七氟烷通過MAPK/STAT3信號通路誘導人口腔舌鱗狀細胞癌Tca-8113細胞凋亡

王世祿 馬乃全 周期 符少川 衣小卓 李媛

舌癌是口腔頜面部最常見的癌癥之一，且多為鱗狀細胞癌[1]?？谇击[狀細胞癌發(fā)展迅猛并且對于常規(guī)化學療法不敏感等問題，導致患者的，五年存活率低于62%，嚴重威脅著人們的生命和健康[2]。有研究表明，選用不同的麻醉藥物，對于腫瘤的治療會產生不同的影響，進一步影響腫瘤的轉移[3]。七氟烷(sevoflurane)因其具有鎮(zhèn)痛性強及誘導迅速等優(yōu)點被廣泛運用于腫瘤患者的手術治療中[4]。目前已經被證實，七氟烷能夠通過抑制肺癌A549細胞增殖、增加凋亡小體產生并激活caspase3/7等誘導肺癌A549細胞發(fā)生凋亡[5]。七氟烷通過下調MMP-9的表達，上調PKC上游信號通路，減少結腸癌細胞的體外遷移[6]。七氟烷還能夠通過調控p53信號通路誘導骨肉瘤SAOS2細胞發(fā)生凋亡[7]。因此本研究通過一系列體外實驗探究七氟烷對BSNQ對人口腔舌鱗狀細胞癌Tca-8113細胞人增殖抑制作用、誘導凋亡作用及其相關信號轉導途徑，進而為應用七氟烷治療癌癥提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞及主要試劑

人口腔舌鱗狀細胞癌Tca-8113細胞(中國科學院細胞研究所)；RPMI-1640液體培養(yǎng)基、胰蛋白酶(TE)、青霉素/鏈霉素雙抗(P/S)、及磷酸鹽緩沖液(PBS)(Hyclone公司， 美國)；胎牛血清(FBS)(美國Gibco公司， 美國)；四甲基偶氮唑藍(MTT)(Amresco公司， 美國)；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒和細胞凋亡與壞死檢測試劑盒(上海碧云天公司)；Bax、Bcl-2、cleaved-caspase-3(cle-cas-3)、cleaved-PARP(cle-PARP)、p38α/β、p-p38、JNK、p-JNK、ERK2、p-ERK、STAT3、p-STAT3及β-actin抗體、HRP標記山羊抗鼠/抗兔IgG(Santa Cruz公司， 美國)；p38抑制劑SB203580、JNK抑制劑SP600125及ERK抑制劑FR180204(上海MCE公司)、ECL化學發(fā)光試劑(Thermo公司， 美國)。

1.2 人口腔舌鱗狀細胞癌Tca-8113細胞的培養(yǎng)

人口腔舌鱗狀細胞癌Tca-8113細胞在含10%的FBS、100 μg/mL的鏈霉素及100 U/mL的青霉素的RPMI-1640液體培養(yǎng)基， 37 ℃ 5%、 5% CO2培養(yǎng)箱中孵育，待細胞達到70%～85%時進行傳代。選擇處于對數(shù)生長期的Tca-8113細胞進行實驗。

1.3 建立七氟烷處理后細胞凋亡模型

七氟烷麻醉機進行檢測后，向揮發(fā)罐中加入七氟烷試劑。隨后Tca-8113細胞置于無菌特制密閉容器后，出氣口與分析儀連接，進氣口(5% CO2)與麻醉機進行連接。將容器放置于37 ℃恒溫水浴鍋中，根據(jù)實驗將揮發(fā)罐旋轉到指定刻度。當濃度達到實驗要求時，關閉揮發(fā)罐，將容器密閉，每組處理6 h，處理完畢后，從密閉容器中取出，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 MTT比色法檢測Tca-8113細胞的存活率

將Tca-8113細胞接種于96 孔板中(密度為1×104個細胞)，孵育24 h。待細胞貼壁后，1% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液進行血清饑餓2 h后，每孔加入1 μL不同濃度(2、 4、 6、 8、 10 μmol/L)七氟烷孵育24 h(每個濃度段均設置8 個復孔，其中溶劑對照組加入1 μL DMSO)。每孔加入15 μL的MTT，繼續(xù)孵育2～4 h后。棄培養(yǎng)液，加入100 μL的DMSO，搖床避光混勻15 min后，酶聯(lián)免疫檢測儀測量吸光度(A490)值，并計算各組Tca-8113細胞的存活率。每組實驗重復3次。細胞存活率=(七氟烷處理組A490值-調零組A490值)/(對照組A490值-調零組A490值)×100%。

1.5 Hochest 33342/PI雙染法檢測Tca-8113細胞凋亡情況

人口腔舌鱗狀細胞癌Tca-8113細胞接種于6 孔板內(每孔1×105個細胞)，終濃度為8 μmol/L七氟烷分別處理細胞不同時間段(3、 6、 12、 24 h)后，根據(jù)細胞凋亡與壞死檢測試劑盒說明書對Tca-8113細胞進行染色，熒光顯微鏡下拍照，觀察細胞凋亡情況。

1.6 流式細胞術檢測Tca-8113細胞凋亡情況

人口腔舌鱗狀細胞癌Tca-8113細胞接種于6 孔板內(每孔1×105個細胞)，終濃度為8 μmol/L七氟烷分別處理細胞不同時間段(3、 6、 12、 24 h)后，收集細胞于離心管中，根據(jù)碧云天Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒說明書要求對Tca-8113細胞進行染色，室溫下避光孵育20 min后， 500 μL PBS將細胞重懸并轉入流式管中，通過流式細胞儀檢測細胞的早期凋亡與晚期凋亡情況。測定結果利用CytExpert 1.2軟件對各時間段細胞凋亡情況進行統(tǒng)計。

1.7 Western blot法檢測細胞中凋亡相關蛋白的表達

將七氟烷處理不同時間(3、 6、 12、 24 h)后的Tca-8113細胞收集于離心管中，提取蛋白，變性后上樣30 μg。10%～12 %的SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，半干轉至NC膜上。5 %的脫脂乳室溫封閉1.5 h，TBST洗滌5 次，每次5 min。加入一抗Bax、Bcl-2、cle-cas-3、cle-PARP、p38α/β、p-p38、JNK、p-JNK、ERK2、p-ERK、STAT3、p-STAT3及β-actin(稀釋比例為1∶2500)，搖床孵育過夜(4 ℃)。將對應一抗收回，TBST洗滌5 次，加入二抗HRP標記山羊抗兔、抗鼠IgG室溫搖床孵育2 h， ECL化學發(fā)光試劑顯色，利用化學發(fā)光型凝膠成像系統(tǒng)照相。內參采用β-actin。ImageJ 1.42q軟件進行灰度分析。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 七氟烷對Tca-8113細胞的殺傷作用

隨著七氟烷處理的濃度逐漸升高(1、 3、 10、 30、 100 μmol/L)，人口腔舌鱗狀細胞癌Tca-8113細胞的存活率不斷降低，且呈現(xiàn)濃度依賴性。經計算得出七氟烷的IC50值為8 μmol/L。與對照組相比具有明顯差異(P<0.01)(圖 1)。

圖 1 七氟烷對Tca-8113細胞的殺傷作用

2.2 七氟烷對Tca-8113細胞的誘導凋亡作用

隨著七氟烷處理時間的不斷延長(3、 6、 12、 30、 24 h)，人口腔舌鱗狀細胞癌Tca-8113細胞的熒光強度逐漸增強，其細胞凋亡的水平也逐步增加，細胞在處理24 h時， 熒光強度達到最高且呈現(xiàn)時間依賴性(圖 2A)，不同時間段處理的Tca-8113細胞組具有顯著差異(P<0.01)。為了進一步確定七氟烷是否能夠誘導Tca-8113細胞發(fā)生凋亡，通過流式細胞術檢測處理不同時間(3、 6、 12、 24 h)后細胞凋亡情況。如圖 2C所示，隨著七氟烷處理時間的不斷延長，Tca-8113細胞的早期凋亡與晚期凋亡數(shù)量逐漸增多，且呈現(xiàn)一定的時間依賴性。 此外， 從分子水平上通過Western Blot檢測凋亡相關蛋白的表達量變化， 隨著七氟烷處理時間的不斷增加，與0 h相比，Bax、cle-cas-3及cle-PARP蛋白的表達量逐漸升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達量逐漸降低(圖 2E)。

圖 2 七氟烷誘導Tca-8113細胞凋亡

2.3 七氟烷通過MAPK及STAT3信號通路誘導Tca-8113細胞凋亡

為了確定七氟烷誘導Tca-8113細胞凋亡的分子機制，Western bot檢測MAPK及STAT3信號通路相關蛋白的表達量變化情況。隨著七氟烷處理時間的增加(3、 6、 12、 24 h)，與0 h相比， p-p38及p-JNK蛋白的表達量不斷增加， p-ERK及p-STAT3蛋白的表達量逐漸降低(P<0.01)(圖 3)。

圖 3 七氟烷誘導Tca-8113細胞MAPK/STAT3信號通路相關蛋白表達

2.4 七氟烷通過由MAPK調控的STAT3信號通路誘導Tca-8113細胞凋亡

為了進一步確認MAPK與STAT3信號通路的關系，Tca-8113細胞預處理MAPK抑制劑后，終濃度為8 μmol/L的七氟烷處理不同時間(3、6、12、 24 h)，通過Western blot檢測相關蛋白的表達量變化情況。隨著七氟烷處理時間的不斷延長，與七氟烷單獨處理組相比，p38抑制劑(SB203580)和JNK抑制劑(SP600125)與七氟烷共同處理組的p-p38、p-JNK、clea-cas-3和cle-PARP降低，p-STAT3及Bcl-2升高；相反，ERK抑制劑(FR180204)與七氟烷共同處理組的p-ERK、p-STAT3及Bcl-2蛋白的表達量降低，cle-cas-3及cle-PARP蛋白的表達量升高(圖 4)。

圖 4 七氟烷通過由MAPK調控的STAT3信號通路誘導Tca-8113細胞凋亡

以上結果表明，七氟烷通過由MAPK調控的STAT3信號通路誘導Tca-8113細胞凋亡(圖 5)。

圖 5 七氟烷誘導Tca-8113細胞凋亡的作用機制

3 討 論

七氟烷是臨床上常見的氣體麻醉劑，以往的研究表明，七氟烷能夠通過激活cleaved-caspase-3蛋白的表達，下調G2/M相關蛋白的表達量，將細胞阻滯在G2/M期，抑制肺癌A549增殖，進而使A549細胞發(fā)生凋亡[8]。此外，七氟烷作為氣體麻醉劑能夠通過抑制中性粒細胞MMP-9的釋放，干擾CXCR2下游信號通路的表達，激活蛋白激酶C上游信號通路的表達，進而使MMP-9的表達量下降，最終降低癌細胞的體外遷移程度[6]。

本實驗MTT比色法的結果中顯示七氟烷能夠有效地殺傷人舌鱗狀細胞癌Tca-8113細胞，抑制其增殖，并呈劑量依賴性。癌癥的產生和治療與細胞凋亡和細胞增殖有很大關聯(lián)，細胞凋亡現(xiàn)象存在于大多數(shù) 腫瘤細胞中，凋亡的發(fā)生由促凋亡因子和抗凋亡因子相互調節(jié)平衡，一旦失衡，就會引發(fā)疾病的產生[9]。本實驗進一步通過Hochest 33342/PI雙染、流式細胞術及Western blot證明，七氟烷能夠誘導人口腔舌鱗細胞癌Tca-8113細胞凋亡MAPK信號通路是調節(jié)細胞生長、增殖和凋亡等多種細胞生物進程中最經典的信號通路之一。由p38 MAPKs、JNK及ERK組成[10]。除此之外，STAT3信號通路能夠將細胞外信號轉移到細胞核中并誘導激活靶基因。一直以來，腫瘤的發(fā)生被認為是一個多階段過程，因此STAT3信號通路被認為是其中的一個關鍵因子[11]。為了探究七氟烷誘導Tca-8113細胞凋亡的分子機制，本實驗通過Western blot實驗檢測MAPK及STAT3信號通路相關蛋白的表達量變化情況，并進一步加入MAPK抑制劑，探究MAPK與STAT3信號通路的關系。Western blot結果顯示，七氟烷通過MAPK/STAT3信號通路誘導人口腔舌鱗狀細胞癌Tca-8113細胞發(fā)生凋亡，并且MAPK調控STAT3信號通路。

綜上所述，七氟烷有效抑制Tca-8113細胞增殖，并通過MAPK及STAT3信號通路誘導其凋亡。本實驗初步探索了七氟烷誘導人口腔舌鱗狀細胞癌Tca-8113細胞凋亡的分子機制，為七氟烷在臨床上的廣泛應用提供了一定的理論支持。