鲴鰱鳙混養(yǎng)系統(tǒng)中微生物對(duì)氮素遷移轉(zhuǎn)化的影響

張 哲,高月香,張毅敏,*,陳玲玲,郭艷敏,朱月明,于江華

鲴鰱鳙混養(yǎng)系統(tǒng)中微生物對(duì)氮素遷移轉(zhuǎn)化的影響

張 哲1,高月香1,張毅敏1,2*,陳玲玲1,郭艷敏1,朱月明1,于江華2

(1.生態(tài)環(huán)境部南京環(huán)境科學(xué)研究所,江蘇 南京 210000；2.南京信息工程大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇 南京 211800)

通過(guò)實(shí)驗(yàn)室模擬富營(yíng)養(yǎng)化水體進(jìn)行鰱()鳙()鲴()混養(yǎng),結(jié)合同位素標(biāo)記與微生物檢測(cè),研究其中沉積物微生物群落的變化及其對(duì)氮素遷移轉(zhuǎn)化的影響,揭示鰱鳙鲴混養(yǎng)作用機(jī)制.結(jié)果表明,鰱鳙鲴混養(yǎng)增加了沉積物中氨化細(xì)菌(芽孢桿菌屬與假單胞菌屬)的數(shù)量,實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),與其它組相比,鰱鳙鲴組的芽孢桿菌屬()與假單胞菌屬()總占比最高,為31.2%,這增強(qiáng)了氨化作用,減少了沉積物中有機(jī)氮的含量,使得鰱鳙鲴組的15N (底質(zhì)沉積物)在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)降至726.8‰.鰱鳙鲴混養(yǎng)提高了沉積物中反硝化菌屬(動(dòng)膠菌屬與芽胞桿菌屬)的數(shù)量,實(shí)驗(yàn)結(jié)束,鰱鳙鲴組動(dòng)膠菌屬()與芽胞桿菌屬()占比顯著高于鰱鳙組(<0.05),達(dá)到8.17%、33.7%,使得系統(tǒng)中反硝化反應(yīng)加強(qiáng),使水體中更多的硝酸鹽氮轉(zhuǎn)化為氣態(tài)氮并移出水體,實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),與其它組相比,鰱鳙鲴組15N(硝酸鹽氮)降低至96.3‰,15N總含量也降低至6.94μmol.

鰱鳙鲴；混養(yǎng)；穩(wěn)定同位素技術(shù)；氮素；微生物群落

1996年,Xie[1]提出了“非經(jīng)典生物操縱理論”,即通過(guò)濾食性魚(yú)類(lèi)鰱()、鳙魚(yú)()攝食控制藍(lán)藻數(shù)量[1],之后被廣泛應(yīng)用.但鰱魚(yú)的大量排泄會(huì)增加水體氮素水平,影響水質(zhì)[2],所以鰱鳙魚(yú)控藻引起氮素升高也成為了其應(yīng)用的限制.微生物群落通過(guò)氮礦化、硝化與反硝化作用等方式影響水中氮素的遷移轉(zhuǎn)化[3],并且一般是在沉積物-水界面進(jìn)行的[4].陳玲玲等[5]采用了鰱鳙魚(yú)與一種底層雜食性魚(yú)類(lèi)細(xì)鱗斜頜鲴()[6-7]混養(yǎng),利用鲴魚(yú)習(xí)慣攝食沉到水體底部的有機(jī)碎屑和腐殖質(zhì)及魚(yú)類(lèi)糞便[8]的特性,對(duì)其在食物鏈起到的作用進(jìn)行研究,卻忽略了鲴魚(yú)攝食時(shí)對(duì)沉積物的生物擾動(dòng),能夠?qū)Τ练e物-水界面中微生物群落產(chǎn)生影響,并影響系統(tǒng)氮素循環(huán)[9].因此,有必要研究鰱鳙鲴混養(yǎng)的沉積物微生物變化及其對(duì)氮素遷移轉(zhuǎn)化的影響.

穩(wěn)定同位素技術(shù)因其能夠穩(wěn)定示蹤,通常被用作污染物的追蹤手段[10].王銀平等[11]通過(guò)對(duì)魚(yú)類(lèi)喂食15N標(biāo)記的微囊藻干粉顆粒,進(jìn)行系統(tǒng)中氮素遷移轉(zhuǎn)化的研究.不僅能夠顯示出系統(tǒng)氮素遷移轉(zhuǎn)化路徑,還能夠直觀地得到氮素在系統(tǒng)中水相、生物相、沉積物相含量變化.

本文采用室外模擬實(shí)驗(yàn),在模擬水體中混養(yǎng)不同組合的鰱鳙鲴魚(yú),通過(guò)喂食15N標(biāo)記的微囊藻進(jìn)行同位素標(biāo)記并定期檢測(cè)系統(tǒng)各相同位素比值和沉積物微生物樣本,研究鰱鳙鲴混養(yǎng)系統(tǒng)中微生物群落的變化和各相中15N的變化,旨在了解鰱鳙鲴混養(yǎng)系統(tǒng)中微生物群落的變化以及其對(duì)氮素遷移轉(zhuǎn)化的影響,為進(jìn)一步利用鰱鳙鲴混養(yǎng)生物操縱技術(shù)控制富營(yíng)養(yǎng)化水體提供理論參考.

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)鰱魚(yú)()體重: (65.34±2.25)g;體長(zhǎng):(16.54±0.78)cm,鳙魚(yú)()體重:(45.48±3.75)g;體長(zhǎng):(12.24± 0.69)cm,由蕪湖紅鑫生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司提供.實(shí)驗(yàn)鲴魚(yú)為細(xì)鱗斜頜鲴(),體重:(14.45±4.43) g;體長(zhǎng):(13.25±0.63)m (以下簡(jiǎn)稱(chēng)鲴魚(yú)),從湖南醴陵市國(guó)家鲴魚(yú)良種場(chǎng)引種.實(shí)驗(yàn)用水取自富營(yíng)養(yǎng)化池塘水,并利用200目浮游生物采集網(wǎng)去除浮游生物影響.

15N標(biāo)記微囊藻顆粒的制備:用1g/L的15NH4Cl (98atom%15N)的溶液培養(yǎng)銅綠微囊藻2周后,冷凍干燥并制成顆粒,平均投放入各桶中,各組平均投放15N含量為13.84μmol.

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)由1m3實(shí)驗(yàn)用桶、實(shí)驗(yàn)用水和模擬底質(zhì)組成,布置在室外空地.將清洗后的河沙平鋪在桶底作為模擬底質(zhì),并將實(shí)驗(yàn)用水注入850L后靜置2周.實(shí)驗(yàn)設(shè)置3組,每組3個(gè)重復(fù),對(duì)照組(1#～3#桶)不投放魚(yú);鰱鳙組(4#～6#桶)投放10尾鰱魚(yú)、6尾鳙魚(yú);鰱鳙鲴組(7#～9#桶)投放10尾鰱魚(yú)、6尾鳙魚(yú)與15尾鲴魚(yú).實(shí)驗(yàn)進(jìn)行30d,并24h曝氣處理.實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前,挑選健康活潑,體型相似的魚(yú)類(lèi),進(jìn)行24h饑餓處理.

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前,將15N標(biāo)記顆粒用紗布包裹投入桶中,實(shí)驗(yàn)期間魚(yú)類(lèi)生命體征良好.并在試驗(yàn)開(kāi)始前1d和第1, 5, 10, 15, 20, 25, 30d采集浮游藻類(lèi)(過(guò)濾水樣收集)、底部沉積物(利用沉積碎屑捕獲器收集)、水樣,同步進(jìn)行穩(wěn)定同位素比值測(cè)定;于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前1d和第1, 5, 10, 15, 20, 30d分別取鰱鳙組鰱、鳙和鰱鳙鲴組鰱、鳙、鲴進(jìn)行檢測(cè),同位素比值單位為‰;并在第15,30d分別取樣進(jìn)行水體沉積物微生物檢測(cè),對(duì)照組為D1(D1.1,D1.2,D1.3)與D2(D2.1,D2.2, D2.3);鰱鳙組為L(zhǎng)1(L1.1,L1.2,L1.3)與L2(L2.1,L2.2, L2.3);鲴鰱鳙組為G1(G1.1,G1.2,G1.3)與G2(G2.1, G2.2,G2.3),共18個(gè)樣品.

1.3 指標(biāo)測(cè)試與分析方法

微生物檢測(cè)采用Hiseq2500平臺(tái)進(jìn)行16SrRNA 基因高通量測(cè)序.

15N同位素比值測(cè)定:測(cè)量氨氮同位素的樣品采用Lehmann等[12]方法進(jìn)行預(yù)處理,測(cè)量氨氮同位素的樣品采用改進(jìn)的Holmes法進(jìn)行預(yù)處理[13],浮游藻類(lèi)、魚(yú)體及底質(zhì)沉積物采集后冷凍干燥,之后全部送入元素分析儀-同位素比質(zhì)譜儀聯(lián)機(jī)(FLASH 2000- Thermo Fisher DELTA V advantage,測(cè)定精度15N￡±0.1‰)中測(cè)定同位素,并通過(guò)公式[14]計(jì)算.

引入來(lái)表示樣品中同位素比值的變化,單位單位為‰.計(jì)算公式為

式中:樣品為樣品中15N與14N豐度之比;標(biāo)準(zhǔn)為標(biāo)準(zhǔn)物的15N與14N豐度之比,本文采用大氣氮標(biāo)準(zhǔn).

1.4 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS.2020和Origin2018軟件處理并采用單因素方差分析,運(yùn)用CANOCO 5及QIIME軟件進(jìn)行微生物數(shù)據(jù)相關(guān)處理.

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物群落分析

第15, 30d的水體沉積物18個(gè)樣品共產(chǎn)生1449個(gè)OUT,為了其數(shù)據(jù)處理的合理性,對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行了隨機(jī)抽平處理.

2.1.1 物種多樣性分析 由圖1可知,對(duì)照組、鰱鱅組和鲴鰱鱅組各組的樣品覆蓋度均達(dá)到0.99,接近1.實(shí)驗(yàn)第15, 30d,Chao指數(shù)均顯示為對(duì)照組<鲴鰱鳙組<鰱鳙組,且有魚(yú)組第15d指數(shù)大于第30d.實(shí)驗(yàn)期間,對(duì)照組的Shannon指數(shù)并無(wú)太大變化,而有魚(yú)組第30d較第15d檢測(cè)的樣品有了明顯降低,并表現(xiàn)為鲴鰱鳙組<鰱鳙組.

從下到上5條線(xiàn)分別代表最小值,第1個(gè)四分位數(shù),中位數(shù),第3個(gè)四分位和最大值

D1:對(duì)照組第15d; D2:對(duì)照組第30d; L1:鰱鳙組第15d; L2:鰱鳙組第30d; G1:鰱鳙鲴組第15d; G2:鰱鳙鲴組第30d,下同

2.1.2 物種差異性分析 應(yīng)用QIIME軟件并通過(guò)迭代算法計(jì)算,在不考慮物種豐度的情況下進(jìn)行計(jì)算,得到結(jié)果并繪制樣品差異性矩陣熱圖與PCoA分析圖.

由圖2可知,與有魚(yú)組相比,對(duì)照組實(shí)驗(yàn)期間物種差異性變化較小,有魚(yú)組差異性較大,且鰱鳙組高于鲴鰱鳙組,實(shí)驗(yàn)第15d時(shí),對(duì)照組平行樣品間的差異性明顯大于有魚(yú)組,有魚(yú)組中鲴鰱鳙組差異性最小;實(shí)驗(yàn)第30d時(shí),鰱鳙組平行樣品間差異性較大,對(duì)照組和鲴鰱鳙組相對(duì)較小,由圖2中的樣品差異性矩陣熱圖可知,實(shí)驗(yàn)期間不同系統(tǒng)間表現(xiàn)為有魚(yú)組彼此間差異性小于與對(duì)照組間的差異性.

2.1.3 群落組成組成及相對(duì)豐度分析 選出代表序列,與已知16S數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)后進(jìn)行物種分類(lèi),繪制profiling柱狀圖.

由圖3a可知,在門(mén)水平上,實(shí)驗(yàn)前期,對(duì)照組、鰱鳙組和鲴鰱鳙組變形菌門(mén)(Proteobacteria)占比最大,除此之外,浮霉菌門(mén)(Planctomycetes)和厚壁菌門(mén)(Firmicutes)相對(duì)占比也較高.隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行,3組微生物物種在樣品中相對(duì)百分比有所變化,主要表現(xiàn)為有魚(yú)組中厚壁菌門(mén)占比升高,浮霉菌門(mén)占比下降,對(duì)照組物種在門(mén)水平上變化不大,實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),鰱鳙組和鲴鰱鳙組厚壁菌門(mén)占比由7.90%、9.48%升高至24.30%、36.53%,而浮霉菌門(mén)由15.33%、13.44%降低至 6.13%、1.76%,而且鲴鰱鳙組變化幅度高于鰱鳙組.變形菌門(mén)變化不大,仍為優(yōu)勢(shì)菌門(mén).

由圖3(b)可知,在綱水平上分析,實(shí)驗(yàn)期間對(duì)照組變化并不明顯,而有魚(yú)組β-變形菌占比有小幅上升,同時(shí)α-變形菌綱占比小幅下降.有魚(yú)組中芽孢桿菌綱占比升高,浮霉菌綱占比下降,且鲴鰱鳙組變化幅度大于鰱鳙組,實(shí)驗(yàn)第30d時(shí),兩組芽孢桿菌綱占比分別為24.18%和34.41%,上升幅度分別是17.46和25.52個(gè)百分點(diǎn),而浮霉菌綱占比分別是4.59%和 1.64%,下降了7.24 和 8.45個(gè)百分點(diǎn),同時(shí)鲴鰱鳙組中芽孢桿菌綱成為優(yōu)勢(shì)菌綱.

由圖3(c)可知,在屬水平上,實(shí)驗(yàn)前期,對(duì)照組、鰱鳙組和鲴鰱鳙組均以假單胞菌屬()占比最高,有魚(yú)組中浮霉?fàn)罹鷮?)占比僅次于假單胞菌.實(shí)驗(yàn)后期,鰱鳙組硝化螺菌屬()有所上升至8.36%,假單胞菌屬占比下降.鰱鳙鲴組中假單胞菌屬基本保持不變,但動(dòng)膠菌屬()占比明顯上升至8.17%.除此之外,鰱鳙組和鲴鰱鳙組中芽胞桿菌屬()占比明顯上升,分別達(dá)到22.6%和33.7%,并且鰱鳙鲴組的芽孢桿菌屬(Bacillus)與假單胞菌屬(Pseudomonas)總占比各組最高,為31.2%.

圖2 樣品差異性矩陣熱圖與PCoA分析

2.2 氮素在各相中的變化

2.2.1 水相變化(15N(氨氮),15N(硝酸鹽氮)) 由圖4可知,實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后有魚(yú)組15N(氨氮),15N(硝酸鹽氮)開(kāi)始上升,15N(氨氮)在10d達(dá)到最大值,鰱鳙組與鰱鳙鲴組分別為688.3‰、586.7‰,之后開(kāi)始下降,最終鰱鳙組>鰱鳙鲴組;而對(duì)于15N(硝酸鹽氮)鰱鳙鲴組在20d達(dá)到最大值后下降至96.3%,鰱鳙組則一直保持上升,實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),鰱鳙組>鰱鳙鲴組.對(duì)照組15N(氨氮),15N(硝酸鹽氮)一直小幅上升并低于有魚(yú)組.

圖4 各組水相中δ15N的變化

2.2.2 生物相變化(15N(浮游藻類(lèi)),15N(魚(yú)體)) 由圖5(a)可知,實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后有魚(yú)組15N(浮游藻類(lèi))開(kāi)始上升,在第5d來(lái)到最大值后開(kāi)始下降,鰱鳙組在第10d開(kāi)始停止下降并趨于穩(wěn)定,而鰱鳙鲴組持續(xù)緩慢下降,最終鰱鳙組>鰱鳙鲴組(<0.01);而對(duì)照組在前期大幅增長(zhǎng)至15d達(dá)到最大值933.3‰,之后緩慢下降至實(shí)驗(yàn)結(jié)束,但仍顯著高于實(shí)驗(yàn)組(<0.01).

由圖5(b)可知,鳙魚(yú)的15N(魚(yú)類(lèi))變化基本一致,在前期短暫升高后,在后期略有下降并趨于平緩,而鲴魚(yú)在實(shí)驗(yàn)期間不斷上升,最終遠(yuǎn)高于兩組鰱鳙魚(yú)體內(nèi)15N含量(<0.01).

圖5 各組生物相中δ15N的變化

圖6 各組沉積物相中δ15N的變化

2.2.3 沉積物相變化(15N(底質(zhì)沉積物)) 由圖6可知,實(shí)驗(yàn)初期,鰱鳙組和鰱鳙鲴組的15N(底質(zhì)沉積物)持續(xù)增長(zhǎng),10d時(shí),鰱鳙組最大值865.4‰,隨后鰱鳙鲴組在15d也達(dá)到了最大值868.8‰,之后,雖然兩組值都有所下降,鰱鳙鲴組15N(底質(zhì)沉積物)在30d時(shí),降至726.8‰,而鰱鳙組下降更加明顯并在30d時(shí),鰱鳙組15N(底質(zhì)沉積物)極顯著小于鰱鳙鲴組(<0.01).對(duì)照組在前期同樣快速增長(zhǎng)并在第20d達(dá)到峰值1356.8‰,并在實(shí)驗(yàn)后期仍維持在較高水平,并極顯著高于有魚(yú)組數(shù)值(<0.01).

2.3 系統(tǒng)中15N的儲(chǔ)存量變化

選取第1,15,30d的數(shù)據(jù)進(jìn)行15N含量變化的分析.由表1可知,實(shí)驗(yàn)前期各組的沉積物腐殖質(zhì)中15N儲(chǔ)存量均為最高,對(duì)照組不斷增多,有魚(yú)組在15d達(dá)到最大值后,在30d有所下降,與15N-NH4+含量變化一致,而有魚(yú)組15N-NH4+含量不斷增加,可能是微生物活動(dòng)造成的.除此之外,各組15N總量占比在15d達(dá)到最大值后,在30d有所下降,對(duì)照組達(dá)到投放量的70.76%,而鰱鳙組,鰱鳙鲴組僅能達(dá)到54.93%與50.21%,這說(shuō)明系統(tǒng)中15N的含量與投放的15N含量收支間存在差距,相當(dāng)部分15N已離開(kāi)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng),微生物的活動(dòng)是影響氮素移出水體的重要因素,進(jìn)一步說(shuō)明了微生物與系統(tǒng)氮素遷移轉(zhuǎn)化之間聯(lián)系密切.

表1 各實(shí)驗(yàn)組不同相中15N含量與占比

注:不同字母表示差異顯著(<0.05).

2.4 不同細(xì)菌群落與水中的15N含量關(guān)系

為探究微生物對(duì)水體中氮素變化的影響,應(yīng)用CANOCO 5軟件,對(duì)微生物中相對(duì)豐度較高的菌數(shù)進(jìn)行DCA判斷,選擇RDA模型對(duì)其與水體中的15N(氨氮),15N(硝酸鹽氮)進(jìn)行冗余分析(RDA)[15].

如圖7所示,在分析結(jié)果中,兩因子射線(xiàn)之間夾角小于90°時(shí),為正相關(guān),距離越近,相關(guān)性越高,之間夾角大于90°時(shí),則成負(fù)相關(guān).對(duì)照組與鰱鳙組后期突然增長(zhǎng)的偶氮?dú)渚鷮?)與15N(氨氮),15N(硝酸鹽氮)密切相關(guān);鰱鳙組中的硝化螺菌屬()與15N(硝酸鹽氮)密切相關(guān),但在鰱鳙鲴組中動(dòng)膠菌屬()與芽胞桿菌屬()與15N(硝酸鹽氮)、15N(氨氮)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系.

3 討論

3.1 微生物群落分析

物種多樣性分析與差異性分析有魚(yú)組的沉積物微生物群落與對(duì)照組相比具有很大差異.而研究[16]表明養(yǎng)殖團(tuán)頭魴會(huì)通過(guò)排放糞便提供大量有機(jī)質(zhì),從而導(dǎo)致水體沉積物中微生物多樣性增加,養(yǎng)殖鰱鳙鲴魚(yú)也可以產(chǎn)生同樣影響.而鰱鳙鲴組微生物多樣性卻低于鰱鳙組,可能是鲴魚(yú)這種刮食性魚(yú)類(lèi)造成的,D?rte等[17]研究表明,刮食性動(dòng)物會(huì)對(duì)沉積物中的細(xì)菌進(jìn)行攝食.但這也表明了,雖然混養(yǎng)魚(yú)類(lèi)會(huì)提高沉積物中微生物的多樣性,但由于鲴魚(yú)的攝食,鰱鳙混養(yǎng)要比鰱鳙鲴混養(yǎng)時(shí)沉積物中微生物多樣性更好.但在之后鰱鳙鲴組微生物群落中,動(dòng)膠菌屬()、假單胞菌屬()與芽胞桿菌屬()占比顯著高于鰱鳙組對(duì)應(yīng)菌屬,這是因?yàn)轹耵~(yú)等刮食類(lèi)動(dòng)物雖然可以攝食微生物,但據(jù)研究[18-19]表明這只是造成了生長(zhǎng)繁殖緩慢的硝化類(lèi)細(xì)菌的減少,而具有高生長(zhǎng)率并且在魚(yú)類(lèi)腸道內(nèi)高存活率的反硝化細(xì)菌并未受到太大影響.由此可見(jiàn),混養(yǎng)鲴魚(yú)會(huì)降低沉積物微生物群落的多樣性但會(huì)提高反硝化菌屬等的占比.

3.2 系統(tǒng)中氮素的遷移轉(zhuǎn)化

通過(guò)對(duì)系統(tǒng)中各相15N含量的測(cè)量,可以清晰地看到氮素在系統(tǒng)中的遷移轉(zhuǎn)化是一種以食物鏈為主體的物質(zhì)循環(huán)過(guò)程,被標(biāo)記的微囊藻顆粒進(jìn)入水體后,一部分被鰱鳙魚(yú)攝食后,以糞便的形式沉入水底,一部分以藻類(lèi)碎屑的形式直接沉入水底,導(dǎo)致了15N(底質(zhì)沉積物)前期的增長(zhǎng);隨后通過(guò)微生物作用釋放產(chǎn)生15N-NH4+和15N-NO3-,進(jìn)入水體后引起了15N(氨氮)和15N(硝酸鹽氮)前期大幅增長(zhǎng);水中的浮游藻類(lèi)吸收了進(jìn)入的氮素,導(dǎo)致15N(浮游藻類(lèi))的增大,這與flynn等[20]的研究結(jié)果一致.浮游藻類(lèi)不論是自身的衰亡還是被鰱鳙魚(yú)攝食,都會(huì)重新沉入底部,同時(shí)魚(yú)類(lèi)攝食同化也使15N進(jìn)入魚(yú)體.這就是系統(tǒng)中氮素的遷移轉(zhuǎn)化過(guò)程.對(duì)于鰱鳙鲴組,鲴魚(yú)會(huì)在底部攝食鰱鳙魚(yú)糞便等碎屑[21]并排放糞便;而對(duì)照組由于缺少魚(yú)類(lèi)形成的食物鏈,只能通過(guò)自然沉降使被標(biāo)記的微囊藻碎屑進(jìn)入沉積物中,再進(jìn)行遷移轉(zhuǎn)化,而各相氮素變化也與陳少蓮等[22]的研究結(jié)果相符合.但是氮素總量在遷移轉(zhuǎn)化過(guò)程中是有所變化的,在15N的收支平衡分析中,系統(tǒng)中的氮素在不斷減少,這是因?yàn)槌练e物中存在微生物,這些微生物會(huì)通過(guò)硝化-反硝化反應(yīng)將水體中的氮素轉(zhuǎn)化為氣態(tài)并移出水體,所以分析微生物在氮素遷移轉(zhuǎn)化過(guò)程中的作用成為研究重點(diǎn).

3.3 沉積物中微生物對(duì)氮素遷移轉(zhuǎn)化的影響

3.3.1 微生物對(duì)沉積物相中15N的影響 從圖6可以看出,對(duì)比對(duì)照組的15N(底質(zhì)沉積物),有魚(yú)組的15N(底質(zhì)沉積物)在后期有了下降趨勢(shì)并且水平較低,而圖3c微生物群落分析中,鰱鳙組與鰱鳙鲴組的沉積物中芽孢桿菌屬與假單胞菌屬占比總和在后期卻有所升高,達(dá)到28.6%與41.62%,較第15d相應(yīng)提高了約2.8倍與4倍.

有研究表明[23],在標(biāo)記物碎屑沉積到水體底部后,會(huì)立即釋放大量的溶解性有機(jī)氮,這些有機(jī)氮75%以上為蛋白質(zhì)等高分子物質(zhì),而更容易被微生物吸收利用的氨基酸、核苷酸等小分子物質(zhì)只有不到5%[24].從高分子物質(zhì)到小分子物質(zhì),需要許多酶的共同分工作用,氨化細(xì)菌分泌的蛋白質(zhì)水解酶等可能是其中的關(guān)鍵酶[25],它能將蛋白質(zhì)等高分子物質(zhì)分解為氨基酸等小分子物質(zhì).Bach等[26]發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬中的熒光假單胞菌、噬細(xì)胞菌屬都可以分泌金屬蛋白酶,除此之外,Watanabe等[27]也提出芽孢桿菌屬尤其是蠟狀芽孢桿菌分泌的肽酶是多肽降解的主要酶種.而當(dāng)15N標(biāo)記的高分子含氮物質(zhì)降解為小分子時(shí),它會(huì)被微生物吸收并通過(guò)轉(zhuǎn)氨基-解聚-脫氨基作用轉(zhuǎn)化成銨離子(15N-NH4+)排出體外[28].鰱鳙鲴組沉積物中的假單胞菌屬與芽孢桿菌屬就是通過(guò)這種方式減少了底部沉積物中15N的含量,不僅如此,考慮到鲴魚(yú)的攝食活動(dòng)[24]會(huì)導(dǎo)致部分含氮沉積物進(jìn)入沉積物相深處,造成內(nèi)源氮素的累積,鰱鳙鲴組沉積物中的氮素仍能有所下降,這也說(shuō)明了鰱鳙鲴組沉積物中增多的氨化細(xì)菌避免了混養(yǎng)鲴魚(yú)造成內(nèi)源氮素的累積,同時(shí)促使沉積物向水中加快釋放氮素,促進(jìn)了氮素的遷移轉(zhuǎn)化.

3.3.2 微生物對(duì)水相中15N的影響 水中參與氮素遷移轉(zhuǎn)化過(guò)程的15N主要是由15N-NH4+和15N- NO3-形式組成.而沉積物中微生物致使系統(tǒng)氮素?zé)o法平衡,正是沉積物中的微生物群落對(duì)水中15N- NH4+和15N-NO3-產(chǎn)生影響,使部分15N以氣態(tài)的形式移出水體.通過(guò)占比較大的硝化與反硝化菌屬與15N(氨氮)、15N(硝酸鹽氮)變化的冗余分析來(lái)具體探究導(dǎo)致這種情況的原因.

微生物群落對(duì)15N(氨氮)、15N(硝酸鹽氮)的影響主要通過(guò)硝化、反硝化反應(yīng)進(jìn)行.硝化反應(yīng)主要是通過(guò)沉積物中的硝化細(xì)菌將沉積物中產(chǎn)生的15N-NH4+氧化為15N-NO3-,硝化反應(yīng)一般發(fā)生在沉積物的上表層[29],是一種普遍的微生物反應(yīng),這也導(dǎo)致了各實(shí)驗(yàn)組前期15N(硝酸鹽氮)的不斷上升.圖7b顯示的鰱鳙組后期占比增加的硝化螺菌屬(),與NO3-具有明顯的相關(guān)性,鰱鳙組后期15N(硝酸鹽氮)不斷增大,是因?yàn)樗梢酝ㄟ^(guò)硝化反應(yīng)生成硝酸鹽[30-31],使底部釋放的15N-NH4+轉(zhuǎn)化為15N-NO3-,從而促進(jìn)了氮素在系統(tǒng)中的循環(huán).

反硝化作用一般發(fā)生在富含硝酸鹽氮的區(qū)域,也即沉積物表層2～5cm[32].與硝化反應(yīng)不同,反硝化反應(yīng)是將硝酸鹽直接轉(zhuǎn)化為N2等含氮?dú)怏w,直接作用于水體中硝酸鹽氮[33].通過(guò)對(duì)鰱鳙鲴組的冗余分析(圖7),發(fā)現(xiàn)后期占比增加的動(dòng)膠菌屬()與15N(硝酸鹽氮)明顯負(fù)相關(guān),高春娣等[34]研究發(fā)現(xiàn),動(dòng)膠菌屬形成的菌膠團(tuán)不僅減少水中懸浮物、COD,而且動(dòng)膠菌屬好氧與化能異養(yǎng)的特性,能夠使其在厭氧條件下,在電子傳遞反應(yīng)中,分泌硝酸還原酶將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽.除此之外,在實(shí)驗(yàn)后期占比較大的假單胞菌屬()其中一些菌種,也被發(fā)現(xiàn)具有反硝化特性,并且還被發(fā)現(xiàn)可以在好氧條件下,分泌各種還原酶,使硝酸鹽轉(zhuǎn)化為N2O的好氧反硝化反應(yīng)[35].由此可知,鰱鳙鲴組實(shí)驗(yàn)后期15N(硝酸鹽氮)呈現(xiàn)的下降趨勢(shì),是沉積物中的動(dòng)膠菌屬與假單胞菌屬等反硝化細(xì)菌增多,導(dǎo)致好氧、厭氧反硝化反應(yīng)加強(qiáng)的結(jié)果.除了直接影響15N(硝酸鹽氮)的微生物之外,也有對(duì)15N(氨氮)產(chǎn)生影響的,在圖7冗余分析中,芽孢桿菌屬()與15N(氨氮)呈明顯負(fù)相關(guān),而芽孢桿菌屬是厚壁菌門(mén)中具有良好凈化能力的菌屬,好氧兼性厭氧的特性使其能夠利用有機(jī)碳源生長(zhǎng),并將水中含氮化合物轉(zhuǎn)化為硝酸鹽、亞硝酸鹽等,并同時(shí)進(jìn)行好氧反硝化,直接將其異養(yǎng)硝化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為含氮?dú)怏w[36],蒙海林等[37]在養(yǎng)殖池塘中發(fā)現(xiàn)了能夠去除氨氮的芽孢桿菌屬菌株,這也再次證明,芽孢桿菌屬能有效降低鰱鳙鲴組水中的15N-NH4+,造成實(shí)驗(yàn)后期鰱鳙鲴組15N(氨氮)持續(xù)下降.由此可知,實(shí)驗(yàn)后期,鰱鳙鲴組的微生物群落通過(guò)增強(qiáng)反硝化反應(yīng),將水中15N-NO3-轉(zhuǎn)化為含氮?dú)怏w移出水體,導(dǎo)致遷移和轉(zhuǎn)化過(guò)程中氮素的不平衡.

一直以來(lái),能夠?qū)Τ练e物造成擾動(dòng)的生物被廣泛研究,它們被認(rèn)為能夠加速碎屑中的氮素在水-泥兩相中循環(huán),加快氮的遷移轉(zhuǎn)化[38-39].Stief等[40]研究發(fā)現(xiàn)大型底棲水生生物通過(guò)擾動(dòng)使底部好氧-厭氧界面增多,使水中的有機(jī)質(zhì)與營(yíng)養(yǎng)鹽進(jìn)入底部界面中,促進(jìn)微生物耦合的硝化反硝化過(guò)程,使氮素轉(zhuǎn)移出水體[41].鲴魚(yú)的生物擾動(dòng)也具有相同的效果,除此之外,在對(duì)沉積物微生物群落進(jìn)行研究后,發(fā)現(xiàn)鲴魚(yú)還可以通過(guò)攝食、排泄等行為提高反硝化菌屬的占比.

由上述分析可知,鲴魚(yú)通過(guò)其攝食與排泄行為,增加了氨化細(xì)菌(假單胞菌屬、芽孢桿菌屬)的數(shù)量,增強(qiáng)了氨化作用,加快底質(zhì)沉積物中氮素的釋放;使生長(zhǎng)繁殖緩慢的硝化類(lèi)細(xì)菌減少,而具有高生長(zhǎng)率并且在魚(yú)類(lèi)腸道內(nèi)高存活率的反硝化細(xì)菌并未受到太大影響,造成了反硝化細(xì)菌(動(dòng)膠菌屬、芽孢桿菌屬等)占比增加,增強(qiáng)了硝化-反硝化反應(yīng),使更多的氮轉(zhuǎn)移出水體.

4 結(jié)論

4.1 鰱鳙鲴混養(yǎng)增加了沉積物中氨化細(xì)菌(芽孢桿菌屬與假單胞菌屬)的數(shù)量,實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),與其它組相比,鰱鳙鲴組的芽孢桿菌屬()與假單胞菌屬()總占比最高,為31.2%,這增強(qiáng)了氨化作用,減少了沉積物中有機(jī)氮的含量,使得鰱鳙鲴組的15N(底質(zhì)沉積物)在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)降至726.8‰,從而加快了系統(tǒng)中氮素的遷移轉(zhuǎn)化.

4.2 鰱鳙鲴混養(yǎng)提高了沉積物中反硝化菌屬(動(dòng)膠菌屬與芽胞桿菌屬)的數(shù)量,實(shí)驗(yàn)結(jié)束,鰱鳙鲴組動(dòng)膠菌屬()與芽胞桿菌屬()占比顯著高于鰱鳙組(<0.05),達(dá)到8.17%、33.7%,使得系統(tǒng)中反硝化反應(yīng)加強(qiáng),使水體中更多的硝酸鹽氮轉(zhuǎn)化為氣態(tài)氮并轉(zhuǎn)移出水體,實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),與其它組相比,鰱鳙鲴組15N(硝酸鹽氮)降低至96.3‰,15N總含量也降低至6.94μmol,加快了系統(tǒng)中氮素的遷移轉(zhuǎn)化,并減少水中的氮素含量.

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The effects of microorganisms on the migration and transformation of nitrogen in the polyculture system of,and.

ZHANG Zhe1, GAO Yue-xiang1, ZHANG Yi-min1,2*, CHENG Ling-ling1, GUO Yan-min1, ZHU Yue-ming1, YU Jiang-hua2

(1.Nanjing Institute of Environmental Sciences,Ministry of Ecology and Environment,Nanjing 210000, China；2.School of Environmental Science and Engineering, Nanjing University of Information Engineering, Nanjing 211800, China)., 2022,42(2)：897～906

The polyculture system of(Xenocypris microlepis),(Silver carp) and(bighead carp) was set up in simulated eutrophic water. The dynamics of microbial communities and their effects on the migration and transformation of nitrogen in the sediments were investigated by applying isotopic labeling and microbial analysis to reveal the underlying mechanism of the polyculture system. The results showed that:The polyculture of Xenocypris microlepis, silver carp and bighead carp couldincrease the proportion ofandinvolved in the ammonification process in the sediments. Comparing with the silver carp and bighead carp group, the total proportion ofandin the polyculture group was the highest (31.2%) at the end of experiment, showing that it enhanced ammonification process and thus, reduced the content of organic nitrogen in the sediments.Consequently, the15N(substrate sediment)of the polyculture group decreased to 726.8‰. The polyculture of Xenocypris microlepis, silver carp and bighead carp couldincrease the proportion of denitrifying bacteria (and) in the sediments. The proportion ofandin the polyculture group was significantly higher than that in the silver carp and bighead carp group (<0.05), reaching 8.17% and 33.7%, respectively. Therefore, the denitrification process was enhanced in the system, converting more nitrate into nitrogen gas in the water and finally releasing this gas from this water. At the end of the experiment, in the polyculture group, the15N(nitrate nitrogen)decreased to 96.3‰ and the total content of15N decreased to 6.94μmol.

,and；polyculture；stable isotope technique；nitrogen；microbial community

X524

A

1000-6923(2022)02-0897-11

張 哲(1996-),男,山東德州人,南京信息工程大學(xué)碩士研究生,主要從事水環(huán)境治理和流域生態(tài)保護(hù)研究.發(fā)表論文2篇.

2021-05-12

國(guó)家水體污染控制與治理重大專(zhuān)項(xiàng)(2017ZX07202006);中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)專(zhuān)項(xiàng)(GYZX200204)

* 責(zé)任作者, 研究員, zym7127@163.com