循環(huán)長鏈非編碼RNA作為腫瘤診斷標志物的研究進展△

李夢仙，方哲偉，王俊玲，熊倩，楊錦四，李宏偉

曲靖市第一人民醫(yī)院檢驗中心，云南 曲靖 655000

腫瘤是導致人類死亡的主要原因之一，迅速增長的腫瘤發(fā)病率和病死率使全球癌癥控制更加刻不容緩。傳統(tǒng)生物標志物，如甲胎蛋白（α-fetal protein，AFP）、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）及糖類抗原 125（carbohydrate antigen 125，CA125）等的診斷效果不甚理想。由于缺乏有效的診斷方法，多數(shù)患者就診時已進展至晚期，錯過了最佳的救治時機。隨著分子研究的不斷深入，一些在腫瘤組織中特異性表達的基因逐漸引起了臨床的重視。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）在腫瘤細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學功能中的調(diào)控作用已被證實，lncRNA表達失調(diào)與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關[1-3]。但由于檢測組織中l(wèi)ncRNA的表達取材較為困難，且無法連續(xù)檢測腫瘤動態(tài)變化等，因此，尋求簡易無創(chuàng)的檢測方法變得極為迫切。研究表明，lncRNA可在人體血清或血漿等多種體液中穩(wěn)定表達[4]，在多種腫瘤患者血清或血漿中異常表達[5]。表明循環(huán)lncRNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，具有成為腫瘤潛在診斷標志物的強大潛力。本文就近年來循環(huán)lncRNA作為診斷標志物在肺癌、胃癌、結(jié)直腸癌中的研究進展進行綜述。

1 肺癌

肺癌是全球人類腫瘤相關死亡的主要原因之一[6]。在尚未出現(xiàn)明顯癥狀的早期階段發(fā)現(xiàn)肺癌，能有效降低患者的病死率。生物標志物對腫瘤的早期診斷有較高的應用價值[7]，因此，找到合適的腫瘤標志物是腫瘤研究的主要目標之一。

lncRNA肺腺癌轉(zhuǎn)移相關轉(zhuǎn)錄本1（metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）作為一個被廣泛認知的原癌基因，已被證實在乳腺癌、前列腺癌、肝癌及結(jié)腸癌等多種腫瘤中表達上調(diào)[8]。關于非小細胞肺癌的研究發(fā)現(xiàn)，血液中MALAT1的表達水平升高與TNM分期和淋巴轉(zhuǎn)移密切相關。MALAT1已被評估為非小細胞肺癌診斷和預后評估的候選血液生物標志物[9]。受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線顯示，血清MALAT1診斷肺癌的曲線下面積（area under the curve，AUC）為0.703，靈敏度為60%，特異度為80%，表明MALAT1有望成為肺癌診斷的血清腫瘤標志物。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，MALAT1在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性和TNM分期為晚期的肺癌患者血清中表達水平顯著升高，提示患者可能預后不良。同時還發(fā)現(xiàn)，MALAT1在肺癌患者血清與石蠟包埋組織中的表達水平均高于非肺癌對照組。此外，體外細胞實驗發(fā)現(xiàn)，MALAT1有誘導腫瘤細胞生長、遷移的作用，進一步說明MALAT1與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關[10]。表明MALAT1作為非小細胞肺癌的診斷標志物和治療新靶點均可能有良好的應用前景。

Liang等[11]對肺癌組織的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA生長抑制特異性轉(zhuǎn)錄本5（growth arrest specific 5，GAS5）在肺癌組織中低表達，上調(diào)肺癌細胞中GAS5的表達可明顯促進肺癌細胞凋亡，且GAS5的表達與腫瘤大小及TNM分期有關。表明GAS5可參與調(diào)控肺癌進展，有潛力成為肺癌的診斷標志物和預后預測指標。因此，Liang等[11]對90例肺癌患者和33例健康對照者進行檢測發(fā)現(xiàn)，肺癌患者血漿和腫瘤組織中GAS5的表達水平明顯低于健康對照者；且其表達水平僅與TNM分期有關，與年齡、性別、吸煙情況、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及組織學類型均無相關性；此外，術后患者血漿GAS5的水平明顯高于術前。表明檢測血漿GAS5水平可以評估腫瘤動態(tài)。ROC曲線分析顯示，GAS5診斷肺癌的特異度和靈敏度分別為72.7%和82.2%，均高于CEA的64.8%和51.1%；GAS5、CEA聯(lián)合檢測能有效提高肺癌診斷的特異度和靈敏度，分別為90.9%和86.7%。以上研究均表明，血漿GAS5水平有成為肺癌無創(chuàng)診斷標志物的潛力[11]。

Wan等[12]研究納入73例肺腺癌患者、51例肺鱗狀細胞癌患者和51例健康對照者，檢測三組受試者血漿lncRNA前列腺癌相關轉(zhuǎn)錄物6（prostate cancer associated transcript 6，PCAT6）水平，ROC曲線顯示，血漿PCAT6診斷肺腺癌的AUC為0.921（95%CI：0.866～0.976），診斷肺鱗狀細胞癌的AUC為0.958（95%CI：0.911～1.000），均明顯高于此前報道的 GAS5（AUC=0.832，95%CI：0.754～0.893）、CEA（AUC=0.700，95%CI：0.611～0.779）診斷肺癌的AUC；PCAT6鑒別肺腺癌與健康對照者的靈敏度、特異度分別為87.67%、97.44%，鑒別肺鱗狀細胞癌與健康對照者的靈敏度和特異度分別為94.12%、100%，均高于GAS5+CEA聯(lián)合檢測診斷肺癌的86.70%、90.90%。表明血漿PCAT6是一種有潛力的非小細胞肺癌的非侵襲性診斷標志物，甚至比既往報道的生物標志物的臨床應用價值可能更好。

目前，肺癌的臨床診斷主要依賴于影像學檢查（CT或低劑量CT）和傳統(tǒng)血液腫瘤標志物[13]，但假陽性率較高，容易造成過度診斷，增加患者的心理壓力，且常年檢查積累的輻射也會損害患者的健康。傳統(tǒng)腫瘤標志物靈敏度和特異度不高，因此高靈敏度和特異度的血清標志物對非小細胞肺癌的診斷具有重要意義。在腫瘤診斷的應用上，液體活檢比傳統(tǒng)成像和傳統(tǒng)活檢具有更高的靈敏度和特異度[14-15]。所以腫瘤來源的循環(huán)lncRNA檢測對于腫瘤診斷尤其是非侵襲性腫瘤及腫瘤動態(tài)監(jiān)測具有重要意義。

2 胃癌

血漿或血清中的循環(huán)lncRNA已成為非侵入性診斷的一個新興領域，但診斷早期胃癌的循環(huán)lncRNA的研究仍較少。lncRNA H19作為最早被報道在多種腫瘤中高表達的基因之一[16]，在胃癌患者血漿中穩(wěn)定高表達[17]。Zhou等[18]基于以往研究報道，檢測8個在胃癌中表達失調(diào)的lncRNA在70例胃癌患者腫瘤組織和血漿、70例健康對照者血漿中的表達水平，同時經(jīng)過室溫孵育、RNA酶處理驗證穩(wěn)定性后發(fā)現(xiàn)，只有HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA（HOX transcript antisense RNA，HOTAIR）、H19在胃癌患者腫瘤組織及血漿中表達上調(diào)；進一步檢測20例胃癌患者的血漿發(fā)現(xiàn)，僅有H19的表達不受外周血細胞的影響；此外，ROC曲線發(fā)現(xiàn)，H19診斷胃癌的AUC為0.838，特異度和靈敏度分別為72.9%和82.9%。H19在胃癌患者血漿中的表達情況符合理想腫瘤標志物的特點，即取材方便、經(jīng)濟有效、可重復且準確度高。該研究還發(fā)現(xiàn)，同一患者血漿H19水平在術前明顯高于術后，提示H19的血漿濃度反映了腫瘤動態(tài)，可作為一種新的血漿生物標志物監(jiān)測腫瘤狀態(tài)。Hashad等[19]研究同樣發(fā)現(xiàn)，lncRNA H19在胃癌患者血漿中穩(wěn)定高表達，且與CEA聯(lián)合診斷的效果更佳，即H19聯(lián)合CEA診斷胃癌的AUC為0.804，高于H19單獨診斷的0.724。由此可見，H19在胃癌患者血漿中穩(wěn)定高表達，是對胃癌有強大診斷潛力的血清標志物。

此外，Li等[20]分別檢測了胃癌患者、胃上皮異常增生患者及健康對照者血漿lncRNA LINC00152的水平，結(jié)果顯示，胃癌患者血漿LINC00152水平明顯高于胃上皮異常增生患者及健康對照者；血漿LINC00152診斷胃癌的靈敏度和特異度分別為48.1%和85.2%，特異度明顯高于CEA和糖類抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）單獨檢測（特異度分別為30.0%、42.0%）；隨后該研究比較了同一患者血漿中的LINC00152水平和從相同體積的血漿中分離出來的外泌體中的LINC00152水平，結(jié)果顯示二者并無差異。表明血漿中LINC00152主要存在于外泌體中，外泌體是保護血漿LINC00152穩(wěn)定表達的主要因素，進一步說明血漿LINC00152有作為胃癌診斷生物標志物的潛力。

Rui等[21]檢測126例胃癌患者和120例健康者血清發(fā)現(xiàn)，循環(huán)lncRNA HOXA遠端轉(zhuǎn)錄反義RNA（HOXA distal transcript antisense RNA，HOTTIP）在胃癌患者中表達水平明顯高于健康者，且HOTTIP水平與腫瘤浸潤深度及TNM分期均呈正相關；ROC曲線顯示，HOTTIP診斷胃癌的AUC為0.827，明顯高于 CEA、CA19-9、糖類抗原 72-4（carbohydrate antigen 72-4，CA72-4）單獨檢測的AUC，分別為0.653、0.685和0.639，且HOTTIP與CEA、CA19-9、CA72-4聯(lián)合檢測時診斷價值也優(yōu)于各指標單獨檢測（HOTTIP與CEA、CA19-9、CA72-4聯(lián)合檢測時，AUC為 0.870）；此外，Kaplan-Meier分析顯示，HOTTIP水平升高與胃癌患者的總生存率較低相關。由此可見，循環(huán)lncRNA HOTTIP可能是胃癌診斷和預后評估的潛在生物標志物。

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，盡管胃癌的病死率居全球所有惡性腫瘤第二位，但早期診斷、早期治療能明顯改善患者的預后[22]。體液中的生物標志物具有早期輔助診斷腫瘤的潛在能力，而傳統(tǒng)的CEA、CA19-9等胃癌標志物的靈敏度和特異度均較低[23]。從目前的研究來看，這些新型血清生物標志物與傳統(tǒng)生物標志物聯(lián)合應用能有效提高診斷效能，尋求靈敏度和特異度均較高的腫瘤標志物對胃癌的診斷十分重要。

3 結(jié)直腸癌

目前，臨床結(jié)腸癌的診斷主要依賴結(jié)腸鏡檢查和血清腫瘤標志物CEA檢測[24]，但結(jié)腸鏡檢查是有創(chuàng)檢查且應用不方便，還可能引起其他并發(fā)癥，而CEA則在腫瘤早期表現(xiàn)出較低的診斷靈敏度和特異度。越來越多的研究致力于發(fā)現(xiàn)新的結(jié)腸癌特異性診斷標志物。lncRNA結(jié)直腸腫瘤差異表達基因-h（colorectal neoplasia differentially expressed-h，CRNDE-h）的表達不僅具有組織特異性，同時還有時空差異性[25]，即CRNDE-h在人類早期發(fā)育中高表達，在成年人組織中低表達甚至不表達。由于從疑似結(jié)腸癌患者中獲得組織較為困難，所以盡管Liu等[26]既往的研究發(fā)現(xiàn)，CRNDE-h在結(jié)腸癌組織中高表達且其高表達與腫瘤體積增大、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移等顯著相關，但CRNDE-h能否作為結(jié)腸癌無創(chuàng)且靈敏度和特異度均較高的生物標志物仍有待研究。Liu等[27]后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA CRNDE-h水平在結(jié)直腸癌患者血清中顯著升高，能有效區(qū)分結(jié)直腸癌與良性結(jié)直腸疾病，且其在血清中的含量不受RNA酶消化的影響；ROC曲線顯示，CRNDE-h診斷結(jié)直腸癌的特異度為94.4%，靈敏度為70.3%，診斷效能明顯優(yōu)于CEA單獨檢測（特異度為88.75%，靈敏度為37.16%）；多因素Cox回歸模型分析表明，血清CRNDE-h是結(jié)直腸癌患者預后的獨立影響因素，與經(jīng)典的影響因素如遠處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和CEA水平一樣。由此可見，血清CRNDE-h首次發(fā)現(xiàn)并被證實符合腫瘤標志物的關鍵特征，即無創(chuàng)、靈敏度高、特異度高且具有穩(wěn)定性。

4 小結(jié)與展望

在精準醫(yī)療的大背景下，以循環(huán)lncRNA為代表的無創(chuàng)檢測方法正逐步進入人們視線。其與組織活檢相比具有創(chuàng)傷小、患者痛苦小等優(yōu)點，與傳統(tǒng)腫瘤標志物相比具有更高的靈敏度和特異度，有望成為腫瘤診斷的新型生物標志物[28]。有益于臨床應用的腫瘤生物標志物應能夠在容易獲得的體液中準確檢測到，如血清、唾液或尿液等[29]。目前經(jīng)典的傳統(tǒng)腫瘤標志物檢測與腫瘤分期、病理類型相關，是腫瘤負荷的標志物[30]，臨床分期越晚陽性率越高，臨床檢測到時，疾病往往已進展至晚期，錯過了最佳的診斷和治療時機，且傳統(tǒng)腫瘤標志物臨床應用的特異度不高，如CEA是首個被應用于腫瘤診斷的癌胚蛋白，但CEA在血液中異常表達對區(qū)分結(jié)腸癌和一般惡性腫瘤不具有特異性[31]。除與其他腫瘤（包括胰腺癌、胃癌、肺癌、乳腺癌和睪丸癌）相關外，CEA在肝硬化、炎癥性腸病、慢性肺病和胰腺炎等良性病變中的表達水平也會升高。診斷標志物應具備較高的特異度以避免假陽性，導致患者受到不必要的干預及心理壓力。

從手術切除的腫瘤組織中進行腫瘤標志物檢測，雖然能直觀反映其在腫瘤中的表達情況，但由于取材困難及無法對疾病動態(tài)連續(xù)監(jiān)測等，臨床應用仍存在一定的局限性[32]。循環(huán)lncRNA檢測在腫瘤中有幾個潛在的臨床應用：①篩查和早期診斷；②評估手術或非手術治療的有效性；③隨訪期間監(jiān)測復發(fā)[33]。循環(huán)lncRNA作為腫瘤診斷的無創(chuàng)血清標志物有著廣闊的應用前景。多項研究顯示，循環(huán)lncRNA來源于被脂質(zhì)雙分子層穩(wěn)定包裹的外泌體[34-36]，保證了其在體液中穩(wěn)定表達，且外泌體作為細胞間信息傳遞的載體，可調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[37]，檢測外泌體的包含物對腫瘤的診斷及監(jiān)測均有重要意義。就目前的研究來看，尚未找到針對特定腫瘤類型的特異性循環(huán)lncRNA指標，如MALAT1不僅是非小細胞肺癌的候選血清診斷標志物，同時與前列腺特異性生物標志物——前列腺特異性抗原（prostate specific antigen，PSA）聯(lián)合使用可以在保持高靈敏度的同時提高前列腺癌的檢測特異度[38]。此外，對于血漿中哪種提取和檢測方法適合lncRNA、哪種分子最適合作為內(nèi)源性對照，目前還沒有被廣泛認可的統(tǒng)一共識。由此不難看出，雖然循環(huán)lncRNA可以在多種腫瘤患者血清中檢測到，且具有一定的診斷價值，但在臨床上廣泛應用還有待進一步研究探索。