結(jié)直腸癌患者血液外泌體差異表達(dá)非編碼RNA的篩選及生物信息學(xué)分析

池宏波 楊英梅

結(jié)直腸癌是全球第三大常見的惡性腫瘤，是癌癥相關(guān)性死亡的第二大主要原因，嚴(yán)重威脅人類的生命健康[1-2]。由于缺乏有效的早期診斷標(biāo)志物，大多數(shù)患者在診斷時(shí)已處于中晚期，臨床預(yù)后差[3]。因此，迫切需要了解結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制，尋找新的早期診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。外泌體作為穩(wěn)定的介導(dǎo)細(xì)胞間物質(zhì)交換及細(xì)胞通訊的重要媒介，在癌癥中的作用越來越被關(guān)注[4]。研究表明，腫瘤來源的外泌體在腫瘤細(xì)胞間發(fā)揮信息傳導(dǎo)的作用，可通過轉(zhuǎn)運(yùn)和交換其包裹的眾多異常表達(dá)的生物活性物質(zhì)，如長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,lncRNA）、環(huán)狀 RNA（circular RNA,circRNA）、微小 RNA（micro RNA,miRNA）、信使 RNA（messenger RNA,mRNA）、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等，影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能，從而促進(jìn)包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[5-7]。本研究擬通過生物信息學(xué)方法對結(jié)直腸癌患者和正常對照者血液外泌體中的差異表達(dá)非編碼RNAs（non-coding RNAs,ncRNAs）和mRNAs進(jìn)行篩選，構(gòu)建差異表達(dá)基因的競爭性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）網(wǎng)絡(luò)，并對差異表達(dá)mRNAs進(jìn)行生物學(xué)功能和癌相關(guān)信號(hào)通路分析，探索結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，為結(jié)直腸癌的診斷和治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 從exoRBase數(shù)據(jù)庫（http://www.exorbase.org/）中下載結(jié)直腸癌患者和正常對照者血液外泌體的RNA-seq數(shù)據(jù)。該數(shù)據(jù)庫包括12例結(jié)直腸癌患者和32例正常對照者的血液樣本。

1.2 篩選血液外泌體差異表達(dá)mRNAs和ncRNAs 應(yīng)用R軟件的Limma包篩選結(jié)直腸癌患者和正常對照者血液外泌體中的差異表達(dá)lncRNAs、circRNAs和mRNAs。以P＜0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)。利用R軟件的pheatmap包繪制熱圖，對差異基因進(jìn)行可視化。

1.3 構(gòu)建 ceRNA網(wǎng)絡(luò) 應(yīng)用 miRcode（http://www.mircode.org/index.php）預(yù)測lncRNA結(jié)合的 miRNA；應(yīng)用starBase（http://starbase.sysu.edu.cn/）數(shù)據(jù)庫預(yù)測 circRNA結(jié)合的miRNA；應(yīng)用TargetScan（http://www.targetscan.org/）和 miRanda（http://www.microrna.org/nicrorna/home.do）預(yù)測mRNA結(jié)合的共同miRNA。lncRNA或circRNA結(jié)合的miRNA與mRNA結(jié)合的miRNA取交集，以miRNA為中心構(gòu)建ceRNA網(wǎng)絡(luò)，應(yīng)用cytoscape3.8.0軟件進(jìn)行可視化構(gòu)圖。

1.4 差異mRNAs的富集分析 應(yīng)用R軟件的clusterProfiler包和enrichplot包對ceRNA網(wǎng)絡(luò)中的差異表達(dá)mRNAs進(jìn)行基因本體論（gene ontology,GO）功能富集和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 外泌體差異表達(dá)mRNAs和ncRNAs篩選 通過對結(jié)直腸癌患者和正常對照者血液外泌體的差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選，共篩選出125個(gè)差異表達(dá)mRNAs，其中上調(diào)表達(dá)117個(gè)，下調(diào)表達(dá)8個(gè)，見圖1a（插頁）；52個(gè)差異表達(dá)lncRNAs，均為上調(diào)表達(dá)，見圖1b（插頁）；81個(gè)差異表達(dá)circRNAs，其中上調(diào)表達(dá)47個(gè)，下調(diào)表達(dá)34個(gè)，見圖1c（插頁）。

圖1 結(jié)直腸癌患者與正常對照血液外泌體差異表達(dá)基因篩選（a：外泌體差異表達(dá)mRNAs；b：外泌體差異表達(dá)lncRNAs；c：外泌體差異表達(dá)circRNAs）

2.2 ceRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 TargetScan和miRanda預(yù)測的mRNA結(jié)合的 miRNAs有 121個(gè)，miRcode預(yù)測的lncRNA結(jié)合的miRNAs有193個(gè)，starBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測circRNA結(jié)合的miRNAs有266個(gè)。lncRNA或circRNA結(jié)合的miRNAs與mRNA結(jié)合的miRNAs取交集，構(gòu)建結(jié)直腸癌相關(guān)的ceRNA網(wǎng)絡(luò)。該ceRNA網(wǎng)絡(luò)包含 16個(gè) lncRNAs、13個(gè) circRNAs、62個(gè) miRNAs和 25個(gè) mRNAs，見圖 2（插頁）。

圖2 結(jié)直腸癌相關(guān)的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

2.3 差異mRNAs的生物學(xué)功能及信號(hào)通路富集分析 對ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中25個(gè)差異表達(dá)mRNAs進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。GO富集分析顯示，差異mRNAs主要富集于順面高爾基網(wǎng)，高爾基扁平囊和高爾基膜囊等細(xì)胞成分（CC）上，參與Ran GTP酶結(jié)合的分子功能（MF），涉及高爾基體合成等生物過程（BP）（見圖3a，插頁）。KEGG通路富集分析顯示：差異mRNAs顯著富集于絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路、胰高血糖素信號(hào)通路、Fcγ受體介導(dǎo)的吞噬作用等（見圖 3b，插頁）。

圖3 差異表達(dá)mRNAs的功能及通路富集分析（a：GO；b：KEGG）

3 討論

外泌體是一群直徑在30～100 nm之間的雙層膜結(jié)構(gòu)的囊性小泡，可作為穩(wěn)定的細(xì)胞間信息通訊的載體[8]。研究表明，腫瘤釋放的外泌體通過近分泌，膜融合、配體-受體結(jié)合，吞噬等方式進(jìn)入受體細(xì)胞，轉(zhuǎn)移和交換其包裹的致癌分子，包括lncRNA、circRNA、miRNA和mRNA等，在腫瘤細(xì)胞間的通訊中發(fā)揮關(guān)鍵作用，從而參與腫瘤的發(fā)生、增殖、轉(zhuǎn)移、血管生成、免疫逃逸和耐藥性[9-11]。隨著高通量測序技術(shù)及生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，外泌體內(nèi)ncRNA的表達(dá)譜被廣泛研究。然而，其在結(jié)直腸癌中的具體表達(dá)模式及具體的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步的探索。

本研究主要通過生物信息學(xué)方法對exoRBase數(shù)據(jù)庫中12例結(jié)直腸癌患者和32例正常對照血液外泌體的RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，共篩選出125個(gè)差異表達(dá)mRNAs，上調(diào)表達(dá)117個(gè)，下調(diào)表達(dá)8個(gè)；52個(gè)差異表達(dá)lncRNAs，均為上調(diào)表達(dá)52個(gè)；81個(gè)差異表達(dá)circRNAs，上調(diào)表達(dá)47個(gè)，下調(diào)表達(dá)34個(gè)。本研究表明，結(jié)直腸癌患者和正常對照者的血液外泌體ncRNAs顯示出不同的基因表達(dá)模式。這些差異表達(dá)的ncRNAs在結(jié)腸癌患者血液外泌體中富集且性質(zhì)穩(wěn)定，有望于成為結(jié)直腸癌患者早期無創(chuàng)診斷和預(yù)后標(biāo)志物。此外，外泌體為基礎(chǔ)的液體活檢是未來腫瘤分子診斷的發(fā)展方向。

近年來，ceRNA假說引起人們的關(guān)注，已成為研究RNA相互作用的熱點(diǎn)之一。mRNA、miRNA、lncRNA或circRNA間的調(diào)控機(jī)制極其復(fù)雜，具有重要的生物學(xué)意義。lncRNA或circRNA可與mRNA競爭結(jié)合miRNA，從而形成復(fù)雜的lncRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)或circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)，而ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的失衡可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[12]。Shang等[13]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤來源的外泌體circPACRGL作為miR-142-3p/miR-506-3p的海綿分子，促進(jìn)TGF-β1的表達(dá)，從而促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲及N1向N2中性粒細(xì)胞的分化。Wu等[14]研究表明，LNC473-miR574/miR15b-APAF1 IRES信號(hào)軸可調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和凋亡，進(jìn)而影響結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展。本研究通過生物信息學(xué)構(gòu)建了一個(gè)以miRNAs為中心的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，包含16個(gè)lncRNAs、13個(gè) circRNAs、62個(gè)miRNAs和25個(gè)mRNAs，顯示了結(jié)直腸癌潛在的lncRNA-miRNA-mRNA和circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控機(jī)制，為進(jìn)一步探索結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制指明方向。此外，ceRNA網(wǎng)絡(luò)中的差異表達(dá)mRNAs進(jìn)行GO功能及KEGG通路富集分析顯示，差異mRNAs顯著富集于MAPK信號(hào)通路。MAPK信號(hào)通路主要參與細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等多種生物學(xué)過程，MAPK信號(hào)通路的異?；罨c腫瘤的增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移及血管生成密切相關(guān)[15]。此外，差異mRNAs亦涉及Fcγ受體介導(dǎo)的吞噬作用、胰高血糖素信號(hào)通路等，提示其還可能與炎癥反應(yīng)及血糖調(diào)控等有關(guān)?；诖?，筆者可以初步闡明結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，為結(jié)直腸癌的早期診斷和預(yù)后提供潛在生物標(biāo)志物，為結(jié)直腸癌的精準(zhǔn)治療提供新的潛在靶點(diǎn)。

綜上所述，本研究采用生物信息學(xué)方法篩選結(jié)腸癌組和正常對照組血液外泌體差異表達(dá)基因，構(gòu)建以miRNA為中心的ceRNA網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)探索其分子生物學(xué)功能，初步闡明結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后復(fù)發(fā)的作用機(jī)制。后續(xù)筆者將進(jìn)一步通過體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)及臨床研究從細(xì)胞、整體及分子水平全面闡明結(jié)直腸癌的具體發(fā)病機(jī)制，以期為結(jié)直腸癌的早期診斷提供新型無創(chuàng)的分子標(biāo)志物，為結(jié)直腸癌的治療提供新的靶點(diǎn)，改善患者預(yù)后。