響應面分析優(yōu)化早酥梨醋發(fā)酵培養(yǎng)基

張霽紅，康三江，胡生海，李玉梅，張芳

(1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所，蘭州 730070；2.甘肅省果蔬貯藏加工技術創(chuàng)新中心，蘭州 730070)

梨是我國僅次于蘋果、柑橘的第三大水果，種植面積大、產(chǎn)量高、營養(yǎng)豐富，每100 g果肉含水分80.3 g、蛋白質(zhì)0.7 g、脂肪0.4 g、碳水化合物13.3 g、粗纖維4.4 g以及多種礦物質(zhì)元素和維生素[1-2]，可替代糧食加工果醋。果醋富含不揮發(fā)性有機酸、Vc等營養(yǎng)成分，具有開胃健脾、幫助消化、增強代謝和防治動脈硬化、高血壓等保健功能，是目前很有發(fā)展前途的新型水果加工品[3-4]。我國梨品種豐富，不同梨品種加工特性及加工品質(zhì)差異較大[5-7]，不同梨品種、梨果實不同部位發(fā)酵梨醋菌種、條件、工藝、抗氧化性能研究及復合梨醋發(fā)酵研究均有報道[8-15]。梨醋傳統(tǒng)發(fā)酵工藝是在梨汁中添加蔗糖、檸檬酸進行調(diào)糖和調(diào)酸，在適合的條件下添加菌種進行發(fā)酵，而發(fā)酵體系中氮源及無機鹽方面的研究較少。本實驗采用響應面法[16-18]研究碳源、氮源和無機鹽對早酥梨醋發(fā)酵總酸的影響，旨在提高梨醋的工業(yè)化生產(chǎn)應用。

1 材料與方法

1.1 材料

早酥梨：購于甘肅省景泰縣早酥梨產(chǎn)區(qū)；安琪果酒專用酵母：湖北安琪酵母股份有限公司；巴氏醋桿菌(Acetobacterpasteurianus)：中國微生物菌種保存中心；蔗糖、檸檬酸、氯化銨、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、無水乙醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉等(均為化學純)：天津市光復科技發(fā)展有限公司；酵母膏、瓊脂(生物試劑)：北京奧博星生物技術有限公司；果膠酶(酶活30000～50000 U/g)：寧夏和氏璧生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

BSA224S-CW電子天平 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；YXQ-LS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博訊實業(yè)有限公司；ZHJH-C1112B超凈工作臺、ZWY-2102恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱；TGL-16MC冷凍離心機 長沙維爾康湘鷹離心機有限公司；日本愛拓PAL-1數(shù)顯糖度計。

1.3 實驗方法

1.3.1 工藝流程

早酥梨清洗榨汁→酶解→殺菌→過濾→調(diào)整糖酸比→冷卻→酒精發(fā)酵→醋酸發(fā)酵→過濾澄清→滅菌→陳釀→產(chǎn)品。

1.3.2 主要操作步驟

1.3.2.1 酶解

早酥梨清洗榨汁后，加入0.03%酶活30000～50000 U/g的果膠酶，pH值4.0，溫度45 ℃，酶解2.5 h，75 ℃殺酶過濾。

1.3.2.2 酒精發(fā)酵

在糖酸比30～50的梨汁中加入總質(zhì)量8%已活化的安琪果酒酵母，25 ℃發(fā)酵5 d。

1.3.2.3 醋酸發(fā)酵

當發(fā)酵液中糖度不再下降，酒精發(fā)酵結(jié)束時，接種梨汁總質(zhì)量10%三級培養(yǎng)活化后的巴氏醋桿菌，32 ℃ 醋酸發(fā)酵6 d，殺菌、陳釀后得到梨醋。

1.3.3 分批補充碳源實驗研究

在酶解后的早酥梨汁中一次性補充總質(zhì)量6%的蔗糖，分別在發(fā)酵12，36 h時的發(fā)酵液中補充總質(zhì)量3%的蔗糖，分別在發(fā)酵12，24，36 h時的發(fā)酵液中補充總質(zhì)量2%的蔗糖，研究碳源對醋酸發(fā)酵中總酸含量的影響，每處理重復3次。

1.3.4 氮源濃度篩選

醋酸發(fā)酵初期在發(fā)酵液中分別添加0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的氯化銨，研究氯化銨添加量對醋酸發(fā)酵的影響，每處理重復3次。

1.3.5 無機鹽濃度篩選

醋酸發(fā)酵初期在發(fā)酵液中分別添加0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的硫酸鎂，0%、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%的磷酸二氫鉀，研究無機鹽對醋酸發(fā)酵的影響，每處理重復3次。

1.3.6 Box-Behnken中心組合實驗設計

根據(jù)Box-Behnken原理設計實驗，每個因子被設置為高、中、低3個水平(-1，0，1)，各因子變量選擇范圍見表1。

表1 響應面分析因素與水平Table 1 The factors and levels of response surface analysis

1.4 產(chǎn)品檢測

1.4.1 發(fā)酵液中可溶性固形物的測定

采用日本產(chǎn)PAL-1型折光儀測定可溶性固形物含量。

1.4.2 總酸含量的測定

采用氫氧化鈉酸堿滴定法測定總酸含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 分批補充碳源對醋酸發(fā)酵結(jié)果的影響

圖1 分批添加碳源對總酸含量的影響 Fig.1 Effect of adding carbon source in batches on total acid content

由圖1可知，在酶解后的早酥梨汁中分3次添加總量6%的蔗糖進行果醋發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)果顯示：與對照相比，添加蔗糖可提高碳源物質(zhì)含量，增加發(fā)酵液中的總酸含量。相同質(zhì)量的蔗糖分1，2，3次添加后發(fā)酵液中總酸含量有明顯差異，添加1次和添加2次差異不顯著，添加3次與其他兩次差異較顯著。這是因為果醋發(fā)酵過程中糖轉(zhuǎn)化為酒精，進一步生成乙酸，當糖濃度過高時，抑制酵母菌生長，影響糖的進一步轉(zhuǎn)化，如果適量添加可進一步激活酵母生長，提高轉(zhuǎn)化率。

2.2 不同氮源濃度對醋酸發(fā)酵結(jié)果的影響

在發(fā)酵液中分別添加0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的氯化銨后發(fā)酵液中總酸含量見圖2。

圖2 氯化銨添加量對總酸含量的影響Fig.2 Effect of ammonium chloride additive amount on total acid content

氮源主要參與氨基酸、蛋白質(zhì)和核酸等菌體細胞構(gòu)成及含氮物質(zhì)代謝，無機氮源氯化銨有利于微生物快速利用，在梨醋發(fā)酵體系中加入適量的氯化銨可提高醋酸總量。由圖2可知，當氯化銨添加量在0.1%～0.3%范圍內(nèi)可促進發(fā)酵體系中總酸量的積累，當氯化銨添加量大于0.4%時有抑制總酸產(chǎn)量的趨勢。

2.3 不同無機鹽濃度對醋酸發(fā)酵結(jié)果的影響

酒精發(fā)酵結(jié)束后在發(fā)酵液中分別添加0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的硫酸鎂后發(fā)酵液中總酸含量見圖3。

圖3 硫酸鎂添加量對總酸含量的影響Fig.3 Effect of magnesium sulfate additive amount on total acid content

酒精發(fā)酵結(jié)束后在發(fā)酵液中分別添加0%、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%的磷酸二氫鉀，研究微量元素鉀對醋酸發(fā)酵的影響(見圖4)，每處理重復3次。

圖4 磷酸二氫鉀添加量對總酸含量的影響

無機鹽作為輔酶或酶活性基團的組成部分，是微生物維持生命活動的必需物質(zhì)，K+能夠影響細胞的通透性，維持細胞的滲透壓，Mg2+是許多酶的催化劑，也是ATP的輔因子，能活化磷酸化酶和激酶參與發(fā)酵液中醋酸的合成。由圖3和圖4可知，當發(fā)酵液中加入0.1%～0.3%的硫酸鎂、0.02%～0.06%的磷酸二氫鉀時可促進發(fā)酵體系中總酸量的積累，當硫酸鎂、磷酸二氫鉀添加量增大時有抑制總酸產(chǎn)量的趨勢。

2.4 響應面實驗結(jié)果分析

利用Design-Expert 10軟件進行實驗設計及分析，相應設計及結(jié)果見表2，以總酸含量(g/L)為響應值，對數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到總酸與各因素的二次多項回歸方程為：總酸含量(g/L)=+59.25-1.31A+0.26B+0.97C+2.70AB+1.52AC-0.42BC-4.34A2-3.20B2-3.19C2。

表2 響應面實驗設計及結(jié)果Table 2 Response surface test design and results

表3 回歸模型方差分析結(jié)果

由表3方差分析結(jié)果可知，模型的P<0.01，說明該模型因子具有顯著性意義。失擬項的P>0.05，不顯著，回歸方程R2=0.9804，擬合度較好，表明實驗數(shù)據(jù)可以較好地反映各因素和總酸含量之間的關系。3個因素對梨醋總酸含量的影響大小依次為A氯化銨添加量(%)>C磷酸二氫鉀添加量(%)>B硫酸鎂添加量(%)。其中一次項A極顯著，C顯著，B不顯著；二次項A2、B2、C2極顯著，交互項AB、AC極顯著，BC不顯著，說明各因素對總酸含量的影響不呈線性關系。

2.5 響應面圖及等高線圖分析

根據(jù)回歸方程，利用Design Expert 10軟件繪制響應曲面圖及等高線，見圖5～圖7。分析各因素及其相互作用對總酸含量的影響，確定最佳因素水平范圍。從圖中可直觀地看出各因子對響應值的影響變化趨勢，而且回歸模型確實存在最大值。

圖5 氯化銨、硫酸鎂添加量對梨醋總酸含量影響的曲面圖與等高線 Fig.5 The response surface and contour of the effect of ammonium chloride and magnesium sulfate on the total acid content of pear vinegar

由圖5可知，總酸含量隨著氯化銨和硫酸鎂濃度的升高先增加后降低，當氯化銨濃度接近0.3%時，總酸含量趨于平穩(wěn)，響應面相對陡峭，當A、B定量時，等高線呈橢圓形，表明A、B的交互作用顯著。

由圖6可知，總酸含量隨著氯化銨和磷酸二氫鉀濃度的升高先增加后降低，當磷酸二氫鉀濃度大于0.05%～0.06%、氯化銨濃度大于0.25%～0.30%時，總酸含量下降，響應面相對陡峭，當A、C定量時，等高線呈橢圓，表明A、C的交互作用顯著。

圖7 硫酸鎂、磷酸二氫鉀添加量對梨醋總酸含量影響的曲面圖與等高線 Fig.7 The response surface and contour of the effect of magnesium sulfate and potassium dihydrogen phosphate on the total acid content of pear vinegar

由圖7可知，總酸含量隨著硫酸鎂和磷酸二氫鉀濃度的升高先增加后降低，增加幅度較大，降低較小，響應面相對平緩，當B、C定量時，等高線呈圓形，表明B、C的交互作用不顯著。

2.6 響應面模型驗證

利用設計軟件進行回歸模型預測，總酸含量取最大值時各因素的優(yōu)化水平為氯化銨添加量0.27%、硫酸鎂添加量0.23%、磷酸二氫鉀添加量0.05%，此時模型預測的總酸含量最大值為57.03 g/L。為了檢驗模型預測值的準確性，進行驗證實驗，在早酥梨酶解調(diào)糖調(diào)酸后，加入氯化銨0.27%、硫酸鎂0.23%、磷酸二氫鉀0.05%進行梨醋發(fā)酵，重復3次，測定總酸含量為56.72 g/L，與預測值接近，說明預測模型較好地反映了各因素與總酸之間的實際情況，優(yōu)選工藝合理可行。

3 結(jié)論

在早酥梨醋發(fā)酵工藝中分批添加蔗糖可提高碳源的轉(zhuǎn)化率，促進總酸含量的提高。 應用Box-Behnken中心組合實驗設計對氯化銨、硫酸鎂、磷酸二氫鉀添加量對總酸含量的關系進行研究，通過Design Expert軟件對實驗結(jié)果進行分析，得到早酥梨醋優(yōu)化發(fā)酵條件為氯化銨添加量0.27%、硫酸鎂添加量0.23%、磷酸二氫鉀添加量0.05%，總酸含量為57.03 g/L，較傳統(tǒng)未添加果汁發(fā)酵總酸含量48.76 g/L提高了16.3%，表現(xiàn)出了良好的優(yōu)化效果。