外泌體在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩治療中的研究進(jìn)展

陶瑞 譚植襄 李思成 張偉 阮晶晶 余墨聲 朱占永

瘢痕是皮膚創(chuàng)傷愈合后形成的終末產(chǎn)物[1]。瘢痕的適當(dāng)形成在人體自我修復(fù)方面具有積極作用，但修復(fù)過程中有序的平衡被打破時(shí)，創(chuàng)面可能異常愈合產(chǎn)生瘢痕疙瘩或增生性瘢痕[2]。前者生長(zhǎng)不受限制，瘢痕可向周圍擴(kuò)展，后者瘢痕范圍一般不超過組織損傷范圍，但二者都以成纖維細(xì)胞異常增殖、細(xì)胞外基質(zhì)大量沉積為主要特征[3]。在發(fā)達(dá)國(guó)家，每年約有1億人為瘢痕及其相關(guān)問題所困擾[4]。瘢痕的出現(xiàn)不僅影響美觀、帶來(lái)局部不適，還能造成局部攣縮或畸形，影響患肢正常運(yùn)動(dòng)[5]。目前，瘢痕常規(guī)治療方式包括手術(shù)、放療、藥物治療，新型療法有電刺激、干細(xì)胞療法等[6]。由于瘢痕的高復(fù)發(fā)率以及缺少有效評(píng)估治療方法的深入研究，瘢痕治療依舊沒有被廣泛認(rèn)可的特效方法，尋找新的治療方案頗具意義[7]。有研究表明，外泌體可對(duì)瘢痕產(chǎn)生影響，能應(yīng)用于增生性瘢痕、瘢痕疙瘩的治療[8]。

一、外泌體概述

外泌體是一類直徑在30～150 nm之間，主要由胞內(nèi)溶酶體微粒內(nèi)陷形成的具有雙層膜樣結(jié)構(gòu)的多囊泡體[9]。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體中包含核酸、脂類、蛋白質(zhì)等多種生物活性物質(zhì)[10]。最初的研究認(rèn)為,外泌體的產(chǎn)生及分泌是細(xì)胞處理胞內(nèi)多余物質(zhì)的方法之一，有實(shí)驗(yàn)證明，外泌體可實(shí)現(xiàn)物質(zhì)的胞間轉(zhuǎn)運(yùn)，在胞間通訊過程中發(fā)揮重要作用[11]。此外，外泌體還具有免疫原性低、無(wú)細(xì)胞毒性、分子量低、安全性高等優(yōu)勢(shì)，能保證運(yùn)載物質(zhì)不被過早降解從而喪失活性[12]。

二、增生性瘢痕、瘢痕疙瘩的形成機(jī)制

增生性瘢痕、瘢痕疙瘩的病理學(xué)特征是細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的過度堆集。而與之形成相關(guān)的因素大致可分為三類：遺傳因素、機(jī)械張力、全身性因素[13]。

1.遺傳因素：通過研究瘢痕疙瘩病人家系，有學(xué)者認(rèn)為它是不完全外顯的常染色體顯性遺傳，且具有遺傳異質(zhì)性和延遲顯性的特征[14]。在瘢痕疙瘩與增生性瘢痕易感基因位點(diǎn)和基因多態(tài)性的研究上，Nakashima等[15]使用全基因組關(guān)聯(lián)研究方法發(fā)現(xiàn)，瘢痕疙瘩與3個(gè)染色體區(qū)域中的4個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)顯著相關(guān)。增生性瘢痕中也有類似報(bào)道，其與3個(gè)基因中的3個(gè)SNP存在相關(guān)性[16]。除了基因本身，表觀遺傳機(jī)制也在增生性瘢痕、瘢痕疙瘩的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。Hsus等[17]發(fā)現(xiàn)，使用曲古菌素(TSA)處理瘢痕中成纖維細(xì)胞可增加組蛋白H3的乙酰化水平，提高窖蛋白(CAV1)表達(dá)，減少Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(RUNX2)和纖維黏連蛋白的產(chǎn)生，從而降低成纖維細(xì)胞自身的遷移能力，抑制纖維化的發(fā)生。ncRNAs作用方面，lncRNA CACNA1-AS1可通過抑制miRNA-205表達(dá)，促進(jìn)人瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖和侵襲，抑制其凋亡[18]； cricRNA COL5A1可發(fā)揮內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)RNA的功能，通過吸附miRNA-7-5p釋放環(huán)磷酸腺苷交換蛋白1(Epac1)，激活磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號(hào)通路，促進(jìn)瘢痕異常增生[19]。

2.局部機(jī)械張力：臨床實(shí)踐過程中，人們發(fā)現(xiàn)增生性瘢痕、瘢痕疙瘩好發(fā)于前胸、肩胛等部位。這些部位皮膚常受到牽拉刺激，具有較高機(jī)械張力[20]。臨床經(jīng)驗(yàn)證實(shí)，降低皮膚所受機(jī)械張力，可顯著降低增生性瘢痕、瘢痕疙瘩的發(fā)生率[21]。上述證據(jù)表明機(jī)械張力與瘢痕的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。深入研究發(fā)現(xiàn)，皮膚局部機(jī)械張力可通過黏附斑激酶(FAK)/ 胞外相關(guān)激酶(ERK)/ 單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP1)途徑加速傷口愈合纖維化，促進(jìn)瘢痕產(chǎn)生[22]。Gao等[23]研究發(fā)現(xiàn)，瘢痕組織中富亮氨酸α2糖蛋白1(LRG-1)存在過表達(dá)現(xiàn)象，而LRG-1的表達(dá)與機(jī)械負(fù)荷呈現(xiàn)出時(shí)間和強(qiáng)度依賴關(guān)系。在機(jī)械張力導(dǎo)致的增生性瘢痕小鼠模型中，利用shRNA降低LRG-1的表達(dá)可減少新生血管的生成，抑制瘢痕形成。機(jī)械負(fù)荷誘導(dǎo)LRG-1的關(guān)鍵在于FAK / ERK信號(hào)通路的激活。這些研究發(fā)現(xiàn)，從微觀角度進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了機(jī)械張力與瘢痕的關(guān)聯(lián)。

3.全身性因素：影響增生性瘢痕、瘢痕疙瘩形成的主要全身性因素是循環(huán)免疫系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生的相關(guān)生物因子或蛋白[24]。有研究發(fā)現(xiàn)，常見的細(xì)胞因子及蛋白中，TGF-β1/2、IL-6/8/17/18、PDGF、FGF、EGF等具有促進(jìn)瘢痕形成的作用，而TGF-β3、IL-4/10、基質(zhì)金屬蛋白酶2/9(MMP-2/9)的作用則正好相反。這些生物活性物質(zhì)直接參與瘢痕的血管形成、炎癥反應(yīng)、組織纖維化和重塑等過程[25]。除此以外，個(gè)人生活習(xí)慣也對(duì)瘢痕有一定影響。Deliaert等[26]在一項(xiàng)前瞻性臨床研究中發(fā)現(xiàn)，吸煙者手術(shù)切口處瘢痕嚴(yán)重程度比不吸煙者更輕。產(chǎn)生該現(xiàn)象的原因可能是：吸煙會(huì)減少全身炎癥反應(yīng)。香煙中的尼古丁作為一種血管收縮劑，也可抑制巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的增殖和遷移，減少膠原蛋白沉積[27]。Hochman等[28]研究認(rèn)為，應(yīng)激事件觸發(fā)影響心理狀態(tài)的同時(shí)也能加重瘢痕的癥狀和體征，其機(jī)制可能是心理應(yīng)激刺激神經(jīng)、免疫及內(nèi)分泌系統(tǒng)，在創(chuàng)面上則表現(xiàn)出神經(jīng)性炎癥的增強(qiáng)。這些研究暗示影響瘢痕產(chǎn)生的相關(guān)危險(xiǎn)因素及其實(shí)際作用效應(yīng)遠(yuǎn)比我們想象的要復(fù)雜許多。

三、外泌體與瘢痕

1.外泌體對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)控：適度且可控的炎癥反應(yīng)有利于創(chuàng)面組織正常修復(fù)，減少瘢痕產(chǎn)生[29]。與正常瘢痕組織相比，增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中炎癥細(xì)胞明顯增多。此外，促炎因子TNF-α、IL-1、IL-6的表達(dá)也顯著上調(diào)。這些均提示異常的炎癥反應(yīng)是瘢痕增生的決定性因素之一。瘢痕的大小、生長(zhǎng)速度與炎癥反應(yīng)的刺激強(qiáng)度、持續(xù)時(shí)間具有相關(guān)性[30]。故對(duì)異常炎癥反應(yīng)的調(diào)控是治療增生性瘢痕、瘢痕疙瘩的重要途徑之一。

外泌體主要抗炎機(jī)制之一是其能夠作用于炎癥細(xì)胞，使其表型轉(zhuǎn)化為抗炎或免疫抑制細(xì)胞。如骨髓基質(zhì)細(xì)胞來(lái)源外泌體就可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞由M1型向M2型極化，調(diào)節(jié)促、抗炎因子表達(dá)比例，最終通過減輕局部炎癥反應(yīng)加速組織修復(fù)，減少瘢痕形成[31]。外泌體能影響巨噬細(xì)胞極化是因?yàn)槠鋵?duì)信號(hào)通路的影響。脂肪干細(xì)胞(ADSC)來(lái)源外泌體可通過介導(dǎo)核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)/ 血紅素加氧酶1(HO-1)軸實(shí)現(xiàn)對(duì)巨噬細(xì)胞的調(diào)節(jié)并減輕氧化應(yīng)激[32]。過表達(dá)Nrf2的ADSC來(lái)源外泌體可以抑制ROS和炎性因子IL-1β、IL-6 和TNF-α的表達(dá)，進(jìn)一步佐證以上觀點(diǎn)[33]。褪黑素刺激下間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)來(lái)源外泌體則可通過靶向PTEN/AKT信號(hào)通路，促使巨噬細(xì)胞向M2極化[34]。此外，外泌體也可以直接作用于抗炎細(xì)胞，達(dá)到減輕炎癥的目的。骨髓MSC來(lái)源外泌體就可直接上調(diào)IL-10、TGF-β1的表達(dá)，促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增殖，加強(qiáng)免疫抑制[35]。

2.外泌體對(duì)血管生成的調(diào)控：增生性瘢痕、瘢痕疙瘩比生理性瘢痕血管密度更高，深部組織供血更豐富[36]。有研究發(fā)現(xiàn)，這些瘢痕組織中新生血管的內(nèi)皮細(xì)胞是紊亂的，并對(duì)其發(fā)病機(jī)制提出新的觀點(diǎn)：瘢痕疙瘩、增生性瘢痕是血管性疾病，內(nèi)皮功能障礙在其發(fā)病過程中起關(guān)鍵作用。具體表現(xiàn)為：各類致病因素在創(chuàng)面愈合炎癥階段誘導(dǎo)了增生血管的內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，提高了血管通透性，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞發(fā)生趨化、聚集，產(chǎn)生的炎性因子通過損傷血管進(jìn)入血管周圍區(qū)域，加劇局部炎癥反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)瘢痕發(fā)展[37]。故減少新生血管的產(chǎn)生可降低瘢痕組織沉積。

有證據(jù)表明，外泌體中ncRNAs是抑制血管生成的主要物質(zhì)之一。膠質(zhì)瘤干細(xì)胞來(lái)源外泌體中miR-994可通過抑制AKT / ERK信號(hào)通路和VEGF的表達(dá)來(lái)抑制血管生成[38]。壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的脊索細(xì)胞來(lái)源外泌體通過調(diào)控miR-140-5p/Wnt/β-Catenin軸抑制血管生成[39]。

3.外泌體對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)與成纖維細(xì)胞的調(diào)控：正常傷口愈合增殖階段，成纖維細(xì)胞部分分化為肌成纖維細(xì)胞，通過表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)收縮傷口。隨后肌成纖維細(xì)胞在傷口愈合重塑階段發(fā)生凋亡，傷口愈合部位形成生理性瘢痕。而在異常的愈合進(jìn)程中，肌成纖維細(xì)胞持續(xù)存在，造成創(chuàng)面組織過度收縮，并在局部產(chǎn)生了過量的以膠原蛋白為主的細(xì)胞外基質(zhì)，最終形成增生性瘢痕、瘢痕疙瘩[40]。

人脂肪干細(xì)胞來(lái)源外泌體(ASC-Exo)可以抑制瘢痕組織中成纖維細(xì)胞的增殖、遷移、膠原合成，減輕其對(duì)創(chuàng)面的收縮作用[41]。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)面部位注射ASC-Exos 可以增加Ⅲ型膠原與Ⅰ型膠原的比例，減少瘢痕形成面積，同時(shí)增加體內(nèi)TGF-β3與TGF-β1的比例，阻止成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化。此外，ASC-Exos 通過激活ERK / MAPK途徑增加了皮膚真皮成纖維細(xì)胞MMP3的表達(dá)，使得MMP3與組織金屬蛋白酶抑制劑(TIMP1)的比例升高，這更利于細(xì)胞外基質(zhì)的重塑[42]。臍帶來(lái)源的MSC外泌體可通過抑制TGF-β / Smad2信號(hào)通路阻礙成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化，減輕瘢痕形成[43]。

4.外泌體對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控：在大面積燒傷或機(jī)械性創(chuàng)傷組織中，成纖維細(xì)胞往往過度增殖、分化而不易發(fā)生凋亡[44]。因此，誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞凋亡可能是繼抑制成纖維細(xì)胞增殖之后又一新的潛在治療手段。在瘢痕組織中，目前發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因包括p53基因、Survivin基因、Bcl-2基因等[45]。

骨髓來(lái)源MSC可分泌含有miR-9-5p的外泌體[46]，而miR-9-5p不僅可以抑制增生性瘢痕、瘢痕疙瘩中成纖維細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因(如α-SMA，vimentin，col1a) 的表達(dá)，防止細(xì)胞外基質(zhì)的過多沉積，還可以通過靶向抑制過氧化物酶體增殖物激活受體 β(PPAR β)的表達(dá)，加速成纖維細(xì)胞凋亡[47]。此外，Pang等[48]研究發(fā)現(xiàn)，miR-152-5p可通過調(diào)節(jié)Smad3的表達(dá)，促進(jìn)瘢痕組織中成纖維細(xì)胞的凋亡。Zhou等[49]實(shí)驗(yàn)提示，miR-519d可直接作用于靶基因Sirtuin(SIRT7) 的3′UTR，抑制增生性瘢痕、瘢痕疙瘩中成纖維細(xì)胞 α-SMA、Ⅰ型和Ⅲ型膠原的表達(dá)，誘導(dǎo)其凋亡。

四、總結(jié)與展望

綜上所述，外泌體可對(duì)增生性瘢痕和瘢痕疙瘩發(fā)揮多種作用。大量研究表明，外泌體具有減輕炎癥反應(yīng)、調(diào)控血管形成、重塑細(xì)胞外基質(zhì)、抑制成纖維細(xì)胞增殖和分化、誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞凋亡等特性，并可通過這些機(jī)制抑制瘢痕形成或治療瘢痕。然而不同條件下不同細(xì)胞來(lái)源的外泌體，其所含成分差異巨大。同時(shí)，想要明確某一外泌體中包含物質(zhì)的所有準(zhǔn)確成分，其難度與工作量不容小覷。故針對(duì)外泌體有效治療瘢痕的詳細(xì)作用機(jī)制仍待探索。

此外，雖然外泌體對(duì)瘢痕有治療效果，并且還具有免疫原性低、生物活性高、體外儲(chǔ)存方便等優(yōu)勢(shì)，但其體內(nèi)半衰期短、清除速率快、大規(guī)模制備困難、制備成本較高等缺點(diǎn)不可忽視。目前已有可運(yùn)載外泌體的生物活性載體或支架來(lái)解決上述部分問題，但這類產(chǎn)品的開發(fā)尚不完全成熟，材料的選擇、制備工藝的優(yōu)化以及生物相容性等問題將是需要不斷鉆研的長(zhǎng)期課題。

外泌體目前有望成為臨床治療瘢痕的一種新型手段，在抑制瘢痕形成、減少瘢痕面積、改善瘢痕臨床結(jié)局方面發(fā)揮積極作用。未來(lái)，外泌體很可能被商品化而大規(guī)模應(yīng)用于實(shí)際臨床診療中，通過單用或與已有療法聯(lián)用切實(shí)幫助瘢痕病人減輕痛苦，提高生活質(zhì)量。