脫礦牙本質(zhì)基質(zhì)和絲素蛋白復(fù)合生物膜的初步構(gòu)建

楊興華 韓曉艷 李俊福 劉敏

家蠶絲素蛋白(silk fibroin protein， SF)因具有致孔性、可吸收性、良好生物相容性，而應(yīng)用于骨組織工程支架的研究[1]。但SF缺乏細胞活性因子、低抗壓性,難以滿足臨床需要。牙本質(zhì)硬度高，脫礦后暴露的牙本質(zhì)基質(zhì)(demineralized dentin matrix, DDM)含有大量對細胞調(diào)控的活性因子[2-3]。聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)無免疫原性、毒性、保護藥物活性，可用作載體和交聯(lián)劑[4-5]。本研究嘗試以PEG為交聯(lián)劑結(jié)合SF、DDM材料優(yōu)點，構(gòu)建具有多孔、生物活性和抗壓的可吸收骨替代材料，以期應(yīng)用于臨床牙槽骨、頜骨骨量不足的治療。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

CCK-8試劑盒(CCK-8 kit, 廣州奕源生物科技)； 傅立葉紅外光譜儀(Tensor II 布魯克， 德國)； 掃描電鏡(JSM 6610LV JEOL， 日本)； BCA試劑盒 (北京PC0020 Solarbio)； ALP一抗(ab108337)、BMP-2一抗(ab14933)、RUNX2抗 (ab23981 )、I型膠原一抗(ab21286 )﹑OCN一抗 (ab13420)(abcam， 英國)；SD 大鼠(山東大學試驗動物中心)，動物試驗經(jīng)山東第一醫(yī)科大學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 SF溶液的制備 蠶絲洗凈、干燥后0.02 mol/L碳酸鈉溶液中脫膠、涼干，得到絲素；絲素在LiBr(摩爾濃度9.3 M)溶液中溶解、透析得到SF溶液；SF經(jīng)稀釋或者濃縮得到工作濃度。

1.2.2 DDM顆粒的制作 正畸拔除的健康年輕恒牙，經(jīng)拔髓、脫鈣、脫脂、清洗、晾干、冷凍后制成粒徑為100～500 μm的顆粒， -20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 SF及SF-DDM膜的制備 6% SF溶液-20 ℃預(yù)冷12 h， -60 ℃真空冷凍干燥， 80%冷乙醇浸泡，去離子水沖洗、凍干，得到SF膜。SF膜粉碎為100～500 μm的顆粒濕潤后與DDM以體積比9∶1(10%)、 7∶3(30%)、 5∶5(50%)混合加入試件模具，滴加含1% PEG6000的6% SF溶液至液平，經(jīng)預(yù)冷凍、冷干、異構(gòu)、沖洗、干燥得到DDM-SF生物膜。

DDM-SF生物膜性能測定：支架孔徑采用電競下根據(jù)標尺測量10 個不同位點的孔徑取均值?？紫堵实臏y量：室溫下制作的材料浸入正己烷5 min，浸入前體積V1，浸入后體積V2和材料取出后體積V3，采用公式致孔率&%=(V1-V3)/(V2-V3)得出。壓縮強度測定：萬用電子力學測試機測得的材料力學數(shù)值取均數(shù)(n=3)。

1.2.4 紅外光譜儀測定 將生物膜各成份加工成粉末,KBr 壓片制樣，傅立葉紅外光譜儀測試， 4500～400 cm-1吸光度掃描，得到紅外吸收光譜。

1.2.5 X-Ray Diffraction(XRD)檢測生物材料的空間結(jié)構(gòu) 樣品表面研磨拋光，制樣、X射線衍射儀上架、設(shè)置參數(shù)、測試、檢索。

1.2.6 大鼠骨髓基質(zhì)干細胞(rat bone marrow stem cells rBMSCs)的體外培養(yǎng)、鑒定 2 周齡大鼠截取股骨沖洗髓腔、全血貼壁培養(yǎng)。貼壁第二代細胞經(jīng)CD11b、CD29、CD44、CD45、CD90流式細胞儀檢測；細胞以5×105個/mL鋪板進行成脂、成骨、成神經(jīng)元樣細胞分化誘導。

1.2.7 CCK-8對生物膜表面干細胞活性檢測 無菌條件下生物膜剪成小片覆蓋96 孔板底部, SF為對照組、含DDM膜為試驗組， 5×105個/mL rBMSCs接種于膜,進行1～7 d的CCK-8檢測。檢測時取酶標儀450 nm處培養(yǎng)基的吸光光度值(A值)。

1.2.8 生物膜對干細胞分化檢測 1×106個/mL rBMSC接種DDM-SF膜上。SF為對照組和含DDM為試驗組。1、 3、 5 周時，采用研磨法提取細胞的蛋白，進行ALP、RUNX2、COL-1、BMP-2的蛋白印染檢測(Western blot)、掃描電鏡(SEM)檢測1 周時生物膜上的細胞。

1.2.9 大鼠顱骨極限缺失模型的建立和修復(fù) SD雄性成年大鼠麻醉后，顱骨制備直徑5 mm極限骨缺損區(qū)。含1×106個 /mL細胞的30% DDM-SF膜(試驗組)、SF膜(對照組)分別放置入5 mm顱骨缺損中，術(shù)后2、 4、 12、 24 周取出膜，進行HE染色和RUNX2、COL-1、 OCN組化免疫染色檢測。

2 結(jié) 果

2.1 制備的DDM-SF膜特性

生物膜呈白色、多孔、有彈性，孔徑(圖 1)隨DDM比例的增加而逐漸縮小，比較各組間孔徑(Newman-Keuls多重比較測試，P<0.05)有差異。生物支架壓縮強度(圖 1)，生物支架壓縮強度隨牙本質(zhì)比例的增加逐漸增大，各組間壓縮強度(單因素方差分析P<0.000 1，P<0.05 )有差異。30% DDM-SF孔隙率82.99%±0.3433%。DDM-SF生物膜與SF膜的孔徑、壓縮強度對比如下(圖 1)

圖 1 DDM-SF膜的孔徑和壓縮強度

2.2 DDM-SF生物膜傅立葉紅外光譜檢測

測得的SF(圖 2A)特征吸收峰出現(xiàn)在3 500 cm-1的酰胺基；牙本質(zhì)的吸收特征波長(圖 2B)為1 033 cm-1處磷酸根、 1 385 cm-1處碳酸根、 3 442.20 cm-1、 1 631.92 cm-1氮氫鍵。PEG特征吸收峰(圖 2C)體現(xiàn)在2 886 cm-1為O-H鍵。在DDM-SF生物支架(圖 2D)中SF 1 631 cm-1和3 442 cm-1處譜峰為酰胺鍵中-CN伸縮振動和-NH面內(nèi)變形振動，PEG在峰值2 886 cm-1C=O鍵伸縮振動，-CO-NH形成。紅外光譜圖如下(圖 2)。

圖 2 DDM-SF膜傅里葉紅外光譜圖

2.3 XRD檢測數(shù)據(jù)分析

經(jīng)軟件Jade5.0分析：DDM-SF材料的結(jié)晶度好，存在無機鹽衍射峰，材料具有三維有序結(jié)構(gòu)。

2.4 rBMSCs的細胞培養(yǎng)、鑒定

培養(yǎng)骨髓干細胞呈多角形、短梭形。第二代干細胞經(jīng)流式細胞儀檢測:CD29、CD44、CD90呈陽性,CD11b、CD45呈陰性。誘導后的rBMSC茜素紅染色

為陽性、油紅O染色呈粟狀紅色、NSE免疫熒光染色呈陽性。

2.5 在DDM-SF膜上rBMSC的cck-8檢測結(jié)果

DDM-SF膜、SF膜在1～7 d的時間內(nèi)培養(yǎng)基A值(圖 3 )1～3 d均緩慢下降， 4 d之后DDM-SF膜A值提升快于SF膜。對照組與試驗組 A way ANOVA 檢驗, 具有差異顯著性(P<0.05)。30% DDM-SF對細胞生長促進效果最佳。酶標儀 450 nm(n=6)處測CCK-8培養(yǎng)基吸光度A值如下：

圖 3 BMSCs的增殖曲線(CCK-8實驗)

2.6 SEM對DDM-SF結(jié)構(gòu)及rBMSC的觀測

DDM與SF結(jié)合緊密，生物膜呈多孔狀(圖 4A)，DDM散在分布。隨著DDM比例的增加，支架孔隙率在減少。rBMSC在生物膜表面3 d時貼壁欠佳， 1 周時與DDM-SF貼壁，細胞舒展(圖 4B)。

圖 4 DDM-SF結(jié)構(gòu)與貼壁細胞(SEM)

2.7 接種rBMSC的DDM-SF不同時間段提取蛋白Westernblot檢測結(jié)果

RUNX2表達較晚且隨時間逐漸增強。ALP、Col-1有較早表達，ALP在第三周時表達最為充分，30% DDM-SF對成骨分化促進最佳(圖 5)。

圖 5 Western blot檢測BMSCs-DDM-SF隨時間蛋白生成變化

2.8 生物膜在植入大鼠顱骨缺損區(qū)組織化學免疫染色結(jié)果(圖 6)

COL-1第2 周時局部有弱的表達(圖 6A)， 4、 12 周時在牙本質(zhì)凹陷內(nèi)表達顯著， 24 周COL-1最顯著(圖 6B)。RUNX22 周時表達陰性(圖 6C)， 4 周在DDM凹陷處出現(xiàn)強表達(圖 6D)， 24 周時RUNX2表達廣泛但強度下降。OCN出現(xiàn)最晚， 12 周開始出現(xiàn)表達( 圖 6E)， 24 周時有較強表達(圖 6F)。免疫組化顯示： COL-1、RUNX2、OCN隨時間延長依次表達。

圖 6 DDM-SF在植入動物體內(nèi)的免疫組化染色(×200)

2.9 SF、 30% DDMSF在動物體內(nèi)的HE染色結(jié)果

HE染色顯示6%SF膜結(jié)構(gòu)呈連續(xù)性孔的結(jié)構(gòu)。SF膜體內(nèi)修復(fù)骨缺損2 周時細胞散在支架空隙中，在4 周時(圖 7A)細胞增殖明顯， 12 周時高倍鏡下細胞在膜局部區(qū)域密集，增殖較快，充滿整個通道；孔隙較大的區(qū)域細胞稀疏(圖 7B)。 24 周時絲素蛋白大部吸收。試驗組30% DDM-SF與SF膜比較組織形成分散均勻， 4 周時(圖 7C)類成骨細胞和類骨質(zhì)在牙本質(zhì)表面附近出現(xiàn)； 12 周時細胞、類骨質(zhì)和成骨細胞更加豐富； 24 周時類骨質(zhì)在DDM吸收的凹陷處形成明顯(圖 7D)。

圖 7 SF膜、DDM-SF膜植入動物體內(nèi)不同時間段HE染色(×100)

3 討 論

3.1 孔徑對生物膜及組織工程支架承載細胞功能的影響

骨組織工程中支架的孔狀結(jié)構(gòu)為種子細胞提供附著、代謝、遷移的空間，理想的空隙直徑在100～300 μm之間[6-9]。30% DDM-SF制作的生物膜孔隙直徑為(106.637 0±25.445 4) μm、孔隙率為82.99%，適合細胞進行正常的生理活動。當DDM比例增加至50%時，孔徑<100 μm，不適合再作為骨組織工程支架。XRD顯示生物膜為DDM散布其間的多孔立體結(jié)構(gòu)，有利于細胞的生長。在HE染色的局部剖面中顯示膜適宜孔徑通道對細胞增殖遷移較佳，局部過大或過小的孔徑不利于細胞的遷移、增殖。

支架孔的制備方法中冷凍干燥法工藝相對簡單,為常采用的孔隙制備方法[10]，但膜的孔徑、孔隙率與濃度呈反比,孔隙率隨冷凍溫度的降低而升高。DDM-SF經(jīng)-20 ℃預(yù)冷凍保留了孔的較大直徑,再經(jīng)-60 ℃凍干增加了材料的致孔率，與有關(guān)研究一致[11]。

3.2 DDM和PEG在絲素蛋白支架生物材料中的作用

成骨材料需要承受生理壓力，來維持正常的功能，壓縮強度是一個重要指標。研究資料顯示SF支架的壓縮強度與濃度呈正相關(guān)，同等條件下凍干制備的材料強度更佳[5,12]。目前SF支架的研究濃度多集中在1%～15%之間，不能承受骨在功能狀態(tài)下的壓縮，需生物羥基磷灰石、殼聚糖以及加入交聯(lián)劑等方法提高材料力學性能[13]。本研究中以PEG為交聯(lián)劑[14]，PEG與DDM、SF可形成共價鍵，使DDM-SF壓縮強度顯著提高，同時PEG增加了生物膜的柔韌性[15]。但PEG具有一定的溶解性，易致細胞培養(yǎng)基變渾濁，使用濃度不宜過高。

在DDM-SF膜中DDM另外一個重要功能是作為細胞調(diào)控因子使用，也可以為成骨提供原材料[16]；100～1 000 μm粒度的DDM被認為更有利于新骨形成[17]，生物活性因子主要存在于有機基質(zhì)內(nèi)[18]。rBMSC接種到DDM-SF生物膜經(jīng)體內(nèi)、外培養(yǎng)，經(jīng)WB檢測RUNX2、BMP-2、ALP、Col-1等成骨蛋白有顯著性表達；HE染色、組織化學免疫染色顯示有類成骨細胞廣泛分布及類骨質(zhì)樣組織形成，驗證了DDM對成骨的誘導性。牙本質(zhì)及DDM在牙髓病治療和牙種植骨量不足臨床患者中使用具有Bio-Oss同樣的成骨效果[3,19]。

3.3 DDM-SF支架膜的生物相容性和應(yīng)用展望

絲素在多項研究中認為是無細胞毒性的可吸收材料[20], 在模擬體內(nèi)骨細胞生長環(huán)境中多孔絲素支架承載的細胞生長正常并有羥基磷灰石的沉淀以及類骨小梁細胞的出現(xiàn)[21]。SEM和CCK-8檢測到細胞初期抑制，考慮與SF、DDM的材料處理試劑殘留有關(guān)。生物膜在動物體內(nèi)經(jīng)HE染色、組織化學免疫染色切片中未見炎性細胞浸潤,也驗證了生物膜沒有排斥反應(yīng)；生物膜24 周時組織切片中細胞成分占據(jù)大部分,SF、DDM也大部吸收，說明DDM-SF具有良好的生物相容性、可吸收性。

綜上， 由于SF、牙本質(zhì)取材廣泛、還可利用自體牙進行個性化的骨替代材料的制作，克服了倫理問題和免疫反應(yīng)。隨著新技術(shù)、新材料的發(fā)明如靜電紡絲和石墨烯等，可以進一步提高DDM-SF材料性能，逐步解決細胞貼壁速率、材料孔徑的均質(zhì)性控制，材料的體內(nèi)降解速度等。DDM-SF有望廣泛應(yīng)用于牙種植牙槽骨骨量不足的骨替代、下頜骨局部或大部喪失后的重建、面部美容等治療。