基于嬰幼兒奶嘴安全性的12種N-亞硝基胺及其遷移量測(cè)定方法研究
——HPLC-MS/MS法

周雷，章宦勝，黃小凱

（國(guó)家鞋類(lèi)質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心(溫州)，溫州方圓檢驗(yàn)認(rèn)證有限公司，浙江 溫州 325007）

前言

奶嘴是使用在奶瓶上幫助吸奶的一種工具，在原料上一般可以分為橡膠奶嘴，硅膠奶嘴等。奶嘴和安撫奶嘴以嬰幼兒為主要消費(fèi)群體，其質(zhì)量高低會(huì)影響嬰幼兒的身體健康。

N-亞硝基胺是一類(lèi)具有-N-N=O 結(jié)構(gòu)的有機(jī)化合物，期中90%左右的N-亞硝基胺可以誘發(fā)多種類(lèi)動(dòng)物不同器官的腫瘤，并且一次大量攝取和少量多次攝取均可誘發(fā)腫瘤[1]。1980 年，Preussmann 發(fā)現(xiàn)嬰兒奶嘴、橡膠奶嘴含有揮發(fā)性的N-亞硝基胺，可遷移到唾液中。1982 年，Havery 和Fazio 發(fā)現(xiàn)使用傳統(tǒng)消毒器對(duì)嬰兒奶嘴和牛奶或嬰兒藥方消毒時(shí)，牛奶和藥液中被混入N-亞硝基胺。美國(guó)環(huán)境保護(hù)署（Environment Protection Agency,EPA）污染物風(fēng)險(xiǎn)信息集成系統(tǒng)（Integrated Risk Information System,IRIS）將N-亞硝基胺的風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)定為B2，即具有潛在人體致癌性[2]。

為有效消除橡膠制品嬰兒奶嘴中可能存在的N-亞硝基胺對(duì)嬰幼兒健康帶來(lái)的危害，各國(guó)都出臺(tái)了相應(yīng)的政策及標(biāo)準(zhǔn)。1993 年，歐盟官方發(fā)布了93/11/EEC 指令，規(guī)定彈性體或橡膠奶嘴和安撫奶嘴中總N-亞硝基胺的遷移量不得高于0.01 mg/kg，總可亞硝化物質(zhì)的遷移量不得高于0.1 mg/kg[3]。2015 年我國(guó)最新發(fā)布的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)奶嘴》（GB 4806.2-2015）規(guī)定奶嘴中每種N-亞硝基胺不得超過(guò)0.01 mg/kg，每種N-亞硝基胺可生成物不得高于0.1 mg/kg[4]。

很長(zhǎng)一段時(shí)間，對(duì)于痕量揮發(fā)性N-亞硝基胺的測(cè)定是一項(xiàng)困難而又耗時(shí)的工作。早期的檢測(cè)手段有薄層層析法、紫外光譜鑒定法等。1975 年Fine 等人首先發(fā)明了對(duì)亞硝基結(jié)構(gòu)具有檢測(cè)特異性的熱能分析儀[5]（TEA），從而成為檢測(cè)N-亞硝基胺的專(zhuān)屬儀器。

隨著儀器的發(fā)展，質(zhì)譜儀逐漸成為除熱能分析儀之外使用最為廣泛的檢測(cè)儀器，越來(lái)越多的質(zhì)譜儀（MS）用于N-亞硝基胺的檢測(cè)。幸苑娜[6]先后采用氣相色譜-正化學(xué)源質(zhì)譜法和氣相色譜-電子轟擊源串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)了橡膠制品中7 種N-亞硝基胺，檢出限達(dá)到1.25 μg/kg，遠(yuǎn)低于93/11/EEC 的限量要求。目前，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS），液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）已成為應(yīng)用最多的檢測(cè)手段。

GC-MS 用于檢測(cè)基質(zhì)相對(duì)簡(jiǎn)單的揮發(fā)性N-亞硝基胺非常方便，但是該法前處理復(fù)雜，需將遷移液用有機(jī)溶劑萃取，而N-亞硝基胺性質(zhì)不穩(wěn)定，用有機(jī)溶劑進(jìn)行洗脫及濃縮時(shí)易造成損失。同時(shí)對(duì)于一些難揮發(fā)、熱不穩(wěn)定的N-亞硝基胺，以及基質(zhì)比較復(fù)雜的樣品，該法容易出現(xiàn)假陽(yáng)性，無(wú)法做到準(zhǔn)確定性定量[7]。

LC-MS/MS 法是以質(zhì)譜儀為檢測(cè)手段，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，根據(jù)目標(biāo)化合物的母離子及子離子信息，能夠?qū)δ繕?biāo)化合物進(jìn)行準(zhǔn)確的定性定量，實(shí)現(xiàn)對(duì)奶嘴中低濃度的N-亞硝基胺進(jìn)行檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器設(shè)備和試劑

Agilent1260（G1312B/G6495A）液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀；電熱恒溫水浴鍋（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；純水機(jī)，ZR0Q00800（MILLIPORE）；電子天平，賽多利斯BSA224S；pH計(jì)，賽多利斯PB-10。

12 種N-亞硝胺混標(biāo)，200 mg/L，1mL，購(gòu)自BePure 公司。使用時(shí)用甲醇配制合適濃度的工作曲線。

甲醇為液相色譜級(jí)/光譜級(jí)（壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司）；甲酸，98%，為L(zhǎng)C-MS 級(jí)（北京百靈威科技有限公司）。有機(jī)相針式濾器（13 mm，0.22 μm；上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；娃哈哈純凈水（娃哈哈集團(tuán)有限公司）。

人工唾液：將4.2 g 碳酸氫鈉，0.5 g 氯化鈉，0.2 g 碳酸鉀和30 mg 亞硝酸鈉溶于水中并稀釋至900 mL。調(diào)節(jié)pH 至9.0，必要時(shí)滴加鹽酸溶液或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)。轉(zhuǎn)移至1L 容量瓶中，加水定容至刻度。

1.2 樣品預(yù)處理方法

稱(chēng)取40 g 取自安撫奶嘴的奶嘴頭，放入裝有沸水的燒杯保持沸騰10 min，用鑷子將奶頭取出。冷卻至室溫，將每個(gè)奶嘴頭縱向剖成兩半，晾干。將樣品剪碎至5 mm×5 mm，稱(chēng)取5 g 左右的樣品，于適當(dāng)容器中加入10 倍樣品量預(yù)熱至（40±2）℃的模擬唾液，確保樣品完全浸沒(méi)，置于（40±2）℃水浴中浸泡（60±3）min。將測(cè)試液過(guò)0.22 μm 微孔濾膜后，即可用于N-亞硝胺檢測(cè)。

1.3 儀器條件

色譜柱：Eclipse Plus C18（3.0 mm×50 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相A：甲醇；流動(dòng)相B：0.1%甲酸水溶液；梯度洗脫程序：0.0～4.2 min，甲醇從30%線性增加到85%；4.2～6.0 min，甲醇從85%線性降低至30%；流速0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量5.0 μL。電離方式：ESI+；毛細(xì)管電壓：4000 V；干燥氣溫度：250 ℃；干燥氣流速：14 L/min；鞘氣溫度：350 ℃；霧化器壓力：30 psi；噴嘴電壓：500 V；監(jiān)測(cè)模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；MRM 參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 12 種N-亞硝胺的MRM參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相的選擇

在液質(zhì)分析中，往流動(dòng)相中加入緩沖鹽，有助于提高目標(biāo)化合物的離子化效率，流動(dòng)相的組成對(duì)目標(biāo)化合物的峰型及靈敏度有很大的影響。本方法采用甲醇-甲酸水溶液為流動(dòng)相，相較于甲醇-乙酸銨水溶液、乙腈-甲酸水溶液、乙腈-乙酸銨水溶液，甲醇-甲酸水溶液使得N-亞硝基胺具有較好的峰型和靈敏度。

2.2 質(zhì)譜條件的選擇

12 種N-亞硝胺類(lèi)化合物在MRM 模式下均能得到良好的響應(yīng)，在確定目標(biāo)化合物的母離子和子離子后，將12 種N-亞硝胺混標(biāo)稀釋成1 μg/L 的工作液，在MRM 模式下，通過(guò)優(yōu)化其他質(zhì)譜參數(shù)，最終選擇響應(yīng)值最大、豐度最強(qiáng)、干擾最小的離子對(duì)。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

在優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件下，將12 種N-亞硝胺物質(zhì)分別配置成一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液：1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 ng/mL，進(jìn)行檢測(cè)，以信噪比S/N=3 計(jì)算檢出限，其線性方程和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2。12 種亞硝胺在1.0～20.0 ng/mL 之間線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r2均不低于0.995。檢出限為1 ng/mL。

表2 12 種亞硝胺線性方程及線性范圍

2.4 回收率及精密度

按照1.2 方法對(duì)未檢出亞硝胺的空白樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，添加水平分別為2.0、5.0、10.0 ng/mL，每個(gè)添加水平做7 次獨(dú)立平行試驗(yàn)。試驗(yàn)所得回收率和精密度結(jié)果列于表3。12 種亞硝胺的回收率為90.0%～108.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.62%～4.02%。

表3 12 種亞硝胺的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=7）

2.5 實(shí)際樣品的的測(cè)定

應(yīng)用本方法對(duì)市場(chǎng)銷(xiāo)售的奶嘴隨機(jī)抽取20 份進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，所有嬰幼兒奶嘴中均未檢出亞硝胺物質(zhì)。

3 結(jié)論

LC-MS/MS 法集高效液相色譜的高速、高分離能力與質(zhì)譜高靈敏性和高選擇性于一體；采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，根據(jù)目標(biāo)化合物的母離子及子離子信息，能夠?qū)δ繕?biāo)化合物進(jìn)行準(zhǔn)確的定性定量，實(shí)現(xiàn)對(duì)奶嘴中低濃度的N-亞硝基胺進(jìn)行檢測(cè)。該法前處理簡(jiǎn)單，并且檢測(cè)快速、高效，檢出限低，抗干擾能力強(qiáng)，定性、定量準(zhǔn)確，是一種能夠快速的定性、定量檢測(cè)奶嘴中N-亞硝基胺的分析方法。