帶蒂頰脂墊修復(fù)頰黏膜缺損的動物實驗研究

史瑋 蒲嬌 郭治辰 李曉文 龔忠誠

自1977 年Egyedi[1]使用頰脂墊(buccal fat pad,BFP)修復(fù)軟組織缺損后，被越來越廣泛的應(yīng)用于臨床，如腫瘤術(shù)后缺損修復(fù)[2]、腭裂[3]、上頜竇瘺的修復(fù)[4]等。臨床中我們發(fā)現(xiàn)帶蒂頰脂墊修復(fù)頰黏膜缺損愈合效果較好，并發(fā)癥少，且能上皮化，而對其中上皮化缺乏組織學(xué)水平的探討及相關(guān)機制的闡述，口腔復(fù)雜的環(huán)境中，唾液對于創(chuàng)面愈合的促進作用也值得我們進一步去驗證探究。因此本實驗旨在通過動物模型從組織學(xué)水平來驗證上皮化這一現(xiàn)象，觀察創(chuàng)面愈合的組織學(xué)變化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗動物：選取6 只3 月齡新西蘭白兔雌雄不限，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，體重在2～3 kg之間(新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心)。

1.2 主要材料與儀器

實驗試劑：速眠新(吉林圣達(dá))；舒泰?50(Virbac，F(xiàn)rench)； 4%多聚甲醛(武漢博士德)；蘇木素-伊紅染色試劑盒(北京中杉金橋)；中性樹膠、Masson染色試劑盒(北京索萊寶)；實驗儀器：光學(xué)顯微鏡及照相系統(tǒng) (Olympus，日本)；石蠟包埋機、石蠟切片機(Leica， 德國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型建立 將新西蘭白兔用舒泰0.1 mL/kg+速眠新0.1 mL/kg混合肌注全身麻醉后固定于兔臺，常規(guī)消毒,口內(nèi)用黏膜碘消毒、鋪無菌單。右側(cè)為實驗側(cè)使用頰脂墊修復(fù)，左側(cè)為對照側(cè)創(chuàng)面將自然愈合。用尖刀在雙側(cè)頰黏膜制備一深至黏膜下層缺損約1 cm×1 cm，實驗側(cè)繼續(xù)鈍性分離可見一脂肪團，輕牽出將頰脂墊與創(chuàng)緣周邊縫合，將頰脂墊與創(chuàng)緣周邊縫合，止血，對照側(cè)裸露創(chuàng)面自然愈合，徹底止血后結(jié)束手術(shù)。造模后常規(guī)進行3 d的流質(zhì)飲食以及慶大霉素80 萬單位肌注預(yù)防感染。

所有實驗動物由新疆醫(yī)科大學(xué)動物中心提供，且經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)(批號：IACUC20190416-03)。 實驗動物質(zhì)量合格證號：SCXK(新)2018-0002，實驗動物設(shè)施使用許可證號：SCXK(新)2018-0003。

1.3.2 檢測指標(biāo) 創(chuàng)面愈合面積觀察:造模當(dāng)天、術(shù)后1、 2、 4 周記錄術(shù)區(qū)照片，觀察傷口愈合情況，使用Image J 軟件計算愈合面積。標(biāo)本制備及染色觀察： 1、 2、 4 周空氣栓塞處死將造模區(qū)域組織擴大切除，經(jīng)4%多聚甲醛固定、脫水包埋，切片機制備4 μm厚切片備用。 HE 染色及Masson染色：于HE染色觀察上皮化與炎細(xì)胞浸潤情況；Masson染色切片觀察膠原纖維情況，采用Image Pro Plus 6.0軟件測定膠原纖維沉積百分比。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 傷口愈合觀察結(jié)果

術(shù)后1 周可見實驗組創(chuàng)面已基本閉合，表面質(zhì)地軟不平滑，對照組可見創(chuàng)面縮小變淺仍未完全閉合；術(shù)后2 周可見實驗組及對照組創(chuàng)面均已完全閉合，實驗組創(chuàng)面區(qū)域質(zhì)地均勻，對照組創(chuàng)面區(qū)域質(zhì)地稍硬且不夠平滑。術(shù)后4 周實驗組術(shù)區(qū)愈合較佳呈粉紅色，與周圍正常黏膜組織基本一致，對照組仍有輕度充血。頰黏膜缺損模型建立及愈合如圖 1，術(shù)后第 1、 2、 4 周傷口面積變化如表 1， 各時間段實驗組及對照組傷口面積減少的差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖 1 頰黏膜缺損模型及2 組愈合情況

表 1 2 組傷口面積變化比較

2.2 HE結(jié)果

術(shù)后1 周：實驗組上皮組織基本連續(xù)完整，基底膜不夠清晰，有炎性細(xì)胞浸潤；對照組上皮組織明顯有缺損不連續(xù)，炎性細(xì)胞較對照組顯著增多，組織疏松水腫。2 周：實驗組上皮完整，組織結(jié)構(gòu)清晰，基底層尚有炎性細(xì)胞浸潤，基底膜清晰，與正常頰黏膜結(jié)構(gòu)接近，對照組上皮連續(xù)但有炎性細(xì)胞較實驗組多。4 周實驗組及對照組均上皮結(jié)構(gòu)完整，就炎細(xì)胞浸潤情況，對照組較實驗組更明顯(圖 2)。

圖 2 2 組傷口口愈合過程中頰黏膜的組織學(xué)觀察(HE， ×40)

2.3 Masson染色結(jié)果

術(shù)后1 周，兩組膠原纖維沉積量均較少，但實驗組較對照組明顯多，但對照組及實驗組膠原纖維結(jié)合均不緊密，且排列較亂。術(shù)后2 周可見兩組膠原纖維數(shù)量較1 周時均有增多，實驗組膠原纖維結(jié)合緊密，較1 周時排列有序；對照組膠原纖維排列雜亂疏松。術(shù)后4 周可見，兩組膠原纖維數(shù)量均有增多，結(jié)合十分緊密，實驗組纖維粗大，排列方向有序；對照組纖維略欠佳，但較2 周組排列明顯。膠原纖維形成能力分析：在術(shù)后1、 2 周時，實驗組與對照組的膠原纖維平均光密度之間差異有顯著性(P<0.01)。術(shù)后4 周時，實驗組與對照組膠原纖維平均光密度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖 3，表 2)。

圖 3 2 組樣本Masson染色(×400)

表 2 2 組樣本膠原纖維平均吸光度比較

3 討 論

在本實驗中使用帶蒂頰脂墊修復(fù)新西蘭白兔頰黏膜缺損結(jié)果顯示：實驗組創(chuàng)面閉合時間更短，HE染色發(fā)現(xiàn)術(shù)后1 周對照組上皮仍有缺損，術(shù)后2 周兩組均完全上皮化，但對照組較實驗組炎癥反應(yīng)輕，Masson染色發(fā)現(xiàn)實驗組在術(shù)后膠原纖維沉積較對照組多，促進創(chuàng)面的愈合。造模術(shù)中在新西蘭白兔上頜后牙區(qū)下頜升支前緣處頰黏膜向后上方鈍性分離，發(fā)現(xiàn)兔頰脂墊為一顏色偏白的脂肪團塊，表面有包膜，周圍血管豐富，體積約為人類頰脂墊的1/4～1/5。人類頰脂墊體積約為10.0 mL，平均厚度約6.0 mm，平均質(zhì)量約9.3 g，可覆蓋10 cm2的面積，遂適合中小型的缺損[5]?；谄淞己玫慕馄饰恢茫辛己玫难?，且包膜豐富的血管網(wǎng)，因此具有較強的修復(fù)及抗感染能力，存活率較高，并發(fā)癥少,并且位置相鄰，避免二次傷害，術(shù)后較少見功能障礙、面部畸形等。

在本課題以往的研究及臨床工作中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用帶蒂頰脂墊修復(fù)口內(nèi)缺損上皮化的現(xiàn)象[6-7]，迄今為止，頰脂墊修復(fù)缺損后上皮細(xì)胞形成，這其中的相關(guān)機制和來源仍然沒有定論，就新的上皮組織來源而言，目前有3 種可能[8-9]：來源于周圍正常黏膜的爬行；來源于口腔黏膜上皮脫落種植；來源于頰脂墊瓣表面的被膜演變。實驗過程中發(fā)現(xiàn)，頰脂墊修復(fù)缺損加速了上皮化進程，并且在愈合初期促進了膠原纖維的沉積。一方面，頰脂墊富含脂肪干細(xì)胞(adipose stem cell,ASCs)，ASCs可以分化成包括骨、軟骨、脂肪、上皮細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞等[10]。有研究表明[11]，頰脂墊脂肪干細(xì)胞能夠表達(dá)典型的脂肪干細(xì)胞表面標(biāo)志物，相比皮下脂肪組織，其密度更大，且具有更強的成軟骨、成骨、成脂能力。脂肪干細(xì)胞可釋放的各種生長因子包括血管內(nèi)皮生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF )、肝細(xì)胞生長因子(HGF)和胰島素樣生長因子1(IGF-1)，通過旁分泌促進組織再生創(chuàng)面的愈合[12]。此外，ADSCs 可分泌HGF和VEGF 等血管生成因子，促進了創(chuàng)面生成血管，還有利于形成肉芽組織，加速皮膚創(chuàng)面愈合[13]。本研究發(fā)現(xiàn)使用頰脂墊修復(fù)后的創(chuàng)面炎性反應(yīng)輕，可能與ADSCs 促進IL-4、IL-10 等抗炎因子表達(dá)有關(guān)，其抑制 IL-1、IL-8、TNF-α 等促炎因子分泌來減輕炎癥反應(yīng)[14]。Masson染色發(fā)現(xiàn)在愈合早期頰脂墊修復(fù)組膠原纖維沉積更快，且排列整齊，這與Hu等[15]研究結(jié)果相似。此外Chai等[16]研究也證明ADSCs 條件培養(yǎng)基可降低Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白及α-SMA的表達(dá)，與ADSCs 條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)的瘢痕組織中膠原排列更薄、更整齊。源自脂肪干細(xì)胞的外泌體可刺激創(chuàng)面內(nèi)成纖維細(xì)胞增殖和遷移，優(yōu)化膠原沉積，進一步促進創(chuàng)面愈合。在傷口愈合的早期，外泌體增加了膠原蛋白Ⅰ和Ⅲ的產(chǎn)生，而在后期，外泌體可能會抑制膠原蛋白的表達(dá)以減少疤痕的形成[15,17]。另一方面,在口腔這個復(fù)雜的環(huán)境中,唾液也是重要的一部分，回顧既往相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)唾液對創(chuàng)面的愈合有促進作用[18]，在本研究中也發(fā)現(xiàn)實驗組及對照組在術(shù)后4 周均上皮化且未發(fā)生感染，其中唾液作為口腔中的重要成分在創(chuàng)面愈合過程中保持濕潤，且除水分之外還含有多種成分，如酵素、尿素、維生素 B、蛋白質(zhì)(黏蛋白、球蛋白)、有機物、氨基酸、硫氰酸鹽、各種離子和酶等,多種蛋白質(zhì)因子在抵抗感染過程中有重要作用[19]。此外，唾液中含有的EGF，它能夠促進細(xì)胞增殖分化,加速皮膚和黏膜創(chuàng)面愈合[20]。與對照組相比頰脂墊修復(fù)后上皮化速度更快，而ADSCs 還可直接分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞，增強血管結(jié)構(gòu)并促進創(chuàng)傷皮膚上皮化形成，這一過程中唾液是否有一定的誘導(dǎo)作用值得進一步探究。

本研究僅初步探討了帶蒂頰脂墊修復(fù)頰黏膜缺損修復(fù)效果，脂肪組織最終轉(zhuǎn)化為上皮，參與其中的脂肪干細(xì)胞以及唾液等重要成分的相關(guān)機制仍需進一步研究。經(jīng)過目前分析我們發(fā)現(xiàn)帶蒂頰脂墊良好的修復(fù)效果，這為臨床應(yīng)用提供更堅實的理論基礎(chǔ)。在本實驗中，有一定的缺陷，未來的研究則需進一步擴大樣本量，使得研究結(jié)果更具代表性。