噬菌體展示技術(shù)及其在單克隆抗體制備中的應用

劉銘赫，李巧玲，李林姣，程君生，李俊平，張 媛，彭小薇，王 楠

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所 國家/OIE布魯氏菌病參考實驗室，北京 102600)

噬菌體展示技術(shù)于1985年由George Smith首次提出[1]，1990年McCafferty成功將該技術(shù)應用在重組抗體的生產(chǎn)中[2]。自此，基于噬菌體展示的單克隆抗體技術(shù)逐步廣泛應用于生物醫(yī)藥的多個領域，如單克隆抗體靶向藥物、免疫檢測等，該技術(shù)通過一個噬菌體顆粒將抗體的表型與基因型聯(lián)系在一起，可以相對簡單快速地分離針對特定靶抗原的理想抗體分子。相較于其它單克隆抗體的制備技術(shù)，噬菌體展示技術(shù)篩選單克隆抗體的周期短、操作簡單、應用范圍廣、制備數(shù)量多。

1 噬菌體展示技術(shù)

1.1 噬菌體展示技術(shù)的原理 噬菌體展示技術(shù)是將外源蛋白質(zhì)、多肽的編碼基因或目的基因通過基因工程技術(shù)插入到編碼噬菌體外殼蛋白的基因序列的適當位置。在閱讀框正確且不影響噬菌體正常功能的情況下，使外源蛋白質(zhì)或多肽與噬菌體外殼蛋白融合形成融合蛋白，并隨子代噬菌體的重新組裝表達在噬菌體表面。融合蛋白保有獨立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性，能與靶分子進行識別和結(jié)合。噬菌體展示技術(shù)的最大特點就是通過噬菌體將目的蛋白與基因的克隆偶聯(lián)在一起，也在篩選過程中將重組蛋白質(zhì)的篩選與基因的篩選合二為一。

1.2 噬菌體展示技術(shù)的發(fā)展 1985年，George Smith將外源蛋白片段成功地展示在噬菌體表面，并將這一方法稱為噬菌體展示技術(shù)[1]。1989年，Lerner將噬菌體展示技術(shù)與抗體工程相結(jié)合，將鼠源抗體的抗原結(jié)合片段(Fab)的DNA序列克隆進了噬菌體的衣殼蛋白基因中，在噬菌體表面展示了該抗體的Fab區(qū)域[3]。1990年，McCafferty和Winter通過在噬菌體表面展示免疫球蛋白輕鏈和重鏈可變區(qū)基因的單鏈抗體(ScFV)的方法，篩選出了一株高特異性的噬菌體抗體[2]。在接下來的兩年里，Lerner和Winter又成功地利用噬菌體展示技術(shù)展示了人類抗體片段[4-5]。Adalimumab是第一個依靠噬菌體展示技術(shù)研發(fā)的單克隆抗體，于2002年被美國食品和藥物管理局(FDA)批準用于治療類風濕關節(jié)炎[6]。2018年，Winter和Smith教授因在“多肽及抗體的噬菌體展示(The phage display of peptides and antibodies)”技術(shù)方面的開創(chuàng)性工作與應用獲得諾貝爾化學獎[7]。

1.3 噬菌體展示系統(tǒng)的分類

1.3.1 絲狀噬菌體展示系統(tǒng) 絲狀噬菌體主要指具有感染革蘭氏陰性菌能力的M13、Fd和F1噬菌體，其中M13噬菌體在噬菌體展示技術(shù)中應用最廣泛[8]。M13噬菌體為一個絲狀長管結(jié)構(gòu)，一個環(huán)狀單鏈DNA基因組編碼5個外殼蛋白(pIII、pVIII、pVI、pVII和pIX)以及6個組裝和復制蛋白[9]。大多數(shù)噬菌體展示系統(tǒng)基于外殼蛋白pIII蛋白與pVIII蛋白。pVIII是M13噬菌體上主要的外殼蛋白，可與6～7個氨基酸大小的外源蛋白融合表達。而pIII的拷貝數(shù)較低但可作為表達復雜結(jié)構(gòu)的較大蛋白載體。由于絲狀噬菌體的增殖為非裂解增殖，在增殖期間不會裂解宿主菌，因此該噬菌體在實驗淘選過程中簡化了噬菌體純化的步驟，減少了實驗所需時間。但由于絲狀噬菌體的所有成分均需宿主細胞內(nèi)膜分泌轉(zhuǎn)運，會對表達蛋白的長度、序列和折疊特性有所影響[10]。

1.3.2 T4噬菌體展示系統(tǒng) T4噬菌體是肌病毒科(Myoviridae)的一種烈性噬菌體。T4噬菌體的結(jié)構(gòu)相較于絲狀噬菌體更為復雜，其由頭部、尾部和尾部纖維組成。T4噬菌體的頭部由一個細長二十面體衣殼包裹著雙鏈DNA組成[11]。頭部與尾部之間通過頸部相連，尾部的蛋白質(zhì)外殼為中空的長管，外面包有可收縮的尾鞘，尾部還有六根長尾纖維(LTF)和六根短尾纖維(STF)分別連接到六角形底座上并折疊在底板下方[12]。T4噬菌體常用于融合展示外源蛋白的主要有高度外衣殼蛋白HOC、小外衣殼蛋白SOC、衣殼蛋白gp23、頂端蛋白gp24、門戶蛋白gp20。其中HOC和SOC兩種蛋白具有很強的抗原性，且這兩種蛋白發(fā)生改變也對T4噬菌體的感染性以及活性沒有太大影響，因此這兩種蛋白最常被用于融合展示外源蛋白。T4噬菌體展示系統(tǒng)的一大優(yōu)勢就是其可以在SOC和HOC兩個位點上展示雙重外源抗原，從而篩選出雙特異性抗體[13]。

1.3.3 T7噬菌體展示系統(tǒng) T7噬菌體是短尾病毒科(Podoviridae)的一種烈性噬菌體。T7噬菌體的頭部由一個二十面體的頭部包裹著雙鏈DNA基因組組成。頭部和尾部之間有一個環(huán)狀連接器，尾部為帶有六根纖維的短圓柱形。T7噬菌體由主要衣殼蛋白gp10A、次級衣殼蛋白gp10B、連接蛋白gp8、尾部蛋白gp11和gp12以及尾纖蛋白gp17六種主要蛋白質(zhì)組成[14]。在T7噬菌體展示系統(tǒng)中，用于展示多肽和蛋白的衣殼蛋白主要是gp10A和gp10B。該展示系統(tǒng)可以很好地適應多肽或蛋白質(zhì)序列的變化，以高拷貝數(shù)展示多肽或蛋白質(zhì)，但隨著插入序列大小的增加，拷貝數(shù)有逐漸降低的趨勢。此外，T7噬菌體的比起絲狀噬菌體的增殖速度更快，可節(jié)省克隆和篩選的時間[15]。

1.3.4 λ噬菌體展示系統(tǒng) λ噬菌體是長尾病毒科(Siphoviridae)的一種溫和噬菌體。λ噬菌體是雙鏈DNA噬菌體，有一個二十面體的頭部和一個可彎曲的尾部。λ噬菌體中的GPD蛋白和PV尾蛋白常被用來展示多肽或蛋白[16]。與PV蛋白相比，GPD蛋白上的拷貝數(shù)更多，可展示更復雜的大蛋白，且在其上展示蛋白對噬菌體增殖的干擾更小，因此通常使用GPD蛋白的N-端或C-端作為展示位點。此外，一些在絲狀噬菌體展示系統(tǒng)中很難通過膜分泌的多肽也可以在λ噬菌體表面展示。但λ噬菌體具有裂解性，增殖過程中滴度較低，較難增殖。此外，λ噬菌體的基因組大，使遺傳操作變得更加復雜困難[10]。

2 噬菌體展示技術(shù)制備單克隆抗體

使用噬菌體展示技術(shù)制備單克隆抗體的基本步驟包括：①創(chuàng)建包含抗體DNA序列的噬菌體文庫，并評估文庫的克隆多樣性；②通過淘選，篩去非特異結(jié)合的噬菌體，篩選出目標噬菌體；③由于外源多肽和蛋白質(zhì)表達在噬菌體表面，其編碼基因可通過分泌型噬菌體的單鏈DNA測序推導出來。

2.1 噬菌體展示抗體庫的建立 噬菌體展示抗體庫可根據(jù)抗體基因序列的來源分為免疫文庫、天然文庫、半合成文庫及合成文庫。免疫文庫是利用病原感染者或疫苗接種者體內(nèi)產(chǎn)生的IgG-mRNA構(gòu)建而來。從同一免疫文庫中可分離出針對不同表位、具有不同特異性的抗體，且分離出的抗體特異性強，更易于識別某些靶點或抗原[17]。除此之外，免疫文庫還可用于分離針對低免疫原性區(qū)域的抗體[18]。天然文庫通常是利用未免疫者體內(nèi)IgM-mRNA構(gòu)建而成的，該文庫可用于分離針對所有類型抗原的抗體[19]，從天然文庫中分離出的抗體親和力主要取決于文庫的多樣性。在新型病原體突然出現(xiàn)或耐藥菌株緊急爆發(fā)的情況下，構(gòu)建天然文庫可以滿足在短時間內(nèi)分離出單克隆抗體的需求[20]。合成抗體庫及半合成抗體庫分別是由合成序列、合成序列及天然序列的混合物構(gòu)成的?？贵w識別抗原的特異性主要基于抗體重鏈和輕鏈基因的CDR區(qū)。在所有CDR區(qū)域中，CDRH3在組成和長度上更加多樣化[21]，故其在抗原結(jié)合位點和抗原識別中起著重要作用。在合成文庫中，CDR區(qū)域被隨機插入到完全合成的框架序列中[22]。在半合成文庫中，則是在重鏈的CDR3中進行有限數(shù)量的隨機化[23]。合成與半合成的文庫一般是用來淘選針對自身抗原的抗體，且由于合成文庫具有較高的多樣性，還可用于分離針對其他抗原靶標的高親和力抗體。

2.2 噬菌體的淘選 創(chuàng)建文庫后，就可使用固定或標記抗原進行抗原特異性噬菌體抗體的富集[24]，這一步被稱為噬菌體淘選。淘選首先需將抗原固定在固相載體上，加入噬菌體顆粒后，使得表達特異性抗體的噬菌體與抗原結(jié)合。抗原分子一般是通過親水或疏水的非共價作用力被動吸附在活化表面上的，這一作用力可以保證抗原分子在整個淘選過程中被牢牢吸附。而一些分子量低的抗原需要借助載體蛋白的連接吸附在活化表面上。在固定過程中，抗原結(jié)構(gòu)可能會出現(xiàn)一定程度的改變，從而導致針對被動吸附抗原所分離的抗體不能識別溶液中游離抗原的情況[18]。另一種常見的固定方法是先將靶抗原與生物素偶聯(lián)，再通過與已固定在活化表面的鏈霉親和素的相互作用將抗原固定在表面上[25]。除此之外，還可以將表達表面抗原的整個細胞作為淘洗過程中的抗原，Mutuberria就使用固定的哺乳動物細胞進行淘選[26]，Palmer則是應用活細胞原位淘選靶抗原[27]。

加入噬菌體文庫與抗原進行孵育后，需要使用洗滌緩沖液洗掉未結(jié)合的噬菌體，一般會使用處于生理pH下、含有吐溫-20的非離子洗滌劑。洗滌的嚴格性與噬菌體同抗原的孵化時間、洗滌劑的濃度、洗滌緩沖液的pH值以及目標抗原的濃度等條件相關[28]。嚴格的洗滌條件更有利于展示高親和力抗體的噬菌體富集，但多輪次淘選過程會使一些親和力較低的噬菌體被去除，從而導致淘選后的克隆多樣性差。在淘選過程中需獲得的不僅是親和力高的抗體，有時更需要分離出與特定表位結(jié)合或具有所需特定功能的抗體。故在最初幾輪淘選中，洗滌條件不應設置的過于嚴格，而是應隨著淘選循環(huán)的進行不斷提升。

洗去未結(jié)合的噬菌體后，需要洗脫與抗原結(jié)合的高親和力噬菌體。最常用的是例如甘氨酸、檸檬酸等酸性或堿性緩沖液[29]。但需注意要把洗脫噬菌體的pH值中和到8左右，以避免噬菌體降解或失去感染性。高親和力的噬菌體也可通過與過量游離的抗原進行競爭達到洗脫的目的[30]，但若用于競爭的游離抗原濃度或親和力不夠高，則可能會出現(xiàn)洗脫偏向風險。Rothe使用CysDisplay技術(shù)洗脫高親和力噬菌體，該技術(shù)是通過二硫鍵將抗體片段連接到PIII上，再通過添加二硫蘇糖醇以減少二硫鍵，從而將噬菌體從固定的抗原中釋放出來[31]。

經(jīng)過幾輪淘選后，在分離出的噬菌體池中進行ELISA檢測，以確定在池中是否有針對特定抗原的噬菌體的富集。通過ELISA確定的陽性克隆可通過測序直接識別抗體基因，也可繼續(xù)進行下游基因工程改造。隨著下一代測序(NGS)技術(shù)、生物信息學的不斷發(fā)展，利用高通量篩選抗體的方法也不斷涌現(xiàn)。Lyndon使用了一種名為PhageXpress的方法，通過利用電流體力學方法快速選擇單鏈抗體序列，并通過對包含噬菌體文庫顆粒的溶液進行操縱來增強其與靶標的結(jié)合[32]。

3 噬菌體展示技術(shù)制備單克隆抗體的優(yōu)缺點

相比起傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)，以及后續(xù)逐漸發(fā)展的嵌合抗體、人源化抗體，噬菌體展示技術(shù)制備單克隆抗體具有幾個明顯的優(yōu)勢。首先是其極大的提高了抗體庫容量，使其能進行高通量的篩選，從雜交瘤技術(shù)只能篩選幾千個克隆提升到了106個克隆。其次噬菌體展示技術(shù)的操作相比起來較為簡便，且效率較高，可以大規(guī)模工業(yè)化的生產(chǎn)單克隆抗體。同時，噬菌體展示技術(shù)可以直接得到抗體基因，便于進一步構(gòu)建各種基因工程抗體，還可用于一些難于制備的抗體，如針對弱免疫原、毒性抗原的抗體。除此之外，重組噬菌體的純化步驟簡單，不需昂貴的試劑與設備，在一般的實驗室條件下就可以完成。

噬菌體展示技術(shù)也存在一些不足。其一是目前所建的抗體庫容量有限，構(gòu)建大片段的肽庫很困難，且噬菌體展示文庫一旦建成，就很難再進行有效的體外突變和重組，進而限制了文庫中分子遺傳的多樣性，所以現(xiàn)在提高抗體庫的庫容及多樣性是該技術(shù)亟待解決的問題。其二，不是所有的多肽與蛋白質(zhì)都能成功地展示在噬菌體表面，可能由于其疏水性強或影響外膜蛋白的折疊等原因無法展示。此外，需持續(xù)優(yōu)化篩選方法以獲得高親和力的抗體，且克服淘選中容易出現(xiàn)的陽性克隆丟失及出現(xiàn)假陽性克隆也是迫切需要解決的問題。

4 噬菌體展示技術(shù)制備單克隆抗體及應用

利用噬菌體展示技術(shù)開發(fā)針對傳染病病原的單克隆抗體的過程是十分快速的。Schofield使用甲型肝炎病毒HM-175株的完整衣殼蛋白，從黑猩猩骨髓的cDNA文庫中進行篩選，制備出了四株對甲型肝炎病毒衣殼的單克隆抗體[33]。而Lillo等從針對鼠疫耶爾森菌A1122株的單鏈抗體庫中獲取了一株對鼠疫桿菌F1抗原具有強中和、抗感染作用的單克隆抗體[34]。而將針對同一病原不同亞型的免疫文庫進行多樣化組合形成組合庫，還可以分離出針對多種亞型所具有的共同保守表位的單克隆抗體[35]。通過該方法，Kashyap從5名H5N1感染康復者所共同構(gòu)建的抗體庫中獲取了近300種針對H5N1病毒的單克隆抗體，其中有幾株具有廣泛的中和活性[36]。近年來，新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)在全世界范圍內(nèi)廣泛流行，對全世界公共衛(wèi)生安全構(gòu)成了嚴重威脅。利用噬菌體展示技術(shù)制備單克隆抗體是獲得針對SARS-CoV2單抗的一種快速有效的方法。目前，全球范圍內(nèi)有許多研究小組正在采用噬菌體展示技術(shù)篩選針對該病的單克隆抗體，以用于疫苗的開發(fā)與評估[37]。Kim通過噬菌體展示技術(shù)開發(fā)了針對核衣殼蛋白的抗體，并將其應用于COVID-19的診斷[38]。Wrapp使用經(jīng)冠狀病毒刺突蛋白免疫的美洲駝構(gòu)建了噬菌體肽庫，并從中淘選出了對SARS-CoV2具有中和能力的VH-72抗體[39]。Huo使用SARS-CoV2的受體結(jié)合域(RBD)作為噬菌體淘選的抗原，從一個天然的駱駝單域抗體庫中分離出單克隆抗體H11-D4，并通過改進H11-D4的親和力成熟，得到了高親和力的突變體H11-H4[40]。Pan使用來源于8名COVID-19康復期患者的外周血單核細胞(PBMCs)構(gòu)建了兩個噬菌體免疫文庫，并從中獲取了具有高中和能力的單克隆抗體2B11[41]。

通過噬菌體展示技術(shù)篩選單克隆抗體的過程省略了細胞融合過程中繁瑣的步驟，也避免了因為雜交瘤細胞的不穩(wěn)定性而需要進行反復亞克隆的過程。使得噬菌體展示成為了快速制備單克隆抗體的一個不二選擇。雖然從特定疾病的免疫抗體庫中分離出的單克隆抗體相較之下具有更好的特異性，但由于技術(shù)和成本的影響，目前大多針對傳染病的單克隆抗體仍然是通過天然抗體庫分離而來。從實用性看，天然文庫的無偏性更好，幾乎可以分離出針對所有靶分子的單克隆抗體。且可以重復利用于多種疾病的單克隆抗體的開發(fā)，不必為每個新疾病都重新建立免疫抗體庫。盡管來源于天然文庫的單克隆抗體特異性稍差，但相較時間和成本，其還是成為了目前使用噬菌體展示技術(shù)篩選單克隆抗體的一個普遍選擇。

5 下一代測序技術(shù)與噬菌體展示技術(shù)的結(jié)合

下一代測序技術(shù)(Next-generation sequencing technology，NGS)又稱為高通量測序技術(shù)(High-throughput sequencing)，可以一次同時對大量核酸分子進行平行序列測定。通過NGS技術(shù)得到的大量測序數(shù)據(jù)非常適合于像抗體庫這樣擁有多樣化基因片段的復雜集合的全面分析。通常，應用傳統(tǒng)噬菌體展示技術(shù)獲得噬菌體陽性克隆，需要經(jīng)過三輪淘選后，通過ELISA方法先對數(shù)百至數(shù)千個克隆進行鑒定，再使用Sanger測序確定ELISA陽性克隆的序列。但由于噬菌體在大腸桿菌培養(yǎng)增殖過程中的傳播偏差[42]，使得一些克隆在一二輪的淘選過程中沒有被富集，導致在后續(xù)鑒定過程中因出現(xiàn)頻率較低而被忽略。而基于NGS技術(shù)的抗體克隆重建可以避免重復識別具有生長優(yōu)勢的高頻率克隆，并且可以識別和恢復許多在噬菌體淘選中低頻率存在的獨特克隆[43]。

Fischer首先在噬菌體展示技術(shù)篩選單克隆抗體的過程中使用了NGS技術(shù)[42]。他們使用Illumina平臺在一個多框架合成單鏈抗體庫中測序抗體的互補決定區(qū)H3 (CDRH3)，并采用NGS評估文庫質(zhì)量，跟蹤三輪篩選過程中重鏈種系和CDRH3長度分布的變化。并使用同樣的方法對半合成單鏈抗體文庫的CDRH3區(qū)進行測序，在噬菌體淘選輸出中獲取罕見的單鏈抗體克隆[44-45]。Lerner使用Roche’s 454對天然scFv文庫中噬菌體選擇輸出的VH區(qū)域進行了測序[46]。而Stark同樣使用Roche’s 454對合成Fab/scFv文庫的VH和VL區(qū)域進行測序，并通過NGS技術(shù)評估了文庫多樣性[22]。Lopez利用MiSeq平臺在合成的Fab文庫中對輸出的CDRH2-CDRH3區(qū)域進行測序并使用CDRH3信息分析氨基酸組成，監(jiān)測富集過程，通過片段組裝檢索稀有克隆[47]。Chung利用Illumina平臺分析了原始文庫和每輪淘選后的CDRH3序列，并通過兩步連接法PCR確定整個scFv基因[48]。Kris利用Ion Torrent測序平臺測序噬菌體Fab庫中所有多樣化的CDRs，將NGS測序得到的信息轉(zhuǎn)換為Fab克隆。并使用NGS輔助Fab重建方法從噬菌體淘選中獲得罕見的稀有克隆[49]。Nannini利用單分子實時(SMRT)測序與發(fā)夾接頭環(huán)相連接，以獲得全長的scFv序列，使得在淘選后可以快速分離和檢測從噬菌體展示文庫中富集的scFv抗體，從而獲得在傳統(tǒng)淘選中被忽略的陽性克隆[50]。

NGS技術(shù)能一次同時對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定，覆蓋了天然、免疫以及合成庫的全部庫容，解決了傳統(tǒng)噬菌體文庫篩選中更易篩選到高頻率克隆，出現(xiàn)篩選偏差的問題。使用高通量測序技術(shù)對篩選前后的噬菌體進行測序，并通過對淘選前后的抗體序列富集情況的判斷，可以更加方便地獲取抗體基因序列。NGS技術(shù)的加入不僅使通過噬菌體展示獲得單克隆抗體的過程變得更加簡單快速，還能獲得更多在傳統(tǒng)淘選的過程中被忽略的陽性克隆。而隨著高通量測序技術(shù)的不斷更新也將推動著噬菌體展示技術(shù)的進一步發(fā)展。

6 展 望

通過噬菌體展示技術(shù)篩選單克隆抗體的應用在近幾年顯著增加。由于候選肽和抗體對靶標的親和力對于單克隆抗體的發(fā)現(xiàn)至關重要，因此構(gòu)造高親和力、高多樣性的噬菌體展示文庫是亟需解決的問題。對于這一點，例如免疫文庫等定制的噬菌體展示文庫，可能是下一步的主要研究方向。同時，更有效的選擇策略也能進一步地推動噬菌體展示技術(shù)的發(fā)展。下一代測序技術(shù)因其對庫的多樣性的評估以及對低頻率克隆的拯救，加速了在噬菌體展示技術(shù)中發(fā)現(xiàn)和開發(fā)單克隆抗體的進程。且隨著測序技術(shù)的不斷進步，測序的深度和讀數(shù)長度也在不斷提高：例如，PacBio Sequel系統(tǒng)產(chǎn)生的序列大約是以前的RS II系統(tǒng)的7倍，而納米孔系統(tǒng)提供了實時DNA測序與超長讀數(shù)相結(jié)合的可能。隨著NGS技術(shù)不斷快速發(fā)展，其在噬菌體抗體展示庫中的應用可能會愈發(fā)重要。