豬圓環(huán)病毒診斷方法研究進(jìn)展

任慧波，李雙寅，王 慧，李潤(rùn)成，杜麗飛，3※，邱光勇

（1.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410131；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3.湖南鑫廣安農(nóng)牧股份有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410100；4.綏寧縣良水沖生態(tài)種養(yǎng)專業(yè)合作社，湖南 綏寧 422604）

豬圓環(huán)病毒（porcine circovirus，PCV）為無(wú)囊膜，呈正二十面體，直徑大小約為13～25nm，其DNA 基因組為環(huán)狀單股負(fù)鏈的病毒，被列為圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，是目前已知的最小病毒之一。人們根據(jù)豬圓環(huán)病毒（PCV）致病性和抗原特異性存在差異的特點(diǎn)，將其劃分為4 種基因型，主要為2 型導(dǎo)致豬發(fā)病。PCV2 主要感染宿主是豬，發(fā)病豬和無(wú)癥狀的隱性感染豬是主要傳染源，感染途徑主要是通過(guò)口鼻直接接觸帶毒的糞便、尿液或接觸已感染PCV2 的病豬[1-2]等水平傳播方式感染其他健康豬群。PCV2 同時(shí)也具有垂直傳播的特性，在流產(chǎn)的胎兒、胎盤(pán)以及精液中均能檢測(cè)到PCV2[3-4]。飼養(yǎng)環(huán)境衛(wèi)生不合格、飼養(yǎng)管理不達(dá)標(biāo)、引種不當(dāng)、免疫性疾病混合感染等因素是誘發(fā)本病的原因[5-6]。

豬圓環(huán)病毒2 型主要是侵害豬只的免疫系統(tǒng)，使感染豬只的免疫功能受到損害，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體免疫抑制，誘發(fā)更多的相關(guān)疾病，且混合感染較多，該病毒通常以亞臨床感染的形式出現(xiàn)而容易被忽視，為了更好地控制豬圓環(huán)病毒的感染和傳播，迫切需要一些適合的快速準(zhǔn)確的診斷方法應(yīng)用于臨床。但目前在診斷過(guò)程中，單一的診斷方法往往不能精準(zhǔn)地診斷出該病，需要根據(jù)各種檢測(cè)豬圓環(huán)病毒的方法及其優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行結(jié)合分析并優(yōu)化檢測(cè)手段，為快速診斷該病及發(fā)展新型的診斷方法提供參考。

1 PCV2 病毒分離鑒定

病毒分離是PCV2 常用的診斷技術(shù)。伊秀鳳等[7]將患有PMWS（斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征）豬的腹股溝淋巴結(jié)、腎臟等組織研磨，經(jīng)生理鹽水稀釋、凍融、離心、取上清過(guò)濾等步驟，然后利用PCR 方法鑒定為PCV2 陽(yáng)性，再取分離液接種于PK-15 細(xì)胞懸浮液中，經(jīng)37℃培養(yǎng)，在懸浮液中形成細(xì)胞單層后，棄去生長(zhǎng)液，將其加入D-氨基葡萄糖中處理，再將其置入新生仔豬血清的DMEM 維持液培養(yǎng)48h 后成功獲得病毒,將獲得的病毒放置在電子顯微鏡下可觀察到無(wú)囊膜、呈正二十面體并呈散在分布的病毒粒子，即為PCV2 病毒粒子。PCV2 病毒分離存在分離步驟多、費(fèi)時(shí)、費(fèi)力等不便，不適用于臨床上快速檢測(cè)與診斷。

2 免疫組化

免疫組化又稱免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)（immunohistochemistry，IHC），該技術(shù)是運(yùn)用抗原抗體的特異性反應(yīng)的特征，用單克隆抗體或多克隆抗體在石蠟組織切片中檢測(cè)某種抗原或抗體的分布情況，同時(shí)也用于抗原、抗體的定性、定量、定位的研究。該方法除了作為定性、定量檢測(cè)的一種手段，可以利用定位病原在組織內(nèi)的動(dòng)態(tài)分布的特性，進(jìn)一步了解病原的靶器官，為藥物的開(kāi)發(fā)打下良好的基礎(chǔ)。Krakowka 運(yùn)用IHC 方法對(duì)患有PMWS 豬群，發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞處有很強(qiáng)的PCV2 抗原陽(yáng)性反應(yīng)[8]。由于在實(shí)際操作中該方法較為繁瑣且耗時(shí)長(zhǎng)，需要避免過(guò)氧化物酶的干擾，因此IHC 不能用于大規(guī)模檢測(cè)中，在對(duì)抗原組織或細(xì)胞大體形態(tài)的評(píng)價(jià)的應(yīng)用相對(duì)較多。

3 間接免疫熒光技術(shù)（IFA）

間接免疫熒光技術(shù)常用于病原體的診斷檢測(cè)以及病原體引起的腎炎、皮炎等疾病的免疫病理學(xué)檢查，豬源細(xì)胞PCV2 感染情況檢測(cè)、鑒定圓環(huán)病毒的分離效果及相關(guān)病變組織的檢測(cè)等均需要運(yùn)用到該技術(shù)。蘆銀華等[9]以PK-15 細(xì)胞增殖的PCV2 標(biāo)準(zhǔn)毒株作為包被抗原成功建立起用于檢測(cè)PCV2 抗體的IFA 方法，運(yùn)用已建立的方法來(lái)檢測(cè)多地的血清樣品，結(jié)果顯示PCV2 抗體陽(yáng)性率達(dá)到59%，檢測(cè)過(guò)程中未見(jiàn)到PRRSV、PRV、PPV 抗體所產(chǎn)生的特異性熒光，表明該方法具有良好的特異性。

4 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）

2000 年一種新的核酸診斷技術(shù)-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）被用于臨床中，其特點(diǎn)是針對(duì)靶基因的6 個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4 種特異引物，利用一種鏈置換DNA 聚合酶在等溫條件(63 ℃左右) 保溫30～60 分鐘，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。與常規(guī)PCR 相比，不需要模板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳及紫外觀察等過(guò)程。LAMP 是一種全新的核酸擴(kuò)增方法，具有簡(jiǎn)單、快速、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。該技術(shù)在靈敏度、特異性和檢測(cè)范圍等指標(biāo)上能媲美甚至優(yōu)于PCR 技術(shù)，不依賴任何專門(mén)的儀器設(shè)備實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)高通量快速檢測(cè)，檢測(cè)成本遠(yuǎn)低于熒光定量PCR。Chen 等[10]成功建立一種新的PCV2 LAMP 檢測(cè)方法，與PRRSV、PRV、PCV1 不出現(xiàn)交叉性。

5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是以酶分子與抗體或抗抗體的共價(jià)結(jié)合，并通過(guò)顯色反應(yīng)測(cè)定吸光度判斷是否出現(xiàn)免疫反應(yīng)的一種檢測(cè)方法。在眾多血清學(xué)檢測(cè)方法中，ELISA 檢測(cè)方法可以彌補(bǔ)間接免疫熒光技術(shù)（IFA）、病毒中和試驗(yàn)測(cè)定法、免疫過(guò)氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)等存在費(fèi)時(shí)、勞動(dòng)強(qiáng)度大等不足，憑借著操作簡(jiǎn)單、敏感性高、易于自動(dòng)化、適合大規(guī)模檢測(cè)等諸多優(yōu)點(diǎn)，ELISA 成為使用最廣泛的血清學(xué)檢測(cè)方法，能用于多種疾病的血清學(xué)檢測(cè)。國(guó)內(nèi)外學(xué)者已建立多種ELISA 檢測(cè)方法，主要有競(jìng)爭(zhēng)ELISA、間接ELISA、雙抗體夾心ELISA、抗原捕獲ELISA。

5.1 間接ELISA

間接ELISA 是指在固相載體表面包被抗原。國(guó)外學(xué)者報(bào)道兩種PCV2 間接ELSIA 檢測(cè)方法[11],一種以細(xì)胞培養(yǎng)的PCV2 全病毒作為包被抗原用于檢測(cè)全病毒的抗體，即為PCV2 ELISA；以O(shè)RF2 重組桿狀病毒表達(dá)產(chǎn)物作為包被抗原用于檢測(cè)Cap 蛋白的抗體，即為ORF2 ELISA。間接ELISA 具有良好的重復(fù)性和特異性，但由于其不能有效識(shí)別PCV1和PCV2 的抗體，嚴(yán)重影響了其在生產(chǎn)實(shí)際中的應(yīng)用。楊順利等[12]利用可溶性重組PCV2-Cap 蛋白肽段為抗原，建立PCV2 血清抗體間接ELISA 檢測(cè)方法（rhcap-ELISA），運(yùn)用該方法跟同類商品化試劑盒進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，對(duì)送檢的137 份血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示兩種檢測(cè)試劑盒的陽(yáng)性檢出率分別為79.56%和83.21%，該重組抗原與PRRSV、CSFV、PRV 等陽(yáng)性血清不發(fā)生交叉反應(yīng)，具有很強(qiáng)的特異性，可用于大規(guī)模的PCV2 抗體大規(guī)模檢測(cè)工作。

5.2 競(jìng)爭(zhēng)ELISA

Walker 等[13]首次建立用于檢測(cè)PCV2 抗體的競(jìng)爭(zhēng)ELISA,對(duì)來(lái)自法國(guó)、英國(guó)、加拿大等國(guó)的484份感染PCV2 的血清進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)與IFA 檢測(cè)方法進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，該方法和IFA 檢出PCV2 的抗體陽(yáng)性率分別為99.58%、97.14%，表明該方法的特異性和敏感性高于IFA，且差異小。王洪利等[14]建立以PCV2 特異性單克隆抗體為競(jìng)爭(zhēng)試劑的阻斷ELISA，與間接ELISA 相比具有明顯的優(yōu)勢(shì)，能有效反映豬群感染狀況或疫苗效力。

5.3 抗原捕獲ELISA

2002 年，McNeilly 等[15]基于單抗建立起的抗原捕獲ELSIA 可用來(lái)檢測(cè)PCV 的復(fù)制位點(diǎn)和PMWS的檢測(cè)，也可用于病毒的純化。

6 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）

6.1 普通PCR

普通PCR 是圓環(huán)病毒常用的一種診斷方法，其原理是根據(jù)目的基因片段設(shè)計(jì)引物，在PCR 儀器的作用下將病料中的PCV2 特異的基因組片段擴(kuò)增出來(lái)，以此達(dá)到檢測(cè)樣本中PCV2 的目的。普通PCR 目前在生產(chǎn)實(shí)際中大量應(yīng)用，施研進(jìn)等[16]成功建立PCR 檢測(cè)方法，并對(duì)來(lái)自新疆石河子及北屯地區(qū)的203 份抗凝血液進(jìn)行檢測(cè)，共檢測(cè)陽(yáng)性樣本16 份，陽(yáng)性率為7.9%。李英等[17]以PCV2 病毒的ORF2 基因設(shè)計(jì)出特異性引物，建立檢測(cè)PCV2 病毒的PCR 方法，對(duì)來(lái)自山東日照患有PMWS 的10頭豬進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示有7 頭呈現(xiàn)陽(yáng)性。該檢測(cè)方法具有快速、簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，因其在擴(kuò)增后需凝膠電泳檢測(cè)和成像系統(tǒng)的判定，在檢測(cè)過(guò)程中容易受到污染，進(jìn)而造成假陽(yáng)性。

6.2 多重PCR

多重PCR 是指設(shè)計(jì)兩種以上的引物，再在同一個(gè)PCR 反應(yīng)體系中可以擴(kuò)增出多個(gè)病原核酸片段的PCR 技術(shù)。因PCV2 易與其他病原發(fā)生混合感染進(jìn)而引發(fā)綜合病癥，相比單重PCR，利用多重PCR可以一次性擴(kuò)增出多個(gè)病原的核酸片段，達(dá)到對(duì)多種疾病檢測(cè)診斷的目的[18]。辛長(zhǎng)勛等[19]根據(jù)GenBank中已發(fā)表豬圓環(huán)病毒2 型（PCV2）、豬偽狂犬病毒（PRV）、豬細(xì)小病毒（PPV）相關(guān)的基因序列排列情況，自行設(shè)計(jì)3 對(duì)引物，通過(guò)生物公司合成引物，通過(guò)優(yōu)化試驗(yàn)成功建立檢測(cè)三種病毒的多重PCR 檢測(cè)方法，對(duì)臨床87 份樣本進(jìn)行病原檢測(cè)，3 種病毒檢出率分別為28.75、11.5%、12.6%；2 種病毒混合感染的陽(yáng)性率為13.8%，3 種病毒同時(shí)感染的陽(yáng)性率為2.3%，實(shí)現(xiàn)對(duì)多種病原檢測(cè)的目的。

6.3 熒光定量PCR（qPCR）

熒光定量PCR（qPCR）是通過(guò)收集不斷累積的熒光信號(hào)來(lái)對(duì)PCR 擴(kuò)增進(jìn)行監(jiān)測(cè)，然后根據(jù)已建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)模板進(jìn)行定量定性分析。qPCR 是依據(jù)試驗(yàn)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品的Ct 值[20]，通過(guò)計(jì)算得到起始拷貝數(shù)，從而實(shí)現(xiàn)定量定性的目的。Ct 值（Cycle threshold，循環(huán)閾值）是熒光信號(hào)達(dá)到閾值時(shí)所需的循環(huán)數(shù)，與樣本中的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在明顯的線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越大則Ct 值越小，反之Ct 值越大[21]。閾值（threshold）一般為3～15 個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)差的10 倍（threshold=10×SD threshold 3～15），當(dāng)熒光信號(hào)超過(guò)閾值時(shí)才視為真正的信號(hào)[22]。qPCR 技術(shù)繼承普通PCR 的靈敏性、特異性的同時(shí)將光譜技術(shù)的精確定量有效結(jié)合起來(lái)，在無(wú)需凝膠電泳和成像技術(shù)的配合下，可以直接探測(cè)模板擴(kuò)增時(shí)熒光信號(hào)的變化[23]，能快速、準(zhǔn)確得到擴(kuò)增結(jié)果。與普通PCR 相比，熒光定量PCR 因反應(yīng)過(guò)程處于完全密閉狀態(tài)，能減少因?qū)嶒?yàn)室污染造成的假陽(yáng)性的發(fā)生率進(jìn)而保障試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。目前為止qPCR 方法有兩類，即使用特異雙鏈DNA 結(jié)合染料的SYBR Green I 染料法和建立在熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理上使用熒光探針的TaqMan 探針?lè)?。董林等[24]成功建立SYBR Green I 熒光定量PCR，該方法檢測(cè)極限為3.21×100copies/μL，靈敏度是普通PCR 的1000 倍，對(duì)臨床樣品收集的PCV2 疑似病料檢測(cè)表明陽(yáng)性檢出率為58.94%，陽(yáng)性檢出率明顯高于普通PCR。任方方等[25]建立TaqMan 探針熒光定量PCR，該方法的檢測(cè)極限和定量極限分別為10copies/μL和100copies/μL，利用建立的熒光PCR 對(duì)1000 份臨床樣品檢測(cè)，710 份樣品檢出為陽(yáng)性，PCV2 陽(yáng)性率為71%。qPCR 因其結(jié)果更直觀、敏感性更高、特異性更強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，更適用于豬場(chǎng)PCV2 病毒的長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)。

7 小結(jié)

病原的快速準(zhǔn)確地診斷是解決各類傳染病的決定性因素。自豬圓環(huán)病毒發(fā)現(xiàn)以來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)其檢測(cè)方法進(jìn)行了大量的研究，已經(jīng)建立了多種PCV2 檢測(cè)方法，但各種方法都有其局限性，無(wú)論哪一種檢測(cè)方法都不能徹底解決所有的問(wèn)題。我國(guó)雖然在PCV2 的研究方面有了較大的進(jìn)展，但檢測(cè)體系尚不夠完善。因此在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中，有必要根據(jù)檢測(cè)的目的和要求，結(jié)合自身的經(jīng)驗(yàn)和具備的實(shí)驗(yàn)條件設(shè)施，選擇適宜的檢測(cè)方法，同時(shí)進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)PCV2 的檢測(cè)尤其是分子生物學(xué)檢測(cè)和免疫學(xué)檢測(cè)的研究，為PCV2 的防控帶來(lái)更多的便利。