活性炭對半乳甘露低聚糖的脫色研究
2022-02-26 03:00:06黃曹興陶昱恒廖吉麗王欣妍勇強
林業(yè)工程學報 2022年1期
黃曹興，陶昱恒，廖吉麗，王欣妍，勇強
(南京林業(yè)大學化學工程學院，南京 210037)
田菁(Sesbaniacannabina)原產(chǎn)于低緯度熱帶和亞熱帶沿海地區(qū)，為灌木狀草本植物，耐鹽、耐澇，是優(yōu)良的改良土壤綠肥植物[1-2]。田菁由種皮、胚乳、子葉等部分組成，胚乳的主要成分為半乳甘露聚糖，其相對分子質(zhì)量約為100萬Da[3]。
半乳甘露聚糖(GM)，是一種包含了甘露糖骨干與半乳糖支鏈的多糖，主要存在于豆科植物種子中，如田菁、胡蘆巴、槐豆等植物[4-5]。田菁種子富含半乳甘露聚糖，目前多開發(fā)為紡織行業(yè)的漿料、石油開采輔料等，在食品中其也可作為安定劑和增黏劑使用。另外，半乳甘露聚糖可以通過物理法、酸法或酶法降解獲得半乳甘露低聚糖，其中利用β-甘露聚糖酶降解的方法綠色、簡便且得率高[6]。半乳甘露低聚糖(GMOS)作為功能性低聚糖家族的新成員，是由2～10個甘露糖基和半乳糖基連接而成的具有支鏈結(jié)構(gòu)的低聚糖，是半乳甘露聚糖的不完全降解產(chǎn)物。半乳甘露低聚糖對雙歧桿菌等腸道益生菌有明顯的增殖作用[7]，且分子量越低，增殖效果越明顯，并能產(chǎn)生大量的有機酸。田菁半乳甘露低聚糖可通過田菁種子酶解獲得，但產(chǎn)品中含有大量色素，主要為美拉德色素(紫外下出現(xiàn)最大吸收峰的波長為420 nm[8])和酚類色素(紫外下出現(xiàn)最大吸收峰的波長為280 nm[9])。這些色素不僅影響半乳甘露低聚糖的感觀性能，而且影響半乳甘露低聚糖的純度以及生物活性。對此，可采用樹脂吸附法、降解法和活性炭吸附等方法除去低聚糖中的色素?；钚蕴渴且环N孔隙豐富、比表面積大和吸附能力強的固體顆粒，可吸附液體中的小分子物質(zhì)，從而達到分離和純化液體中不同物質(zhì)的目的。因此，本試驗采用活性炭對半乳甘露低聚糖中的色素進行吸附，為了獲得最佳的脫色效果分別進行了單因素試驗和正交優(yōu)化，為田菁半乳甘露低聚糖的精制技術提供依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 試驗材料
活性炭：選取上海久億化學試劑有限公司的柱狀活性炭、國藥集團化學試劑有限公司的顆?；钚蕴俊嚓柺谢钚蕴柯?lián)合工廠的粉末活性炭。
田菁種子：購于江蘇宿遷(將種子磨碎至粒徑1.7 mm，水分為8.81%，半乳甘露聚糖質(zhì)量分數(shù)為23.56%)。
β-甘露聚糖酶：由本實驗室利用里氏木霉Rut C30以微晶纖維素為底物產(chǎn)酶獲得。
1.2 試驗方法
1.2.1 田菁種子酶解糖液的制備
按照聚糖含量40 g/L、β-甘露聚糖酶加量20 U/g的條件，將粉碎好的田菁種子在50 ℃、150 r/min 的條件下酶解72 h，酶解結(jié)束后取出，酶解糖液于10 000 r/min條件下離心5 min，保留上清液，將上清液滅活15 min，然后10 000 r/min離心5 min，將上清液置于-20 ℃冰箱備用。
1.2.2 活性炭的預處理
稱取適量活性炭于燒杯中，倒入l%鹽酸浸泡，浸泡12 h后，用熱去離子水清洗，然后濾干，置于120 ℃下干燥8 h，冷卻至室溫備用[10]。
1.2.3 活性炭脫色
于250 mL錐形瓶中加入50 mL酶解糖液和一定量活性炭，塞緊橡皮塞，置于一定溫度的恒溫振蕩水浴鍋中，以150 r/min頻率振蕩。振蕩結(jié)束后，脫色液經(jīng)離心除去活性炭，置于4 ℃冰箱備用。
1.2.4 色素洗脫
取一定質(zhì)量吸附色素后的濕炭放入三角瓶內(nèi)，用自來水清洗兩遍，每次清洗后均用離心機將炭和洗水分離，目的是除去水溶雜質(zhì)，然后加入一定濃度、體積的丙酮，在一定溫度下，用恒溫振蕩器搖動進行色素洗脫，一定時間后通過離心(4 000 r/min，15 min)分離活性炭，保留上清液[9]并濃縮，冷凍干燥成粉末。
1.2.5 紅外光譜分析
取干燥后的色素及脫色前后的半乳甘露低聚糖產(chǎn)品1 mg，與100～200 mg經(jīng)干燥的溴化鉀粉末在瑪瑙研缽中輕輕研磨均勻，經(jīng)壓片機壓成薄片，用傅里葉變換紅外光譜儀在4 000～400 cm-1區(qū)間內(nèi)進行紅外掃描[11]。
1.2.6 吸附等溫線測定
將田菁種子酶解糖液分別稀釋1，2，4，6，8，10，15和20倍，均加入等量活性炭，在一定溫度下于恒溫振蕩水浴鍋中以150 r/min振蕩，結(jié)束后離心除去活性炭，測定脫色液的吸光度值，計算出平衡質(zhì)量濃度Ce和每克活性炭吸附色素的量x/m[12]，再進行曲線擬合，得到吸附等溫線。計算見公式(1)：
(1)
式中：x為被吸附色素的質(zhì)量，g；m為活性炭的質(zhì)量，g；v為所取半乳甘露低聚糖溶液的體積，L；C0為被吸附的色素質(zhì)量濃度，g/L。
1.3 分析方法
1.3.1 色素吸光度值測定方法
將脫色后的酶解糖液經(jīng)5 000 r/min離心后經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜過濾，采用島津UV-1800型紫外可見分光光度計分別測定濾液在280和420 nm處的吸光度值。活性炭脫色效果的衡量，用色素脫除率和半乳甘露低聚糖回收率來表示，色值計算見公式(2)[13]：
(2)
式中：A為糖液的吸光度；b為比色皿的厚度，cm；c為糖液質(zhì)量濃度，g/mL。
色素脫除率計算見公式(3)[13]：
(3)
1.3.2 半乳甘露低聚糖含量測定方法
經(jīng)8 000 r/min離心反應液10 min取上清液，以超純水稀釋4 000倍，再經(jīng)0.22 μm親水性微濾膜過濾得濾液。采用Dionex ICS-5000高效陰離子交換色譜系統(tǒng)分析和定量檢測反應液中的半乳甘露低聚糖含量[14]。色譜柱為CarboPacTM PA10(2 mm×50 mm)，保護柱為CarboPacTM PA10(2 mm×250 mm)。色譜條件：柱溫30 ℃，采用四電位脈沖安培檢測器(PAD)以外標法檢測。
半乳甘露低聚糖回收率的計算見公式(4)：
半乳甘露低聚糖回收率=
(4)
2 結(jié)果與分析
2.1 活性炭脫色條件的優(yōu)化
2.1.1 活性炭的種類對脫色效果的影響
活性炭的種類很多，按顆粒度大概可分為3種：柱狀活性炭、顆?；钚蕴亢头勰┗钚蕴??；钚蕴款w粒度不同，脫色效果也各有差異。為了選出最適合半乳甘露低聚糖溶液脫色的活性炭，對比了3種市售活性炭(柱狀活性炭、顆?；钚蕴亢头勰┗钚蕴?在吸附溫度40 ℃、添加量為10%、吸附時間60 min的條件下對半乳甘露低聚糖溶液的脫色效果的影響，結(jié)果見表1。
表1 活性炭種類對色素脫除和半乳甘露低聚糖回收的影響Table 1 The effect of activated carbon type on pigment removal and galactomanno-oligosaccharide recovery %
由表1可知，柱狀活性炭對酚類色素的吸附性能差，脫除率幾近于零，顆?；钚蕴康姆宇惿孛摮蕿?4.75%，粉末活性炭的酚類色素脫除率為95.35%；柱狀活性炭對美拉德色素的選擇性較差，脫除率僅在15%左右，顆?；钚蕴考胺勰┗钚蕴康姆宇惿孛摮史謩e為70.34%和71.12%。對半乳甘露低聚糖回收率而言，柱狀活性炭最高，為99.05%，顆?；钚蕴繛?3.46%，粉末活性炭為90.46%。
且從表1中可以看出，隨著活性炭粒徑的減小，單位質(zhì)量活性炭的比表面積增大，吸附能力逐漸增大。但同時，隨著粒徑減小，活性炭難以從水中分離，使?jié)岫仍龃?，且半乳甘露低聚糖的回收率降低[15]。綜合考量吸附能力和分離能力，選用顆?；钚蕴窟M行下一步試驗。
2.1.2 活性炭的添加量對脫色效果的影響
在溫度40 ℃、吸附時間60 min條件下，考察顆?；钚蕴刻砑恿繉μ镙挤N子酶解糖液脫色效果的影響，結(jié)果見圖1a。
由圖1a可知，隨著活性炭的增加，半乳甘露低聚糖回收率逐漸減少，而色素脫除率逐漸增加，活性炭添加量在9%～18%的范圍內(nèi)，色素脫除率緩慢增加，并逐漸趨于平穩(wěn)，而半乳甘露低聚糖回收率迅速下降。這是因為隨著活性炭用量增加，田菁種子酶解糖液中的色素顆粒幾乎被去除而使色素脫除率增長緩慢；當色素脫除率趨于穩(wěn)定時，多余的活性炭轉(zhuǎn)而吸附半乳甘露低聚糖導致半乳甘露低聚糖損失明顯地增大[16]，而且隨著顆粒活性炭的增加，田菁種子酶解糖液的濁度增大，分離難度增加。綜合比較田菁種子酶解糖液的脫色，活性炭固液分離難度和半乳甘露低聚糖的損失及經(jīng)濟可及性，確定顆?；钚蕴刻砑恿繛?%，其對酚類色素和美拉德色素的脫除率分別為89.75%和73.37%，半乳甘露低聚糖回收率為92.21%。
2.1.3 吸附時間對脫色效果的影響
一般來說，吸附時間的延長有利于活性炭的脫色，但是吸附時間過長，活性炭上被吸附的色素可能會被解吸下來。本研究在吸附溫度40 ℃、顆?；钚蕴刻砑恿?%的條件下，考察不同吸附時間對脫色效果的影響，結(jié)果見圖1b。
由圖1b可知，隨著吸附時間增加，半乳甘露低聚糖回收率緩慢降低，色素脫除率緩慢增加，當吸附時間由30 min延長至40 min時，酚類色素的脫除率增加了2.18%，當吸附時間由70 min提升至80 min時，酚類色素的脫除率僅增加了0.8%，說明顆粒活性炭對于色素的吸附在脫色反應進行到80 min時達到吸附平衡[17]。因為色素與糖之間存在競爭性吸附關系[16]，且活性炭吸附屬物理過程，是一種動態(tài)的吸附與解析的過程[18]，因此當吸附時間再延長時，色素顆粒可能會發(fā)生解析，而糖被吸附上去，導致色素脫除率降低和糖損失率升高。從田菁種子酶解糖液的色素脫除率和半乳甘露低聚糖的損失率方面考慮，確定吸附時間為60 min。
2.1.4 吸附溫度對脫色效果的影響
由于溫度與分子的運動有關，溫度升高，分子運動加快，有利于吸附，因此溫度在很大程度上會影響活性炭的脫色效果。本研究在顆?；钚蕴刻砑恿繛?%、吸附時間為60 min的條件下，研究溫度對脫色效果的影響，結(jié)果見1c。
由圖1c可知，隨著吸附溫度的增加，半乳甘露低聚糖回收率逐漸降低，色素脫除率急劇增加，這是因為提高溫度促使分子的熱運動加快，分子間碰撞機會增加，有利于絮體的形成，也有利于加快吸附[19]。當吸附溫度達到70 ℃以上時，酚類色素的脫除率呈現(xiàn)下降趨勢，這是因為已經(jīng)被吸附在活性炭上的色素重新被解吸下來，而同時活性炭對糖的親和力增強，半乳甘露低聚糖損失率增加[16]。但是通過對吸附后溶液以及活性炭的脫附溶液中的糖組分進行離子色譜檢測后發(fā)現(xiàn)，80 ℃的吸附溫度并未對半乳甘露低聚糖的結(jié)構(gòu)發(fā)生影響。該結(jié)果表明，半乳甘露低聚糖具有良好的熱穩(wěn)定性。綜合色素脫除率及半乳甘露低聚糖回收率兩個指標試驗結(jié)果，確定吸附溫度為40 ℃。
圖1 3個因素對色素脫除率和半乳甘露低聚糖回收率的影響Fig. 1 Effect of the three infactors on pigment removal rate and galactomanno-oligosaccharides recovery
2.1.5 正交優(yōu)化結(jié)果
影響田菁種子酶解糖液脫色效果的主要因素有活性炭添加量(A)、吸附溫度(B)、吸附時間(C)。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用 L9 (33)正交試驗來確定田菁種子酶解糖液顆?；钚蕴棵撋淖罴褩l件。因素水平設計見表2，不考慮因素的交互作用，以色素脫除率和半乳甘露低聚糖回收率作為衡量半乳甘露低聚糖產(chǎn)品的脫色精制效果的指標。試驗結(jié)果及分析見表3，其中D=酚類色素脫除率+美拉德色素脫除率+半乳甘露低聚糖回收率。
由表3中比較3種因素的極差大小可知，吸附時間對脫色效果的影響最大，其次是吸附溫度和活性炭添加量，同時可以確定顆?；钚蕴棵撋淖罴褩l件為活性炭添加量8%，吸附時間70 min，吸附溫度45 ℃。在此條件下，酚類色素和美拉德色素的脫除率分別達到91.08%和66.52%，半乳甘露低聚糖回收率可保持在93.53%。
表2 正交試驗因素水平Table 2 Orthogonal factors and levels
表3 正交試驗數(shù)據(jù)及極差分析Table 3 Orthogonal experimental data and range analysis
2.2 紅外光譜分析結(jié)果
將脫色前、脫色后的半乳甘露低聚糖和色素進行紅外掃描，探究活性炭脫色對田菁種子酶解糖液中物質(zhì)的影響，結(jié)果見圖2。
圖2 脫色前和脫色后的半乳甘露低聚糖以及色素的紅外譜圖Fig. 2 Infrared spectra of galactomanno-oligosaccharides and pigment before and after decoloration
由圖2可知，經(jīng)紅外光譜鑒定，田菁種半乳甘露低聚糖的吸收譜帶有如下特征吸收峰：1 612，1 024，870和813 cm-1處有較強的吸收峰。1 612 cm-1處為糖類的—OH吸收峰，1 024 cm-1處為糖環(huán)特征吸收峰，組成的單糖為吡喃環(huán)，813 cm-1處為α-1,6糖苷鍵的吸收峰[20]。通過比對脫色前和脫色后的半乳甘露低聚糖，可以發(fā)現(xiàn)各糖類吸收峰的峰位置沒有發(fā)生明顯改變，且沒有出現(xiàn)新的吸收峰，說明活性炭吸附?jīng)]有改變多糖的糖殘基結(jié)構(gòu)。
2.3 活性炭對色素的吸附等溫線
采用正交優(yōu)化的方案，將不同質(zhì)量濃度的田菁種子酶解糖液進行活性炭吸附試驗，以平衡質(zhì)量濃度Ce為橫坐標，每克活性炭吸附色素的量x/m為縱坐標，經(jīng)過曲線擬合，發(fā)現(xiàn)顆?；钚蕴繉μ镙挤N子中兩種色素分子的吸附屬于Langmuir等溫模型，模型參數(shù)如表4所示，其中Qmax為飽和吸附容量，KL為Langmuir吸附常數(shù)，RL為通過KL值計算出的無量綱的分離因子常數(shù)，見公式(5)[23]：
(5)
式中：C為吸附前溶液中色素的最大質(zhì)量濃度，即為初始質(zhì)量濃度值C0，mg/L。
表4 吸附等溫線模型參數(shù)Table 4 Parameters for adsorption isotherm model
由表4可知，顆粒活性炭對酚類色素和美拉德色素吸附能力不同，兩者的飽和吸附容量分別為0.32 和0.57 g/g。通過比較分離因子常數(shù)RL值的大小，可以判斷整個吸附反應進行的難易程度。一般認為：0
3 結(jié) 論
半乳甘露低聚糖作為一種高生物活性的天然多糖降解產(chǎn)物，已經(jīng)得到了越來越多的關注。本研究主要對半乳甘露低聚糖溶液的脫色精制進行了研究，結(jié)論如下：
1)在3種活性炭中，顆?；钚蕴磕茉谖缴倭康奶穷惖那疤嵯?，保留對色素較高的親和力。同時，正交試驗表明，吸附時間對脫色效果的影響最大，其次是吸附溫度和活性炭添加量。在活性炭添加量為8%，吸附時間70 min，吸附溫度45 ℃條件下，脫色效果最佳，酚類色素和美拉德色素的脫除率分別達到91.08%和66.52%，半乳甘露低聚糖回收率可保持在93.53%。
2)經(jīng)紅外光譜分析發(fā)現(xiàn)，活性炭可脫除大部分色素，如原花青素，同時沒有改變多糖的糖殘基結(jié)構(gòu)。經(jīng)曲線擬合發(fā)現(xiàn)顆?；钚蕴繉τ谔镙挤N子酶解糖液中色素的吸附屬于Langmuir等溫吸附，酚類色素和美拉德色素的飽和吸附容量分別為0.32 和0.57 g/g，且反應容易進行，相關系數(shù)較高。
