2株林麝肺源銅綠假單胞菌毒力及致病性比較

鄧 英,李 強(qiáng),嚴(yán)立恒,張白玉,楊 胡,付 萍,孫珊珊,顏其貴

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130)

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)也稱綠膿桿菌，是一種重要且常見的條件性人獸共患致病菌。該菌是醫(yī)院內(nèi)獲得性感染的三大主要病原菌之一，如囊性纖維化肺(CF)[1]、艾滋病HIV[2]及燒傷[3]等患者都是感染的高危人群。感染一旦形成生物膜，更是難以根除[4]。該菌一般不會(huì)引起健康機(jī)體發(fā)病，而是在人體防御能力受損時(shí)乘虛而入。此外，銅綠假單胞菌是林麝化膿性肺炎的主要病原體之一[5]。

林麝是我國(guó)一級(jí)保護(hù)動(dòng)物，主要分布在陜西省和四川省。由于過度狩獵、棲息地破壞以及缺乏科學(xué)管理等原因，導(dǎo)致林麝的種群數(shù)量呈下降趨勢(shì)。從1950年前后開始人工繁殖林麝，由于化膿性疾病導(dǎo)致林麝的大規(guī)模繁育出現(xiàn)困難[6]。目前，該病的治療仍采用傳統(tǒng)抗生素。但是大量使用抗生素會(huì)促進(jìn)銅綠假單胞菌的耐藥性增強(qiáng)，導(dǎo)致其治療難度增加。銅綠假單胞菌產(chǎn)生的毒力因子主要包括胞外蛋白酶(降解宿主分泌的介質(zhì)，逃避宿主的防御機(jī)制[7-8])、胞外多糖(抵抗宿主細(xì)胞的吞噬作用和氧化應(yīng)激，加強(qiáng)該菌對(duì)宿主細(xì)胞表面的黏附[9])、內(nèi)毒素(脂質(zhì)A結(jié)合TLR4-MD2，賦予對(duì)補(bǔ)體殺傷和陽(yáng)離子抗微生物肽的抗性[10])、膿青素(促進(jìn)鐵的螯合作用[11])、外毒素A(導(dǎo)致宿主蛋白質(zhì)生物合成失活[12])和綠膿菌素(pyocyanin，PYO)等。PYO是銅綠假單胞菌分泌的次級(jí)代謝物吩嗪之一，也是該菌特有的毒力因子。PYO不僅能促進(jìn)生物膜的形成，也能誘導(dǎo)氧化應(yīng)激引起宿主細(xì)胞損傷[13]。90%～95%的銅綠假單胞菌分離株都能分泌綠膿菌素[14]。本實(shí)驗(yàn)室從因化膿性肺炎死亡的林麝肺中分離出2株銅綠假單胞菌，其中1株不分泌綠膿菌素命名為ZP-1株；1株分泌綠膿菌素命名為BX-1株。為了更好地研究這2株表型差異的銅綠假單胞菌導(dǎo)致林麝化膿性肺炎的差異性，本研究比較其在體外的毒力因子表達(dá)，并且建立了接近于臨床的小鼠急性、慢性肺部感染模型，旨在為林麝化膿性肺炎的治療與防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 銅綠假單胞菌林麝源分離株BX-1株(分泌綠膿菌素)和ZP-1株(不分泌綠膿菌素)，均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院微生物與免疫實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 120只CD-1小鼠，6周齡，雌性，體質(zhì)量25 g/只，購(gòu)于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.1.3 主要試劑 彈性蛋白-剛果紅(elastin-Congo red，ECR)、偶氮酪蛋白、礦物油，購(gòu)于Sigma-Aldrich公司；小鼠白細(xì)胞介素6(IL-6)、白細(xì)胞介素1(IL-1β)酶聯(lián)免疫分析試劑盒，購(gòu)于江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司；Mouse IFN-gamma ELISA Kit，購(gòu)于杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；紅細(xì)胞裂解液，購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；96孔板，購(gòu)于康寧公司；高碘酸、檸檬酸、硝酸銀，購(gòu)于成都市科隆化學(xué)品有限公司；瓊脂糖，購(gòu)于生工生物工程股份有限公司；10%多聚甲醛固定液，購(gòu)于武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.1.4 儀器設(shè)備 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE52CS-1)，購(gòu)于上海亞榮生化儀器廠；磁力攪拌器(SH-3)，購(gòu)于北京市光明醫(yī)療器械有限公司；倒置顯微鏡(TS100)，購(gòu)于Nikon；低溫組織研磨儀(KZ-Ⅲ-F)，購(gòu)于武漢賽維爾生物科技有限公司；自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(RWD-C100)，購(gòu)于瑞沃德公司；多功能酶標(biāo)儀(VARIOSKAN LUX)，購(gòu)于Thermo。

1.2 ZP-1和BX-1株的毒力表達(dá)測(cè)定

1.2.1 上清液制備 將ZP-1和BX-1單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，置于37 ℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，測(cè)定24 h培養(yǎng)物的OD600，并用培養(yǎng)基將其OD600調(diào)成一致。將菌液在4 ℃、12 000 r/min離心20 min，取上清液并用0.22 μm無(wú)菌過濾器過濾，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 毒力因子檢測(cè) 胞外蛋白酶LasA和LasB：參考Das等[15]的方法，測(cè)定ZP-1株和BX-1株上清液中的LasA和LasB活性。

胞外多糖EPS：將1 mL上清液與2.2倍體積的冷凍無(wú)水乙醇混合，-20 ℃下孵育1 h后，于4 ℃下3 500 r/min離心20 min。將含有EPS的沉淀溶解在無(wú)菌水中，采用苯酚-硫酸法[16]測(cè)定胞外多糖EPS含量。

鼠李糖脂：參考Rasamiravaka等[17]的方法，測(cè)定ZP-1株和BX-1株上清液中的鼠李糖脂含量。

膿青素：參考Adonizio等[18]的方法，測(cè)定ZP-1株和BX-1株上清液中的膿青素含量。

脂多糖LPS：參考Hitchcock等[19]的方法，提取ZP-1株和BX-1株的脂多糖LPS，并采用Tsai[20]的方法對(duì)LPS提取物染色。

1.3 ZP-1和BX-1株對(duì)小鼠致病性比較

1.3.1 小鼠急性肺部感染模型的建立 (1)菌懸液的制備。采用LB液體培養(yǎng)基，將ZP-1株和BX-1株置于37 ℃恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)過夜，再按照1∶100的體積比重新接種于新鮮LB液體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；菌液以3 000g離心10 min，收集菌體后用無(wú)菌的體積分?jǐn)?shù)0.9% NaCl溶液洗滌3次；最后使用分光光度計(jì)調(diào)整菌液濃度為4×104CFU/μL。

(2)氣管插管滴注。小鼠腹腔注射250 μL體積分?jǐn)?shù)0.75%戊巴比妥鈉溶液麻醉后，利用無(wú)創(chuàng)式氣管插管的方法，將22 G留置針插入氣管，向試驗(yàn)組(ZP-1組和BX-1組)小鼠滴入制備好的菌懸液，對(duì)照組小鼠滴入無(wú)菌PBS。滴注完成后，轉(zhuǎn)動(dòng)小鼠身體1 min左右，使菌液在肺部均勻分布。最后將小鼠置于溫暖干凈的鼠籠內(nèi)，恢復(fù)清醒。試驗(yàn)組(ZP-1組、BX-1組)以及對(duì)照組各接種10只小鼠。該試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.3.2 小鼠慢性肺部感染模型的建立 (1)慢性感染包埋株的制備。采用胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)，將ZP-1株和BX-1株置于37 ℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)過夜，按照1∶10的體積比重新接種于新鮮的10 mL TSB中培養(yǎng)至OD600為0.8～1.2時(shí)，2 700 r/min離心15 min，收集細(xì)菌菌體；用1 mL PBS重懸菌體，并充分混勻后加入9 mL未凝固的胰酪胨大豆瓊脂糖培養(yǎng)基振蕩混勻，緩慢倒入含有150 mL礦物油的錐形瓶中，500 r/min旋轉(zhuǎn)錐形瓶6 min；將錐形瓶置于冰水浴中繼續(xù)轉(zhuǎn)動(dòng)35 min后靜置20 min；將靜置后的上層液體倒入50 mL離心管中，于4 ℃、2 700 r/min離心5 min；移去上油層，用無(wú)菌PBS清洗，于4 ℃、2 700 r/min離心5 min，反復(fù)清洗、離心直至管內(nèi)的瓊脂球呈肉眼可見的憑自重下落，最后加20～30 mL無(wú)菌PBS重懸。吸取少量重懸液于孔板內(nèi)，通過倒置光學(xué)顯微鏡觀察其形態(tài)與大小。取500 μL制備好的試驗(yàn)組(ZP-1和BX-1)包埋株進(jìn)行無(wú)菌勻漿，用無(wú)菌PBS進(jìn)行10倍梯度稀釋后涂板，調(diào)整試驗(yàn)組包埋株濃度為4×104CFU/μL，對(duì)照組包埋株做無(wú)菌檢驗(yàn)。

(2)模型建立。按1.3.1節(jié)(2)的方法，將瓊脂糖包埋株遞入小鼠肺中。試驗(yàn)組(ZP-1組、BX-1組)以及對(duì)照組各接種20只小鼠。該試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.3.3 肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)的制備 腹腔注射過量的戊巴比妥鈉溶液對(duì)小鼠實(shí)施安樂死。待小鼠死亡后，固定小鼠，用1 mL一次性注射器抽取0.8 mL預(yù)冷的生理鹽水，通過連接留置針軟管注入小鼠氣管內(nèi)，反復(fù)抽吸3次，抽出液體放入無(wú)菌離心管中，回收率應(yīng)大于80%。將所得BALF均勻混合后，于4 ℃、1 000 r/min離心10 min，取上清液-80 ℃保存?zhèn)溆?；沉淀用于后續(xù)的白細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.3.4 肺組織銅綠假單胞菌殘留數(shù)評(píng)估 小鼠肺泡灌洗完成后，取100 μL BALF涂板。然后取小鼠肺臟放入組織研磨管，使用低溫研磨機(jī)充分研磨，研磨液于4 ℃、1 500 r/min離心10 min，取上清進(jìn)行10倍稀釋涂板。小鼠肺臟的總細(xì)菌負(fù)荷量由BALF總細(xì)菌數(shù)和組織總細(xì)菌殘留數(shù)組成。

1.3.5 白細(xì)胞計(jì)數(shù) 用500 μL體積分?jǐn)?shù)0.9% NaCl溶液重懸BALF離心后的沉淀，并取10 μL充分混勻后的重懸液用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)。若離心后有紅色沉淀，采用紅細(xì)胞裂解液將紅細(xì)胞完全裂解后再進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.3.6 細(xì)胞因子含量檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)的方法[21]，測(cè)定BALF中的細(xì)胞因子干擾素-γ(interferon-gamma，IFN-γ)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)和白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)含量。

1.3.7 病理組織學(xué)觀察 取安樂死14 d后的試驗(yàn)組(ZP-1組和BX-1組)以及對(duì)照組小鼠肺組織，放入體積分?jǐn)?shù)10%多聚甲醛固定液中固定。待組織固定完全后，經(jīng)過脫水、石蠟包埋、漂片、攤片和烘片后進(jìn)行蘇木精-伊紅H&E染色、鏡檢。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0軟件以及GraphPad Prism 7.00軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)并作圖，采用單因素方差分析或t檢驗(yàn)進(jìn)行不同組間比較分析。檢驗(yàn)水平α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 銅綠假單胞菌ZP-1和BX-1株的毒力因子檢測(cè)

由表1可知，BX-1株的胞外蛋白酶LasA和LasB活性略高于ZP-1株，但二者差異不顯著(P>0.05)；ZP-1株的胞外多糖EPS含量顯著高于BX-1株，而鼠李糖脂含量卻顯著低于BX-1株(P<0.05)；ZP-1株的膿青素含量顯著高于BX-1株(P<0.05)。

表1 銅綠假單胞菌ZP-1和BX-1株體外毒力因子表達(dá)量的比較Table 1 Comparison of in vitro virulence expression of ZP-1 and BX-1 of Pseudomonas aeruginosa

由圖1可見，ZP-1和BX-1株的LPS均具有O-抗原，屬于平滑性LPS，這與其在固體培養(yǎng)基上的菌落特征相符；但其在核心多糖處的結(jié)構(gòu)具有明顯差異。

圖1 銅綠假單胞菌ZP-1和BX-1株脂多糖結(jié)構(gòu)對(duì)比Fig.1 Comparison of lipopolysaccharide structure of ZP-1 and BX-1 of Pseudomonas aeruginosa

2.2 急性和慢性感染ZP-1和BX-1株小鼠致病性的比較

2.2.1 小鼠肺組織銅綠假單胞菌殘留數(shù) 急性肺部感染時(shí)，ZP-1組小鼠肺組織銅綠假單胞菌殘留數(shù)略高于BX-1組，但二者差異不顯著(P>0.05)；隨著感染時(shí)間延長(zhǎng)，兩組小鼠肺組織銅綠假單胞菌殘留數(shù)均降低；對(duì)照組未檢出銅綠假單胞菌(圖2-A)。慢性肺部感染時(shí)，隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，ZP-1和BX-1組小鼠肺組織銅綠假單胞菌殘留數(shù)均呈先降低后升高的趨勢(shì)；在感染的第3天，ZP-1和BX-1組的銅綠假單胞菌殘留數(shù)差異顯著(P<0.05)；對(duì)照組未檢測(cè)出銅綠假單胞菌(圖2-B)。綜上所述，隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，無(wú)論是急性肺部感染還是慢性肺部感染，小鼠肺組織銅綠假單胞菌殘留數(shù)均逐漸減少。

A.急性感染；B.慢性感染A.Acute infection；B.Chronic infection圖柱上標(biāo)不同小寫字母表示同一時(shí)間不同組間差異顯著(P<0.05)。下同Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05). The same below圖2 小鼠急性和慢性肺臟感染模型中的銅綠假單胞菌殘留數(shù)Fig.2 Residual number of Pseudomonas aeruginosa in acute and chronic lung infection models in mice

2.2.2 小鼠BALF中的白細(xì)胞總數(shù) 急性肺部感染時(shí)，ZP-1組小鼠肺泡灌洗液(BALF)中白細(xì)胞總數(shù)高于BX-1組，但二者差異不顯著(P>0.05)；隨感染時(shí)間延長(zhǎng)，ZP-1和BX-1組小鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)均有增加；與對(duì)照組相比，ZP-1和BX-1組小鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)均顯著增高(圖3-A)。慢性肺部感染時(shí)，BX-1和ZP-1組小鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)的變化趨勢(shì)相似，均呈先降低再趨于穩(wěn)定的變化趨勢(shì)；除感染第3天外，其余感染時(shí)間段ZP-1組小鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)顯著高于BX-1組和對(duì)照組；對(duì)照組小鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)除在接種的第1天略有升高外，其他感染階段無(wú)明顯異常；與對(duì)照組相比，ZP-1和BX-1組小鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)均顯著增高(圖3-B)。綜上所述，隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，小鼠急性感染時(shí)BALF中白細(xì)胞總數(shù)呈上升趨勢(shì)，而慢性感染時(shí)則相反。白細(xì)胞的明顯增高表明接種感染性包埋株后，引起了小鼠肺部持續(xù)性炎癥的發(fā)生。

A.急性感染；B.慢性感染A.Acute infection；B.Chronic infection

2.2.3 小鼠BALF中的細(xì)胞因子含量 利用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試驗(yàn)組(ZP-1組和BX-1組)和對(duì)照組小鼠肺泡灌洗液(BALF)中免疫炎性因子IL-1β、IL-6和IFN-γ含量的變化，結(jié)果見圖4～6。 由圖4可知，急性感染階段，隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，試驗(yàn)組小鼠BALF中IL-1β含量呈下降趨勢(shì)。感染12 h時(shí)，ZP-1組小鼠BALF中IL-1β含量高于BX-1組；感染24 h時(shí),ZP-1組小鼠BALF中IL-1β含量略低于BX-1組，但二者差異均不顯著(P>0.05)；與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組小鼠BALF中IL-1β含量顯著升高。慢性感染階段，隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，試驗(yàn)組小鼠BALF中IL-1β含量呈逐漸升高的趨勢(shì)，對(duì)照組小鼠BALF中IL-1β含量呈下降趨勢(shì)。除感染后第14天外，其余感染時(shí)間ZP-1組小鼠BALF中IL-1β含量均高于BX-1組；試驗(yàn)組小鼠BALF中IL-1β含量顯著高于對(duì)照組(除感染第3天外)。

A.急性感染；B.慢性感染A.Acute infection；B.Chronic infection

由圖5可知，急性感染階段，隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，試驗(yàn)組小鼠BALF中IL-6含量略有降低。感染12 h時(shí)，ZP-1組小鼠BALF中IL-6含量顯著高于BX-1組；感染24 h時(shí)，ZP-1組小鼠BALF中IL-6含量顯著低于BX-1組(P<0.05)；與對(duì)照組相比，感染的各個(gè)時(shí)期試驗(yàn)組小鼠BALF中IL-6含量均顯著升高(P<0.05)。慢性感染階段，隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，試驗(yàn)組小鼠BALF中IL-6含量逐漸升高，對(duì)照組小鼠BALF中IL-6含量逐漸降低；除感染第14天外，ZP-1組小鼠BALF中IL-6含量均高于BX-1組；與對(duì)照比相比，感染各個(gè)時(shí)期試驗(yàn)組小鼠BALF中IL-1β含量均顯著升高。

A.急性感染；B.慢性感染A.Acute infection；B.Chronic infection

由圖6可知，急性感染階段，隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，小鼠BALF中IFN-γ含量逐漸降低；感染12和24 h，ZP-1組小鼠BALF中IFN-γ含量均高于BX-1組，其中感染12 h時(shí)二者差異不顯著，感染24 h時(shí)二者差異顯著(P<0.05)；與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組小鼠BALF中IFN-γ含量均顯著升高。慢性感染階段，隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，試驗(yàn)組小鼠BALF中IFN-γ含量逐漸降低，對(duì)照組小鼠BALF中IFN-γ含量無(wú)明顯異常；同一感染時(shí)期ZP-1組和BX-1組小鼠BALF中IFN-γ含量差異不顯著(P>0.05)，但二者均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

2.2.4 小鼠肺臟組織病理學(xué)觀察 從小鼠急性感染后24 h的肺組織病理切片結(jié)果(圖7)可以看出，ZP-1組和BX-1組均有明顯的宿主損傷以及炎癥浸潤(rùn)；大面積肺泡壁增厚，肺泡腔狹窄，可見大量粒細(xì)胞、紅細(xì)胞散分布；支氣管上皮細(xì)胞形態(tài)正常，少量支氣管內(nèi)可見粒細(xì)胞浸潤(rùn)；肺泡腔內(nèi)及支氣管內(nèi)廣泛可見粒細(xì)胞散在分布；對(duì)照組無(wú)明顯異常。

A.對(duì)照組；B.ZP-1組；C.BX-1組A.Control group；B.ZP-1 group；C.BX-1 group圖7 小鼠急性肺部感染的組織切片(感染24 h)(HE×200)Fig.7 Tissue section of acute lung infection in mice(24 hours after infection)(HE×200)

從小鼠慢性感染第14天的肺組織病理切片結(jié)果(圖8)可以看出，與對(duì)照組相比，ZP-1組和BX-1組小鼠的肺組織雖然仍有肺泡結(jié)構(gòu)，但肺泡間隔明顯增厚，且具有明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

A.對(duì)照組；B.ZP-1組；C.BX-1組A.Control group；B.ZP-1 group；C.BX-1 group

3 討 論

銅綠假單胞菌是一種革蘭氏陰性機(jī)會(huì)病原體，具有強(qiáng)大的基因組和環(huán)境適應(yīng)能力。綠膿菌素是銅綠假單胞菌的重要毒力因子，不僅能促進(jìn)生物膜的形成，還具有誘導(dǎo)多藥外排泵的表達(dá)等作用。研究顯示，不同銅綠假單胞菌分離株的綠膿菌素分泌水平差異很大，可能是由于適應(yīng)宿主導(dǎo)致毒力表達(dá)降低[22-23]。比較野生型和綠膿菌素缺陷的銅綠假單胞菌菌株發(fā)現(xiàn)，綠膿菌素缺陷型銅綠假單胞菌導(dǎo)致更高的死亡率，并且在大鼠的肺氣道中誘導(dǎo)更廣泛的肺泡壁增厚[24]。但目前針對(duì)綠膿菌素分泌缺陷的大部分研究都是選擇性缺失掉phzM基因后得到的結(jié)果[25]，只有較少文獻(xiàn)研究綠膿菌素缺陷的野生型。選擇性缺失導(dǎo)致的表型消失是人為介導(dǎo)的改變，而野生株的出現(xiàn)是在與宿主動(dòng)態(tài)相互作用中逐漸形成的，所以對(duì)野生株的深入研究具有一定臨床意義。

細(xì)菌的致病性與其毒力密切相關(guān)。本研究體外毒力檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，ZP-1株分泌LasA和LasB的能力略低于BX-1株，但二者差異不顯著，表明在感染階段ZP-1株和BX-1株對(duì)宿主分泌的細(xì)胞介質(zhì)的降解能力差異不大。鼠李糖脂在銅綠假單胞菌侵襲宿主時(shí)具有抵抗先天性免疫的作用。本研究中ZP-1株的鼠李糖脂分泌量低于BX-1株，該結(jié)果與預(yù)期相符，這是由于綠膿菌素會(huì)間接促進(jìn)鼠李糖脂的合成；ZP-1株可產(chǎn)生大量的膿青素，膿青素不僅是銅綠假單胞菌重要的鐵載體，同時(shí)也能上調(diào)外毒素A表達(dá)的信號(hào)通路[26]；ZP-1株和BX-1株的LPS在核心多糖處的結(jié)構(gòu)有明顯差異，致病性可能有所不同，需要進(jìn)一步試驗(yàn)證實(shí)。

本研究中，選擇小鼠為建模動(dòng)物，采用無(wú)創(chuàng)式氣管插管以及制備瓊脂糖包埋株的方法，建立小鼠肺部感染模型。急性肺部感染通常會(huì)引起壓倒性的宿主損傷；而在慢性肺部感染期間，銅綠假單胞菌會(huì)調(diào)整自身的侵襲力和毒力以達(dá)到適應(yīng)宿主環(huán)境，與宿主長(zhǎng)期共存。目前常見的慢性包埋株載體主要有瓊脂糖和海藻酸鹽等。本試驗(yàn)選擇瓊脂糖作為包裹載體，因其能夠提供一種微厭氧環(huán)境，并具有從單細(xì)胞發(fā)展到微菌落的細(xì)菌繁殖所需的基本養(yǎng)分。在肺部感染階段，宿主會(huì)啟動(dòng)炎癥反應(yīng)來抵抗入侵的病原體。由微生物感染引起的主要促炎性細(xì)胞因子包括IL-1β和IL-6等，其能協(xié)調(diào)白細(xì)胞募集至感染位點(diǎn)[27]。隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，肺部炎癥也會(huì)持續(xù)發(fā)生，其中BALF中的白細(xì)胞水平反應(yīng)了肺部炎癥的感染免疫應(yīng)答水平[28]。本研究所建立的小鼠肺部急性、慢性感染模型中，ZP-1組小鼠引起宿主的炎癥水平均高于BX-1組；在急性感染過程中，ZP-1和 BX-1株在感染12 h后雖然小鼠機(jī)體逐漸清除了細(xì)菌，但是炎癥仍在發(fā)生；在慢性感染過程中，ZP-1和 BX-1組小鼠BALF中IL-1β和IL-6含量呈逐漸升高的趨勢(shì)，而IFN-γ含量則是逐漸降低，說明所建立的小鼠感染模型是成立的。

綜上所述，銅綠假單胞菌ZP-1株和BX-1株的毒力因子分泌側(cè)重不一樣，ZP-1株引起肺部感染小鼠的致病性較BX-1株更強(qiáng)。