食品中蛋白質(zhì)含量測定方法的研究進(jìn)展

顏李秀 周邦萌 蘇琳 李瑜

食品可以給人們提供各種各樣的營養(yǎng)物質(zhì)，其中，蛋白質(zhì)是保證人體正常新陳代謝的重要化合物之一，豆類、花生、肉、乳、蛋和魚蝦等都含有豐富的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)是不同種類的氨基酸以“脫水縮合”的方式經(jīng)過特定的有機(jī)結(jié)合而組成的多肽鏈，在經(jīng)過一定的卷曲、折疊和盤繞之后形成的具有不規(guī)則空間結(jié)構(gòu)的化合物。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中含有氨基和羧基，因其空間位置和數(shù)量不同，經(jīng)過不同或相同氨基酸結(jié)合形成的蛋白質(zhì)就具有不同的性質(zhì)和功能。人體在吸收消化蛋白質(zhì)后得到氨基酸，再根據(jù)大腦信號和指令重新合成人體所需的蛋白質(zhì)，比如白蛋白、球蛋白、血紅蛋白、肌蛋白和載脂蛋白等，這些蛋白質(zhì)會(huì)重新參與到人體的新陳代謝中，為人們每天的生理活動(dòng)提供能量與支撐。

為了保證人體正常的新陳代謝和免疫功能，人每天必須食用一定量的蛋白質(zhì)，否則就可能因蛋白質(zhì)缺乏而患病，而精確評價(jià)蛋白質(zhì)含量可以為人們更科學(xué)地選擇食物提供方向。本文分析了蛋白質(zhì)的性質(zhì)，并綜述了蛋白質(zhì)含量檢測方法的研究進(jìn)展，比如凱氏定氮法、杜馬斯燃燒法、分光光度法等，以期為相關(guān)研究者進(jìn)一步找到準(zhǔn)確科學(xué)的蛋白質(zhì)含量檢測方法提供依據(jù)。

一、蛋白質(zhì)的性質(zhì)

蛋白質(zhì)含有氨基和羧基，兼有兩性，還有水溶性，帶電荷，可以利用這些性質(zhì)，通過加入某些物質(zhì)使蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)改變，從而進(jìn)行定量和定性檢測。在強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、重金屬鹽類等化學(xué)影響和高溫、X射線等物理影響下，蛋白質(zhì)都可能改變其分子的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，而且蛋白質(zhì)具有某些特殊苯環(huán)、肽鍵，可以發(fā)生雙縮脲的紫色反應(yīng)和硝酸的黃色反應(yīng)。

二、蛋白質(zhì)的檢測方法

蛋白質(zhì)在不同食物中的含量不盡相同，準(zhǔn)確知道其含量可以為人們合理選擇食物提供參考。世界各國已有不少檢測蛋白質(zhì)的方法，但由于其空間結(jié)構(gòu)和組成的復(fù)雜性，如何找到一種準(zhǔn)確、快速、靈敏度高、檢測成本低的檢測方法，學(xué)者們還在不斷探索。

目前文獻(xiàn)報(bào)道的檢測蛋白質(zhì)含量的方法有很多，歸納起來可以分成三種。一是將蛋白質(zhì)特有的氨基轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性的氨態(tài)氮，測定氮含量后，再根據(jù)氮的換算系數(shù)來計(jì)算得出蛋白質(zhì)含量，比如凱氏定氮法、杜馬斯燃燒定氮法等。二是利用蛋白質(zhì)中官能團(tuán)的化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生有色物質(zhì)，再檢測吸光度和透光率，比如雙縮脲反應(yīng)、染料結(jié)合法、福林酚法等。三是是利用蛋白質(zhì)的物理性質(zhì)，如等電點(diǎn)、帶電性、某些特征官能團(tuán)具有紅外吸收等原理，使用專用設(shè)備測試推算出含量，比如氨基酸分析法、高效液相色譜法、凝膠電泳法，此類方法多用于生物醫(yī)學(xué)，在食品中的檢測應(yīng)用較少。

1.凱氏定氮法。凱氏定氮法主要是利用不同種類的蛋白質(zhì)含有特定含量的氮，從而進(jìn)行檢測分析。將食品中的蛋白質(zhì)與硝酸、硫酸銅、硫酸鉀一起加熱消化，分解產(chǎn)生的氨與硫酸反應(yīng)生成硫酸銨，加入氫氧化鈉等堿液后蒸餾得到氨氣，用硼酸吸收后再用酸液滴定，得到滴定體積，根據(jù)氮的換算系數(shù)從而得到蛋白質(zhì)含量，這是推算的結(jié)果。比如用凱氏定氮法檢測魚中的蛋白質(zhì)含量，結(jié)果的準(zhǔn)確性與氮換算系數(shù)和樣品中測得氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)相關(guān)，但國標(biāo)GB5009.5-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》中未明確規(guī)定魚類蛋白質(zhì)的氮折算系數(shù)，計(jì)算時(shí)一般參照肉及肉制品的值6.25。查閱相關(guān)文獻(xiàn)可知，40種不同魚類的氮折算系數(shù)為7.0-7.5，都高于6.25，這給檢測結(jié)果帶來了一定的偏差。不過，不同部位、不同生長階段、不同性別、不同來源組織的魚的氮含量差異不大，基本都在某個(gè)特定值范圍內(nèi)。

對于食品中的非氨基酸態(tài)氮，比如尿素、嘌呤和嘧啶的堿基、氧化三甲胺、甜菜堿等具有一定的揮發(fā)性，建議用揮發(fā)性鹽基氮的國標(biāo)方法GB 5009.228-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》進(jìn)行測定，蛋白質(zhì)的最終含量為凱氏定氮法測得的總氮量減去非氨基酸態(tài)氮含量。用半自動(dòng)的凱氏定氮法檢測阿膠食品和保健品中的蛋白質(zhì)含量，氮的換算系數(shù)參考乳制品的值6.38，阿膠中的蛋白質(zhì)含量為23.2g/100g-23.75g/100g。魏永義用凱氏定氮法測定雞骨素中的蛋白質(zhì)含量為24.8g/100g，變異系數(shù)為1.27%。

凱氏定氮法是目前的國標(biāo)方法，也是經(jīng)典方法，但操作比較繁瑣，操作時(shí)間長，基本需要一天才能完成，雖然采用金屬催化劑、金屬鹽類等可以使消化時(shí)間縮短，但過程中用到的試劑和產(chǎn)生的二氧化硫?qū)θ梭w和環(huán)境的污染較大。后來發(fā)展起來的定氮儀用半自動(dòng)化的定氮功能解決了蒸餾的環(huán)境污染和危險(xiǎn)問題，提高了效率，縮短了時(shí)間，但全自動(dòng)的定氮儀價(jià)格較貴，增加了投入成本。

2.杜馬斯燃燒法。杜馬斯燃燒法也是通過測定氮含量來測定蛋白質(zhì)，與凱氏定氮法不同的是，杜馬斯燃燒法通過高溫燃燒試樣，在吸附處理掉干擾物后，還原成分子氮，再用氣相色譜儀的熱導(dǎo)檢測器進(jìn)行測定，具有分析時(shí)間短（5min以內(nèi)就可以完成一個(gè)樣品的檢測）、試樣需求量少的特點(diǎn)，可以明顯提高效率，適應(yīng)于綠色發(fā)展和綠色檢測，剛好彌補(bǔ)了凱氏定氮法的缺點(diǎn)。

為了對比兩種方法的優(yōu)缺點(diǎn)，很多研究者進(jìn)行了嘗試。利用杜馬斯燃燒法測定9種不同類別的食品中的蛋白質(zhì)含量，比較RSD值、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差和重復(fù)性，最終發(fā)現(xiàn)與凱氏定氮法的檢測結(jié)果無差異。利用杜馬斯燃燒法測定黃豆、奶粉和米粉中的蛋白質(zhì)，通過考察通氧量的影響、反應(yīng)爐溫的影響、稱樣量的影響、試樣的氮含量和狀態(tài)的影響，對于固體樣品，凱氏定氮法和杜馬斯燃燒法的測定結(jié)果基本一致，并首次用于液體樣品的檢測，結(jié)果接近理論含量，也顯示了良好的線性關(guān)系。利用杜馬斯燃燒法和凱氏定氮法檢測同一類物質(zhì)，無論是15種不同蔬菜，還是精米和糙米等稻米，兩種方法的精密度、準(zhǔn)確度均無明顯差異，而杜馬斯燃燒法顯示出了低成本、節(jié)約人力和時(shí)間、環(huán)境友好的優(yōu)勢。王鐵良優(yōu)化了提取溫度、固液比、提取時(shí)間和次數(shù)，再用杜馬斯法測定大豆中的水溶性蛋白質(zhì)含量，結(jié)果比凱氏定氮法略高，并創(chuàng)造性地引入了蒸發(fā)和干燥程度，增加了進(jìn)樣量，使結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度更有保證。易善平用杜馬斯燃燒法和凱氏定氮法同時(shí)快速測定各種狀態(tài)乳制品的含氮量，結(jié)果無明顯差異。

對比實(shí)驗(yàn)過程和結(jié)果，杜馬斯燃燒法比凱氏定氮法明顯縮短了檢測時(shí)間，試劑更環(huán)保和安全，廢棄物相對減少，有效地保護(hù)了環(huán)境，而且實(shí)現(xiàn)了連續(xù)進(jìn)樣，缺點(diǎn)就是儀器較貴，但這并不影響杜馬斯燃燒法成為歐美等國家法定檢測乳制品的分析方法，加拿大、美國和德國甚至將其作為唯一檢測特定領(lǐng)域蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)。

3.分光光度法。分光光度法是利用某種物質(zhì)與蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，生成物具有一定的顏色和吸光度，從而用儀器進(jìn)行檢測的方法，這也是目前利用蛋白質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行檢測的最廣泛的方法，具有設(shè)備簡單易得、低成本、檢驗(yàn)速度快、操作簡單的特點(diǎn)，結(jié)果能夠真實(shí)反映蛋白質(zhì)的含量。但是目前是靠經(jīng)驗(yàn)和間接驗(yàn)證得到反應(yīng)等式，還未找到與蛋白質(zhì)發(fā)生等量反應(yīng)的通用試劑。

（1）雙縮脲反應(yīng)。在堿性溶液中，含有兩個(gè)氨基甲?；牡鞍踪|(zhì)與銅離子反應(yīng)生成紫紅色絡(luò)合物，在540nm處有最大吸收值。當(dāng)條件一定時(shí)，蛋白質(zhì)含量和反應(yīng)顏色深淺正相關(guān)，這是肽和蛋白質(zhì)特有的性質(zhì)。張立娟用雙縮脲法在20-30min內(nèi)檢測出大豆分離蛋白粉中的蛋白質(zhì)含量，耗時(shí)比凱氏定氮法明顯減少，而且對環(huán)境友好，但此法只能對水溶性蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測。在用雙縮脲法進(jìn)行檢測時(shí)，難點(diǎn)在于找到合適的樣品進(jìn)行標(biāo)定，這樣才能保證結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

（2）染料結(jié)合法。染料結(jié)合法主要是針對同源蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測，操作簡單，靈敏度高，可以同時(shí)檢測多個(gè)樣品并實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化操作。試樣中的蛋白質(zhì)與過量染料形成不溶性鹽后析出沉淀，使用分光光度計(jì)檢測反應(yīng)前后的透明度變化。在食品蛋白質(zhì)檢測中，使用比較多的是考馬斯亮藍(lán)法和酸性橙12染色法?？捡R斯亮藍(lán)法的檢測原理是考馬斯亮藍(lán)G-250染料在酸性環(huán)境的吸收波長和與蛋白質(zhì)結(jié)合后的吸收波長發(fā)生改變，2min之內(nèi)呈色并在1h之內(nèi)穩(wěn)定，呈色由紅色變成藍(lán)色，吸光度與蛋白質(zhì)含量呈正相關(guān)，重現(xiàn)性好;但在酸性條件下反應(yīng)僅能檢測水溶性蛋白質(zhì)，有多糖物質(zhì)存在時(shí)也有明顯的干擾，而且不同蛋白質(zhì)檢測時(shí)顏色變化有明顯差異，需要針對特定蛋白質(zhì)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行校正。酸性橙12染料能夠檢測水溶性蛋白質(zhì)和不溶性蛋白質(zhì)，對于多種食品和原料均能準(zhǔn)確給出結(jié)果，同時(shí)用酸性橙12染料法和凱氏定氮法檢測谷物種子的蛋白質(zhì)含量和大豆蛋白，結(jié)果具有極高的相關(guān)性，具有可快速檢測和低成本的優(yōu)勢。

（3）福林酚法。福林酚法是蛋白質(zhì)測定最靈敏的方法之一，其顯色原理與雙縮脲法相同，再加入Folin酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽后，蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸殘基將其還原產(chǎn)生深藍(lán)色物質(zhì)，在一定條件下藍(lán)色深淺與蛋白質(zhì)的含量成正比。此法可以檢測到最低5μg含量的蛋白質(zhì)，其靈敏度比雙縮脲法高出100倍，缺點(diǎn)是廢時(shí)長、干擾多、專一性較差，曲線為非線性，現(xiàn)已被考馬斯亮蘭法所取代。

食品中的蛋白質(zhì)含量關(guān)乎大家的生命健康和生活質(zhì)量，“三聚氰胺”和“動(dòng)物水解蛋白”等食品安全事件的影響還未遠(yuǎn)去，蛋白質(zhì)的精準(zhǔn)測定方法亟需完善。凱氏定氮法因其應(yīng)用廣泛而成為其他方法的基礎(chǔ)，但卻無法區(qū)分是蛋白氮還是其他含氮物質(zhì)，無法第一時(shí)間識別“三聚氰胺”風(fēng)險(xiǎn)，還需要其他方法驗(yàn)證;杜馬斯燃燒法以其更環(huán)保、效率更高、操作成本更低、結(jié)果無差異化的優(yōu)點(diǎn)而被越來越多地用于科學(xué)研究中，在解決設(shè)備投入大的缺點(diǎn)后，期待能夠投入到日常的蛋白質(zhì)檢測中;分光光度法對于有特殊官能團(tuán)的蛋白質(zhì)能夠顯現(xiàn)特殊顏色，建立已知染料與蛋白質(zhì)的等量反應(yīng)可以提高結(jié)果的準(zhǔn)確性;其他物理方法用于生物蛋白的檢測較多。由于食品的復(fù)雜性和蛋白質(zhì)種類的多樣性，想要準(zhǔn)確檢測食品中蛋白質(zhì)的含量，還需進(jìn)一步研究非蛋白氮的檢測，找到某些物質(zhì)與蛋白質(zhì)的等量反應(yīng)。