鈦表面高強(qiáng)度仿生形貌涂層構(gòu)建及生物安全性評(píng)估

牛強(qiáng) 王瀟懿 張周陽(yáng) 寧小娜 郭維維 張羽博翰 呂前欣 王樂 劉富偉 張浚睿

骨結(jié)合效果是牙種植體遠(yuǎn)期成功率的重要決定因素[1]。天然骨組織是由納米級(jí)尺度的膠原纖維、礦物鹽結(jié)晶等逐步組裝成微米級(jí)尺度的骨小梁、哈佛式系統(tǒng)，進(jìn)而形成宏觀尺度的松質(zhì)骨、皮質(zhì)骨[2]。因此，僅從仿生學(xué)的角度，在種植體表面構(gòu)建具有微米級(jí)、納米級(jí)的梯度仿生形貌，將有助于促進(jìn)骨結(jié)合效果。

基于上述理念，多種表面形貌改性技術(shù)已應(yīng)運(yùn)而生，如噴砂、陽(yáng)極氧化、等離子沉積、水熱處理、激光蝕刻等，可構(gòu)建出納米管、突、刺、溝槽等多種形貌。研究報(bào)道，表面形貌改性可提升鈦及鈦合金表面親水性，減低骨組織剪切力，并有利于細(xì)胞粘附、成骨分化以促進(jìn)骨結(jié)合效果[3]。然而，臨床上牙種植體在植入與長(zhǎng)期應(yīng)用過(guò)程中，材料與周圍骨組織間界面將產(chǎn)生較大應(yīng)力，易造成材料破壞、涂層脫落。而脫落的材料顆粒將可能通過(guò)激活巨噬細(xì)胞炎癥小體等機(jī)制引發(fā)界面慢性炎癥，不利于新骨形成，并造成種植體溶骨性松動(dòng)。這種由涂層強(qiáng)度不足造成的生物安全性問(wèn)題成為制約表面改性技術(shù)臨床應(yīng)用的關(guān)鍵[4]。

本研究將通過(guò)聯(lián)用酸蝕、磁控濺射技術(shù)，旨在構(gòu)建一種兼顧涂層強(qiáng)度與生物安全性雙重要求的，微米級(jí)、納米級(jí)梯度仿生形貌涂層，以滿足臨床應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 涂層構(gòu)建及形態(tài)觀察

鈦片(? 15 mm×1 mm, 西安中邦生物鈦科技有限公司)；鈦酸鍶靶材(? 75 mm×10 mm，北京匯方圓科技有限公司)；丙酮、 無(wú)水乙醇(天津富宇化學(xué)試劑有限公司)； 去離子水、氫氟酸(HF，天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)。砂紙打磨，直至鈦片表面光如鏡面，得到光滑組鈦片。在此基礎(chǔ)上，將制備好的光滑鈦片浸泡于2.5%濃度氫氟酸中3 min，對(duì)表面進(jìn)行酸蝕，得到微米級(jí)形貌。隨后以鈦酸鍶為靶材通過(guò)磁控濺射技術(shù)(功率80 W，濺射時(shí)間7 200 s，基靶間距10 cm，室溫)在微米級(jí)形貌表面進(jìn)一步構(gòu)建納米粒形貌，形成微米級(jí)、納米級(jí)梯度仿生形貌。最后通過(guò)場(chǎng)發(fā)掃描電鏡(FE-SEM， S-4800，日立公司， 日本)對(duì)該表面進(jìn)行形貌觀察。

1.2 涂層強(qiáng)度檢測(cè)

采用納米劃痕試驗(yàn)對(duì)該新型涂層強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)照組選擇經(jīng)典形貌納米管，制備方法如下：微米級(jí)形貌制備如前，隨后在0.5% HF電解液中陽(yáng)極氧化處理30 min(電壓20 V，金屬鉑作為陰極)；處理完畢后，依次經(jīng)丙酮、無(wú)水乙醇、蒸餾水超聲振蕩清洗，烘干塑封，鈷-60照射消毒。

納米劃痕試驗(yàn)：將鈦片置于劃痕儀上，通過(guò)聲發(fā)射法檢測(cè)壓頭在不斷加力過(guò)程中涂層劃破或剝落時(shí)的臨界載荷，由此得到涂層與基體的臨界載荷，于掃描電鏡下觀察記錄。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8周齡雄性SD大鼠， 體重260～300 g(空軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)。

1.4 涂層生物安全性檢測(cè)

1.4.1 皮膚刺激與遲發(fā)性超敏試驗(yàn) 浸提液的制備：根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 16886.12-2017)中浸提液體積計(jì)算公式，以每個(gè)鈦片對(duì)應(yīng)1.178 mL PBS， 在(37±1) ℃， (24±2) h條件下完成浸提液制備。

皮膚刺激試驗(yàn)：SD大鼠10 只，分籠飼養(yǎng)，分為光滑鈦片組(對(duì)照組，n=5)和新型涂層組(實(shí)驗(yàn)組，n=5)，在同等條件下自由飲食，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。

根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 16886.10-2017)，大鼠背部備皮消毒后，在相應(yīng)皮膚部位放置2.5 cm×2.5 cm大小的貼敷片，將0.5 mL光滑鈦片或新型涂層浸提液滴到觀察部位貼敷片中，對(duì)照部位滴浸提溶劑(PBS)。用繃帶固定4 h后墨水標(biāo)記，除去敷貼片后1、 24、 48、 72 h記錄接觸部位情況。

遲發(fā)型超敏反應(yīng)：SD大鼠10 只，分為光滑鈦片組(對(duì)照組，n=5)和新型涂層組(實(shí)驗(yàn)組，n=5)，同等條件自由飲食，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。

誘導(dǎo)階段：將2.5 cm×2.5 cm大小的敷貼片浸透新型涂層浸提液，局部貼敷于動(dòng)物左上背部位，繃帶包扎， 6 h后除去包扎帶和敷貼片。 1 周中連續(xù)3 d重復(fù)該步驟，同法操作3 周。貼敷光滑鈦片浸提液組大鼠作為對(duì)照。

激發(fā)階段：最后一次誘導(dǎo)貼敷后14 d(±1 d)，分別用光滑鈦片或新型涂層發(fā)浸提液對(duì)對(duì)照動(dòng)物和試驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行激發(fā)，將2.5 cm×2.5 cm大小的敷貼片浸透浸提液，貼敷于每只動(dòng)物去毛的未試部位(誘導(dǎo)階段未貼敷部位)，包扎固定。6 h后除去固定器、包扎帶和貼敷片。激發(fā)24 h后，用溫水徹底清洗脫毛區(qū)，毛巾擦干后放回籠中，2 h后觀察動(dòng)物試驗(yàn)部位皮膚有無(wú)紅斑及水腫等，再過(guò)24 h(即激發(fā)后48 h)，再觀察一次并記錄。

1.4.2 全身毒性試驗(yàn) 根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 16886.11-2011)，SD雄性大鼠15 只，分籠飼養(yǎng)，分為正常健康組(空白組，n=5)，光滑鈦片組(對(duì)照組，n=5)和新型涂層組(實(shí)驗(yàn)組，n=5)，在同等條件下自由飲食，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。

從籠內(nèi)將大鼠取出，根據(jù)體表標(biāo)記識(shí)別動(dòng)物編號(hào)。用16#灌胃注射器抽取相應(yīng)組別浸提液3 mL，排空注射器內(nèi)的空氣，將灌胃針頭由大鼠左側(cè)口角，順著上顎后壁插入咽部，沿著平行于動(dòng)物的縱軸，把灌胃針頭插入胃部，穩(wěn)定推動(dòng)針芯，慢慢注入受試物。大鼠給藥后前3 d每天測(cè)量體重并記錄；給藥2 周后取材，取大鼠心、肝、脾、肺、腎組織固定包埋成蠟塊，行切片及HE染色，觀察評(píng)價(jià)各組織臟器病理表現(xiàn)。

1.4.3 溶血試驗(yàn) 根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 16886.4-2016)，采用正常大鼠外周血溶血實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)種植體血液相容性。首先取5 mL大鼠外周血1 500 r/min離心15 min，取下層紅細(xì)胞，用生理鹽水離心洗滌紅細(xì)胞3 次，隨后，用 PBS 溶液將紅細(xì)胞稀釋10 倍。然后，取 0.3 mL 稀釋后的紅細(xì)胞懸浮液，分別加入 1.2 mL 的 PBS(-)和 1.2 mL 的0.1% Triton X-100(破膜液，溶血率≈100%)作為陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。另外取光滑鈦片浸提液和新型涂層浸提液1.2 mL，分別加入0.3 mL稀釋后的紅細(xì)胞。2 h 后，1 500 r/min離心15 min，取上清液，通過(guò) UV-vis 分光光度計(jì)測(cè)試上層清液的吸光值。使用下面的公式計(jì)算紅細(xì)胞的溶血百分率：溶血率(100%)=[(樣本吸光值-陰性對(duì)照吸光值)/(陽(yáng)性對(duì)照吸光值-陰性對(duì)照吸光值)]×100%。

1.4.4 血清生化參數(shù)分析 選取空白組及實(shí)驗(yàn)組大鼠各10 只，通過(guò)眼球取血法取1 mL外周血6 000 r/min離心5 min,吸出上層血清，于西京醫(yī)院檢驗(yàn)科檢測(cè)血清ALT、AST、CK-MB及BUN水平，通過(guò)SPSS 20.0軟件統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

2.1 高強(qiáng)度仿生形貌涂層構(gòu)建

掃描電鏡結(jié)果顯示，通過(guò)聯(lián)用酸蝕、磁控濺射技術(shù)，可在光滑純鈦基底表面(圖 1)制備具有微米級(jí)、納米級(jí)梯度結(jié)構(gòu)的仿生形貌(圖 1)。其中， 1 000 倍下可見溝壑樣微米結(jié)構(gòu)； 30 000 倍下可見以圓頓的凸起為主納米結(jié)構(gòu)，均勻分布。

圖 1 高強(qiáng)度仿生形貌涂層構(gòu)建及觀察

2.2 涂層強(qiáng)度檢測(cè)

納米劃痕試驗(yàn)顯示，鈦表面經(jīng)典形貌納米管，在0～100 N逐漸加力的過(guò)程中(從左至右)，在28 N附近發(fā)生明顯的涂層斷裂、剝落現(xiàn)象(圖 2)。而新型高強(qiáng)度仿生形貌涂層在0～100 N逐漸加力的過(guò)程中，其形成劃痕較納米管組淺，表明該新型涂層表面硬度高，且僅在接近100 N處出現(xiàn)少量的涂層斷裂、剝落現(xiàn)象，表明該新型涂層與基底結(jié)合強(qiáng)度好，可以滿足臨床應(yīng)用需要(圖 2)。

圖 2 新型高強(qiáng)度仿生形貌涂層與經(jīng)典形貌納米管的涂層強(qiáng)度對(duì)比

2.3 生物安全性檢測(cè)

在大鼠背部所示相應(yīng)部位(圖 3A)，貼敷光滑鈦片(對(duì)照組)或新型涂層(實(shí)驗(yàn)組)浸提液14 d后，大體觀察可見，大鼠未出現(xiàn)皮膚刺激癥狀(圖 3B)；同時(shí)與對(duì)照組大鼠相比，實(shí)驗(yàn)組未出現(xiàn)遲發(fā)性超敏反應(yīng)(圖 3C)；進(jìn)行灌胃后，新型涂層浸提液組大鼠體重變化情況與光滑鈦片浸提液組無(wú)顯著差異(423.3±11.2 gvs. (429±10.07) g,P>0.05， 圖 3D)；通過(guò)HE染色檢測(cè)新型涂層浸提液對(duì)大鼠全身重要臟器的影響，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組大鼠與健康對(duì)照大鼠無(wú)明顯差異，具體表現(xiàn)為：心肌排列整齊，無(wú)壞死及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等；肝小葉結(jié)構(gòu)清晰完整，肝索排列整齊，肝細(xì)胞均勻致密，形態(tài)正常且無(wú)壞死,無(wú)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象；脾臟組織結(jié)構(gòu)正常，紅、白髓分界清晰，脾小結(jié)較多，大小較為一致；肺臟組織完整，無(wú)水腫、出血、透明膜形成及上皮細(xì)胞損傷等；腎小球體積正常，系膜細(xì)胞和上皮細(xì)胞無(wú)壞死、水腫，無(wú)透明管型等；表明該新型涂層浸提液不會(huì)對(duì)心、肝、脾、肺、腎這些重要臟器產(chǎn)生毒性作用(圖 3F)，溶血試驗(yàn)是植入材料必須檢測(cè)的指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組溶血率(3.51%±1.04%)與正常組(2.90%±0.65%)間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(圖 3E)。血清生化分析結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組大鼠較正常組大鼠ALT〔(45.00±2.74) U/Lvs.(48.89±19.14) U/L〕、 AST〔(92.50±4.98) U/Lvs.(104.11±31.52) U/L〕、 BUN〔(7.74±0.45) mmol/Lvs.(6.00±0.60) mmol/L〕及CK-MB〔(408.80±42.17) U/Lvs.(516.44±33.24) U/L〕水平均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表 1)。

表 1 血清生化檢測(cè)

3 討 論

自骨結(jié)合理論提出開始，基于鈦及鈦合金等生物材料的替代重建技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于口腔缺牙種植修復(fù)、贗復(fù)體固定、骨缺損修復(fù)等多種領(lǐng)域[5]。僅以口腔種植為例，我國(guó)種植牙已超過(guò)200 萬(wàn)顆，成為全球種植牙增速最快的市場(chǎng)[6]。骨結(jié)合效果是牙種植體長(zhǎng)期行使功能的重要決定因素，如何又快、又好的實(shí)現(xiàn)骨結(jié)合是生物植入材料領(lǐng)域關(guān)心的重要問(wèn)題。

天然骨組織在微觀上具有微米級(jí)、納米級(jí)的梯度結(jié)構(gòu)，基于仿生學(xué)理念，在種植體表面構(gòu)建出近似天然骨組織微觀梯度形貌將有助于骨結(jié)合效果[7-8]。其中，微米級(jí)形貌在尺度上與天然骨組織中骨小梁、哈佛式系統(tǒng)等相近，可以有效增加種植體與骨組織的接觸面積，使二者形成機(jī)械嵌合，并降低界面處骨組織在咀嚼運(yùn)動(dòng)時(shí)受到的剪切力，從而促進(jìn)種植體穩(wěn)定[9-11]。同時(shí)，微米級(jí)形貌也可改善植入材料親水性，吸引蛋白粘附以促進(jìn)骨結(jié)合。納米級(jí)形貌在尺度上與天然骨組織中膠原纖維、礦物鹽顆粒等細(xì)胞外基質(zhì)成分相近[12]。研究顯示，納米級(jí)形貌在對(duì)細(xì)胞影響上較微米級(jí)形貌更直接，可顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等成骨相關(guān)細(xì)胞的粘附，并通過(guò)整合素介導(dǎo)的細(xì)胞骨架力學(xué)傳遞通路，或黏著癍激酶相關(guān)通路促進(jìn)細(xì)胞增殖及分化[13-16]。同時(shí)，隨著骨免疫學(xué)的發(fā)展，納米級(jí)形貌對(duì)巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞及相關(guān)炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用也越來(lái)越受到人們重視。由此研究者開發(fā)了多種技術(shù)以制備上述形貌。

現(xiàn)階段，能夠在以鈦及鈦合金為代表的金屬植入材料表面構(gòu)建微米級(jí)形貌的主要方法有噴砂、酸蝕等，這也是目前臨床種植體主要的形貌制備方法[17]。而在納米級(jí)形貌構(gòu)建上，陽(yáng)極氧化、等離子沉積、水熱處理等是常用方法，可以構(gòu)建出納米管、突、刺等多種形貌，具有良好的促成骨效果。然而臨床上牙種植體在植入與長(zhǎng)期應(yīng)用過(guò)程中，材料與周圍骨組織間界面將產(chǎn)生較大應(yīng)力，上述工藝方法制備涂層的強(qiáng)度難以滿足該要求，涂層易破壞、脫落。巨噬細(xì)胞在吞噬這些脫落的涂層顆粒時(shí)將大量釋放促炎因子，造成界面過(guò)度炎癥反應(yīng)，不利于新骨形成，甚至破壞周圍骨質(zhì)。同時(shí)多轉(zhuǎn)為慢性炎癥，造成溶骨性松動(dòng)，是種植體遠(yuǎn)期失敗的重要因素[18-19]。近年來(lái)，激光蝕刻等新型技術(shù)被引入金屬材料形貌構(gòu)建上，具有強(qiáng)度高、可控性強(qiáng)、精細(xì)度高等優(yōu)勢(shì)，但此類技術(shù)制備成本高昂，不利于產(chǎn)業(yè)化推廣[20]。

為解決上述問(wèn)題，本研究通過(guò)聯(lián)用酸蝕、磁控濺射技術(shù)，在鈦表面構(gòu)建了一種兼顧涂層強(qiáng)度與生物安全性雙重要求的，具有微米級(jí)、納米級(jí)梯度仿生形貌的新型涂層。形成的納米結(jié)構(gòu)主要為圓頓的凸起，均一、穩(wěn)定、可控性高。與經(jīng)典的納米形貌，納米管相比，新型涂層具有顯著的表面硬度及界面結(jié)合強(qiáng)度優(yōu)勢(shì)，能夠滿足臨床應(yīng)用需求。同時(shí)，基于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)該新型涂層的生物安全性進(jìn)行系統(tǒng)檢測(cè)，證實(shí)其在體生物安全性高，與純鈦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，有望快速轉(zhuǎn)化。此外，該涂層由于選擇了鈦酸鍶作為磁控濺射靶材，其表面中也添加入了鍶元素，鑒于雷尼酸鍶等鍶鹽類藥物在骨質(zhì)疏松等疾病中的積極治療作用，該新型涂層也勢(shì)必具有一定的藥物促成骨效果。

綜上所述，本研究構(gòu)建了一種微米級(jí)、納米級(jí)梯度仿生形貌的新型涂層，該涂層具有高強(qiáng)度、高生物安全性的特點(diǎn)，具有良好的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用前景。