峰,且藥物緩釋液色譜峰中基線穩(wěn)定,分離度良好?？瞻啄z液在該位置沒有峰出現(xiàn),說明基質(zhì)液對(duì)藥物檢測(cè)無干擾(見圖3～6)。

圖3 柚皮苷對(duì)照品色譜圖Fig.3 Chromatogram of naringin reference substance

圖4 黃芩素對(duì)照品色譜圖Fig.4 Chromatogram of baicalein reference substance

圖5 芩補(bǔ)凝膠色譜圖Fig.5 Chromatogram of qinbu gel

圖6 空白凝膠色譜圖Fig.6 Chromatogram of blank gel

2) 線性試驗(yàn): 經(jīng)計(jì)算得柚皮苷在0.1～20 μg·mL-1的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為A=2.4E-5C+0.094 4R2=0.999 6;黃芩素在1～50 μg·mL-1的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,回歸方程為A=1.6E-5C+2.618 6R2=0.993 1。

3) 精密度試驗(yàn)：測(cè)得黃芩提取物峰面積RSD為0.15%,柚皮苷峰面積RSD為0.29%,表明儀器性能穩(wěn)定。

4) 回收率試驗(yàn):黃芩素、柚皮苷精密度分別為RSD 0.15% (n=5)、0.29%(n=5)，分別測(cè)量黃芩素、柚皮苷低、中、高(30、40、50 μg·mL-1)3個(gè)質(zhì)量濃度的平均回收率為黃芩素99.62%,RSD 0.288%(n=9);柚皮苷99.02%,RSD 0.417%(n=9)。

5) 體外緩釋試驗(yàn):由圖7可知,質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%、4%的芩補(bǔ)中藥緩釋凝膠中藥物釋放均可分為2個(gè)階段:第一階段，是將凝膠注入到去離子水中至凝膠凝結(jié)后,在該階段存在“突釋”現(xiàn)象,即2%、4%濃度的芩補(bǔ)緩釋凝膠中柚皮苷在第2天的釋放率相較于第1天分別增長(zhǎng)了12%和22%,黃芩素則分別增長(zhǎng)了20%和19%;第二階段，是凝膠凝結(jié)后穩(wěn)定釋藥階段,釋放率基本穩(wěn)定。存在“突釋”現(xiàn)象的原因，是由于凝膠中的聚丙烯酸樹脂具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和親水基團(tuán),吸水膨脹倍數(shù)較高,其凝膠結(jié)構(gòu)水通道空腔尺寸大導(dǎo)致藥物沿孔道迅速釋放，產(chǎn)生了“突釋”現(xiàn)象。此外,2%、4%濃度的芩補(bǔ)緩釋凝膠中黃芩素的“突釋”現(xiàn)象也可能與黃芩素易于降解有關(guān)。4%濃度的芩補(bǔ)中藥緩釋凝膠中黃芩素和柚皮苷的釋放曲線良好，且7天累積釋放率達(dá)80%以上。因此，4%濃度為芩補(bǔ)中藥緩釋凝膠的最優(yōu)處方。

圖7 芩補(bǔ)中藥緩釋凝膠中黃芩素、柚皮苷7d累積釋放情況Fig.7 7 days cumulative release of naringin and baicalin in qinbu sustained-release gel

4 討論

牙周局部用藥的方式包括:含漱、局部沖洗、涂布，以及牙周袋內(nèi)應(yīng)用緩釋和控釋藥物等。前三者作用時(shí)間短,對(duì)牙周袋內(nèi)的菌群無顯著影響。緩釋和控釋藥物則能直接靶向作用于牙周袋內(nèi)的病變組織，使病變局部較長(zhǎng)時(shí)間維持有效藥物濃度，達(dá)到抑菌、殺菌等目的。目前，常用的幾種緩釋劑型包括纖維條、膜劑、微球、棒劑、原位凝膠等,各具優(yōu)缺點(diǎn)。纖維條使用方便、用藥量少,但因其不可吸收,影響創(chuàng)口愈合;膜劑可吸收,但可變性差,易脫膜,易造成患者不適;微球可降解,但因其突釋效應(yīng)導(dǎo)致規(guī)?；a(chǎn)困難;棒劑起效快,用藥量少,但藥物釋放率低,患者體驗(yàn)感差;原位凝膠(如派麗奧)因其具有流動(dòng)性好、與牙周袋形狀貼合等優(yōu)勢(shì)近年來備受臨床醫(yī)生青睞[15-16]。因此，本研究采取原位凝膠緩釋劑型。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，黃芩素、骨碎補(bǔ)柚皮苷均可促進(jìn)hPDLCs增殖,骨碎補(bǔ)柚皮苷對(duì)hPDLCs成骨還有促進(jìn)作用。前期制備的黃芩提取物緩釋凝膠對(duì)小型豬牙周炎具有明顯的消炎作用,但無明顯成骨作用。因此，本研究根據(jù)中醫(yī)配伍理論,將黃芩提取物與骨碎補(bǔ)提取物按一定比例混合,采用ALP法測(cè)定單味及中藥復(fù)方對(duì)人牙周膜細(xì)胞成骨的影響,證實(shí)復(fù)方中藥的成骨作用優(yōu)于單味中藥,得到黃芩提取物與骨碎補(bǔ)提取物最佳質(zhì)量比為1∶1,進(jìn)一步制備芩補(bǔ)緩釋凝膠,利用高效液相色譜法(HPLC)[17-19]等對(duì)其進(jìn)行了形態(tài)學(xué)及穩(wěn)定性分析,結(jié)果符合凝膠制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[20]。最終確定4% 的芩補(bǔ)緩釋凝膠釋放效果最優(yōu),7 d累計(jì)釋放率均可達(dá) 80%以上。后續(xù)還將對(duì)該芩補(bǔ)緩釋凝膠的毒理作用進(jìn)行深入研究,為臨床牙周炎藥物應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。