山楂中黃酮的提取工藝及其調(diào)節(jié)糖脂代謝的活性研究

于舒雁，田碩

(1.鄭州黃河護(hù)理職業(yè)學(xué)院，鄭州 450042；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)，鄭州 450046)

1 概述

山楂又稱紅果、山里紅、酸里紅、酸棗等，為藥食兩用的植物[1]。山楂果實(shí)為圓球形，外皮紅色，表面具有斑點(diǎn)，在我國(guó)多地均有栽培。山楂入藥在我國(guó)有著悠久的歷史，《本草綱目》中記載其“酸甘味溫，消食積，補(bǔ)脾”[2]。大量藥理學(xué)研究表明，山楂具有消食健胃、行氣散瘀的作用，能促進(jìn)人體內(nèi)消化。山楂的生物活性物質(zhì)多樣，主要有黃酮類和皂苷類，具有較強(qiáng)的抗氧化、調(diào)節(jié)血脂、抗癌和降低膽固醇等作用[3]。迄今為止，已從山楂中分離了近70種黃酮類化合物，主要有槲皮素、芹菜素、木犀草素等。

山楂中黃酮類化合物的提取方法眾多[4-5]，提取方法不同及山楂提取部位不同均能影響總黃酮的提取率，見表1。

表1 山楂總黃酮的提取方法以及工藝Table 1 The extraction methods and technology of total flavonoids from hawthorn

由表1可知，山楂果中總黃酮的提取率相對(duì)于干果，山楂鮮果更易提取出黃酮化合物。

現(xiàn)代藥理研究表明黃酮物質(zhì)可通過多種機(jī)制調(diào)節(jié)糖代謝和脂質(zhì)代謝。謝偉華用山楂黃酮短期處理小鼠，結(jié)果表明山楂黃酮化合物能降低小鼠血清中的甘油三酯(TG)和總膽固醇(TC)，并能顯著地提高高密度脂蛋白(HDL-C)水平[18]。黃欣欣以SD小鼠為實(shí)驗(yàn)材料，研究分析了大果山楂黃酮類物質(zhì)對(duì)高脂血癥小鼠相關(guān)指標(biāo)的影響，結(jié)果表明大果山楂黃酮能有效降低小鼠血清和肝臟組織中TC和TG的含量[19]。

本課題組對(duì)山楂開展了黃酮化合物提取工藝和調(diào)節(jié)糖脂代謝的研究，分別以山楂果肉、山楂皮和山楂籽為研究材料，探討山楂果不同部位所含黃酮類化合物的差異。與此同時(shí)，本文還建立了小鼠高脂血模型，以期探討山楂黃酮化合物對(duì)小鼠糖脂代謝的影響。

2 材料與方法

2.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)材料：山楂鮮果，購(gòu)于當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔、健康小鼠60只，雄性，體重(25±2) g。

實(shí)驗(yàn)試劑：0.4 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液、纖維素酶(15000 U/g)、果膠酶(50 U/g)、無(wú)水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉，血清TC和TG按照試劑盒的說明書進(jìn)行操作。

實(shí)驗(yàn)儀器：分光光度計(jì)、精密電子天平、干燥箱、離心機(jī)、恒溫水浴鍋、血糖測(cè)定儀。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 山楂原料處理

選擇健康、色澤鮮紅、個(gè)大飽滿的山楂，洗凈后去皮、去籽。將山楂果肉、果皮切成小塊，再將山楂籽清洗干凈，分別置于80 ℃恒溫干燥箱中干燥。待山楂果肉、果皮和山楂籽干燥后進(jìn)行粉碎，過80目篩，備用。

2.2.2 總黃酮含量測(cè)定方法

本文選用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法測(cè)定山楂中總黃酮的含量。取7支試管，按照表2依次添加0.4 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液、無(wú)水乙醇、5% NaNO2溶液、10% Al(NO3)3溶液和4% NaOH溶液，充分搖勻后，用無(wú)水乙醇定容至25 mL，搖勻后室溫靜置15 min，并于510 nm處測(cè)定吸光度值。以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，510 nm處吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：y=5.497x+0.022，R2=0.999。其中x為蘆丁濃度(mg/mL)，y為在510 nm處測(cè)定的蘆丁吸光值，其相關(guān)系數(shù)R2=0.999。

表2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的曲線繪制Table 2 The curve drawing of rutin standard solution

2.2.3 山楂果肉、山楂皮和山楂籽中總黃酮的提取

精準(zhǔn)稱取1.00 g山楂果肉、山楂皮和山楂籽粉末，置于帶冷凝管的圓底瓶中，按照料液比為1∶40 (g/mL)加入濃度為70%的乙醇40 mL，分別改變酶量和酶解時(shí)間，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。酶解結(jié)束后，置于300 W微波中加熱90 s。

2.2.4 山楂果肉、山楂皮和山楂籽中總黃酮的測(cè)定

吸取1 mL待測(cè)樣品代替蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，其余操作與1.2.2一致，計(jì)算待測(cè)樣品中總黃酮的提取量，公式如下：

總黃酮提取量=山楂提取液中的總黃酮含量(mg)/山楂原料(g)。

2.2.5 纖維素酶量對(duì)總黃酮提取量的影響

纖維素酶量分別為10，20，30，40，50，60 mg，70%的乙醇溶液40 mL，pH 6，60 ℃酶解2 h。反應(yīng)結(jié)束后處理方法同1.2.3。

2.2.6 果膠酶量對(duì)總黃酮提取量的影響

果膠酶量分別為10，20，30，40，50，60 mg，70%的乙醇溶液40 mL，pH 6，60 ℃提取2 h。反應(yīng)結(jié)束后處理方法同1.2.3。

2.2.7 酶解時(shí)間對(duì)總黃酮提取量的影響

加入40 mg纖維素酶和50 mg果膠酶，70%的乙醇溶液40 mL，pH 6，60 ℃提取20，40，60，80，100，120，140，160，180 min。反應(yīng)結(jié)束后處理方法同1.2.3。

2.2.8 構(gòu)建小鼠高脂血模型

選取60只健康雄性小鼠，隨機(jī)均分為6個(gè)組：空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、鹽酸二甲雙胍組、山楂黃酮低劑量組(1.0 g/kg)、中劑量組(2.0 g/kg)和高劑量組(3.0 g/kg)。除空白組外，其余5組均采用Bozóky等[20]研究的腹腔注射方法建立小鼠高脂血模型。將山楂黃酮粉溶于不同體積的生理鹽水中，制成不同濃度、粒徑約300 nm的均勻懸濁液，備用。小鼠高脂血模型建立后，每日灌胃給藥1次，空白組和模型組灌胃給予等體積生理鹽水，給藥周期為21 d。末次給藥4 h后，小鼠經(jīng)摘取眼球取血，全血離心后留血清待測(cè)。

3 結(jié)果與討論

3.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 纖維素酶量對(duì)總黃酮提取量的影響

圖1 纖維素酶量對(duì)總黃酮提取量的影響Fig.1 Effect of cellulose amount on the extraction amount of total favonoids

由圖1可知，纖維素酶量在10～40 mg之間，山楂總黃酮提取量隨著纖維素酶量的增加而增大。當(dāng)纖維素酶的添加量為40 mg時(shí)，山楂總黃酮提取量最大，為70.8 mg/g。然而當(dāng)纖維素酶添加量超過40 mg后，山楂總黃酮提取量不但不再增加，反而呈下降趨勢(shì)，原因可能是過多的纖維素酶會(huì)影響黃酮化合物的溶出。因此，山楂原料與纖維素酶的添加量比為1∶40 (g/mg)最佳。

3.1.2 果膠酶量對(duì)總黃酮提取量的影響

圖2 果膠酶量對(duì)總黃酮提取量的影響Fig.2 Effect of pectinase amount on the extraction amount of total favonoids

由圖2可知，果膠酶添加量在10～50 mg之間時(shí)，山楂總黃酮提取量隨著果膠酶添加量的增加呈上升趨勢(shì)。當(dāng)果膠酶量為50 mg時(shí)，山楂總黃酮提取量達(dá)63.1 mg/g。當(dāng)果膠酶量超過50 mg時(shí)，山楂黃酮提取量呈下降趨勢(shì)，表明過量的果膠酶會(huì)影響黃酮類化合物的溶出。因此，山楂原料與果膠酶量的最佳比例為1∶50(g/mg)。

3.1.3 酶解時(shí)間對(duì)總黃酮提取量的影響

圖3 酶解時(shí)間對(duì)總黃酮提取量的影響Fig.3 Effect of enzymolysis time on the extraction amount of total favonoids

由圖3可知，當(dāng)酶解時(shí)間在20～120 min之間時(shí)，山楂總黃酮的提取量隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，當(dāng)酶解時(shí)間為120 min時(shí)，總黃酮提取量高達(dá)109.4 mg/g。但酶解時(shí)間超過120 min后，山楂黃酮的提取量反而會(huì)下降，推測(cè)可能是因?yàn)槊附鈺r(shí)間過長(zhǎng)，導(dǎo)致胞內(nèi)的雜質(zhì)溶出，影響了黃酮類化合物的后續(xù)提取。因此，酶解的最佳時(shí)間為120 min。

3.2 提取山楂不同部位的總黃酮量

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以纖維素酶添加量40 mg、果膠酶50 mg、酶解時(shí)間120 min處理山楂原料，酶解結(jié)束后，將其置于300 W微波中加熱90 s，再按照2.2.4的測(cè)定方法檢測(cè)黃酮的提取量。

由圖4可知，與單微波法提取山楂中的總黃酮量相比，添加復(fù)合酶系(果膠酶和纖維素酶)能顯著地提高總黃酮的提取量，其中山楂果肉中總黃酮量提高了58.0%，山楂皮中總黃酮含量提高了54.3%，山楂籽中總黃酮含量提高了59.8%。山楂果中，黃酮提取含量由高到低為果肉>果皮>果籽。由此表明，山楂中不同部位所含有的黃酮量也不相同，其中山楂果肉中黃酮提取總量最高，可達(dá)117.5 mg/g，而山楂籽中黃酮的提取量最低，為25.6 mg/g。

圖4 兩種提取方法提取山楂不同部位的總黃酮量Fig.4 The amount of total flavonoids from different parts of hawthorn by two extraction methods

3.3 山楂果肉黃酮化合物對(duì)高脂血模型小鼠血脂指標(biāo)的影響

表3 各組FBG、TG、TC和HDL-C水平(x±s)Table 3 The FBG, TG, TC and HDL-C levels (x±s) in each group mmol/L

由表3可知，與空白組相比，模型組中小鼠的FBG和血清中TG、TC含量明顯升高，而HDL-C含量顯著降低(P<0.05)，表明小鼠的高脂血癥模型建立成功。與模型組相比，經(jīng)山楂黃酮高、中、低劑量處理后的小鼠，F(xiàn)BG和TC值均顯著降低(P<0.05)；山楂黃酮高劑量組血清內(nèi)TG含量顯著降低，而HDL-C含量則明顯上升(P<0.05)；山楂黃酮中劑量組血清內(nèi)TG含量也明顯降低(P<0.05)，但是HDL-C含量無(wú)顯著變化；山楂黃酮低劑量組血清內(nèi)TG和HDL-C含量無(wú)顯著變化。與鹽酸二甲雙胍組相比，經(jīng)山楂黃酮處理后小鼠血清中的TC含量顯著增高，HDL-C含量顯著減少(P<0.05)。

4 討論

本文探索了復(fù)合酶協(xié)同微波法提取山楂中總黃酮化合物的工藝條件，采用單因素實(shí)驗(yàn)考察了纖維素酶、果膠酶的添加量和酶解時(shí)間對(duì)黃酮提取量的影響。研究表明最佳的纖維素酶添加量為40 mg/g，果膠酶的添加量為50 mg/g，酶解時(shí)間120 min，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室前期篩選的提取條件，最終獲得最佳的提取工藝為：纖維素酶40 mg/g和果膠酶50 mg/g，pH 6，酶解溫度58 ℃，酶解時(shí)間為120 min，乙醇濃度為70%，液料比為40∶1 (mL/g)。在此條件下，山楂果肉中總黃酮的提取量高達(dá)117.5 mg/g，山楂皮中總黃酮的提取量為75.9 mg/g，而山楂籽中總黃酮的含量最低，為25.6 mg/g。同時(shí)，本文也探討了山楂黃酮對(duì)小鼠糖脂代謝的影響，結(jié)果表明，山楂黃酮高、中、低劑量均可有效降低高脂血癥模型小鼠的FBG、TG和TC含量(P<0.05)，還能不同程度地提高HDL-C水平(P<0.05)，由此證實(shí)山楂中黃酮類化合物有益于改善細(xì)胞的糖脂代謝過程。本文通過對(duì)山楂黃酮的提取工藝及其對(duì)糖脂代謝的影響，可為山楂黃酮類化合物在保健品的研發(fā)上提供一定的借鑒意義，同時(shí)也間接地促進(jìn)了山楂多元化產(chǎn)品的發(fā)展。