機(jī)能實(shí)驗(yàn)教學(xué)中一氧化碳致小鼠缺氧裝置的改進(jìn)

董曉敏，孫笑語(yǔ)，童學(xué)紅，崔艷秋，李利生

（首都醫(yī)科大學(xué)，北京 100069）

很多高等院校以及科研機(jī)構(gòu)需要使用一氧化碳（CO）氣體進(jìn)行專業(yè)實(shí)驗(yàn)，尤其是醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、預(yù)防醫(yī)學(xué)、毒理學(xué)以及環(huán)境科學(xué)等專業(yè)。在醫(yī)學(xué)機(jī)能學(xué)“缺氧與病因?qū)W觀察”實(shí)驗(yàn)中，目前普遍采用傳統(tǒng)CO氣體中毒裝置，該裝置效果可靠，但實(shí)際操作不方便，一次只能復(fù)制一只ICR小鼠動(dòng)物模型，消耗CO氣體較多，對(duì)環(huán)境污染較大[1-2]。

本組成員長(zhǎng)期從事實(shí)驗(yàn)開(kāi)發(fā)及輔助工作，對(duì)該裝置的不足進(jìn)行了分析，擬設(shè)計(jì)一種新型實(shí)驗(yàn)裝置。通過(guò)新型實(shí)驗(yàn)裝置，預(yù)期能簡(jiǎn)化操作過(guò)程，一次復(fù)制多只CO致ICR小鼠缺氧模型，一次允許多個(gè)實(shí)驗(yàn)小組共同實(shí)驗(yàn)，并有望實(shí)現(xiàn)縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間、減少有毒氣體消耗及環(huán)境污染、節(jié)約實(shí)驗(yàn)耗材等目的?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

ICR小鼠24只，5周齡，在標(biāo)準(zhǔn)ICR小鼠籠內(nèi)飼養(yǎng)，給予標(biāo)準(zhǔn)食物和水，飼養(yǎng)溫度（22.00±2.00）℃。動(dòng)物由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，醫(yī)學(xué)動(dòng)物合格證書號(hào)為S CXK（京2012—0001）。

1.2 設(shè)計(jì)改進(jìn)實(shí)驗(yàn)裝置

改進(jìn)后的實(shí)驗(yàn)裝置見(jiàn)圖1，包括外桶、內(nèi)桶、密封蓋。外桶是立方體，外桶內(nèi)4個(gè)角落距底部處按有3厘米高支柱，用于支撐內(nèi)桶，下層可放置蒸餾水；外桶右側(cè)壁下部嵌入進(jìn)氣管，進(jìn)氣管一端與下層液體相通，另一端通過(guò)流量調(diào)量閥與CO氣瓶相連接，外桶右側(cè)壁上部嵌入出氣管。內(nèi)桶被置于外桶上層，其內(nèi)部被十字形隔板分為4個(gè)獨(dú)立的空間，各側(cè)面有一個(gè)約2厘米的圓孔；底部有多個(gè)小孔。密封蓋下方設(shè)有密封圈，封閉外桶。

圖1 改進(jìn)后的實(shí)驗(yàn)裝置

1.3 方法

將24 只ICR 小鼠分成改進(jìn)組和傳統(tǒng)組，分別進(jìn)行CO 致ICR小鼠缺氧造模。改進(jìn)組將4 只ICR小鼠放入改進(jìn)后的實(shí)驗(yàn) 裝置同時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，12 只ICR小鼠分3 次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。傳統(tǒng)組將 1 只ICR 小鼠放入傳統(tǒng)裝置的廣口瓶中，每次1 只ICR 小鼠進(jìn) 行實(shí)驗(yàn)。兩組實(shí)驗(yàn)中CO通氣速率為40 氣泡/分。

1.4 評(píng)價(jià)指標(biāo)

統(tǒng)計(jì)兩組造模成功率、平均造模時(shí)間、CO 氣體消耗量。造 模成功的標(biāo)準(zhǔn)：ICR 小鼠均死亡，出現(xiàn)皮膚黏膜櫻桃紅、臟器與 血液顏色鮮紅色，認(rèn)定造模成功。兩組造模時(shí)間為每只小鼠存 活時(shí)間。傳統(tǒng)組消耗氣體量計(jì)算方法：消耗氣體量（氣泡）=造模 時(shí)間（秒）×40/60。改進(jìn)組消耗氣體量計(jì)算方法：無(wú)法單獨(dú)計(jì)算 每只ICR小鼠消耗的氣體量，只能根據(jù)總的氣體消耗量及每只 ICR 小鼠的造模時(shí)間進(jìn)行計(jì)算。比如，1 號(hào)ICR 小鼠造模時(shí)間 190 秒，總造模時(shí)間為2 163 秒，占總造模時(shí)間的比例為190/ 2 163，再乘以實(shí)際總的氣體消耗量，即這只ICR 小鼠實(shí)際的氣體消耗量，將這一新的指標(biāo)定義為“矯正消耗氣體”。按照該計(jì) 算方法，12 只ICR 小鼠的矯正消耗氣體相加即為總的造模時(shí) 間（秒）×40/60。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組造模成功率以百分比表示，組間比較用卡方檢驗(yàn)；平均造模時(shí)間以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)；CO氣體消耗量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 兩組造模成功率比較

改進(jìn)組ICR小鼠體重為（18.60±0.45）克，傳統(tǒng)組ICR小鼠體重為（18.56±0.34）克，兩組比較無(wú)顯著性差異（見(jiàn)表1）。CO中毒實(shí)驗(yàn)中所有24只ICR小鼠均死亡，出現(xiàn)皮膚黏膜櫻桃紅、臟器與血液顏色為鮮紅色，表明兩組造模成功率均為100%，組間比較無(wú)顯著性差異。

2.2 兩組平均造模時(shí)間比較

改進(jìn)組總操作時(shí)間11.08分鐘，平均造模時(shí)間（180.25±41.77）秒；傳統(tǒng)組總操作時(shí)間22.73分鐘，平均造模時(shí)間（113.66±33.50）秒。改進(jìn)組平均造模時(shí)間長(zhǎng)于傳統(tǒng)組，組間比較差異有顯著性（見(jiàn)表1）。

2.3 兩組CO氣體消耗量比較

改進(jìn)組平均消耗氣體量（36.90±8.55）氣泡，傳統(tǒng)組平均消耗氣體量（75.77±22.33）氣泡，改進(jìn)組平均消耗氣體量明顯少于傳統(tǒng)組，組間比較差異有顯著性（見(jiàn)表1）。

表1 兩組ICR小鼠體重、平均造模時(shí)間、平均消耗氣體量比較（±s）

表1 兩組ICR小鼠體重、平均造模時(shí)間、平均消耗氣體量比較（±s）

組別 體重（克）18.60±0.45 18.56±0.34 0.724改進(jìn)組傳統(tǒng)組P值平均造模時(shí)間（秒）180.25±41.77 113.66±33.50 0.000平均消耗氣體量（氣泡）36.90±8.55 75.77±22.33 0.000

3 討論

CO為無(wú)色、無(wú)味、無(wú)刺激性氣體。大氣中CO含量甚微，僅有0.04 ppm，當(dāng)含量超過(guò)12.5%時(shí)有爆炸的危險(xiǎn)，當(dāng)吸入氣中CO含量超過(guò)5×10-4（即0.05%）或30m g/m3時(shí)，就可使人中毒[3]。急性CO中毒時(shí)，吸入的CO進(jìn)入肺泡，通過(guò)彌散與血液中的血紅蛋白結(jié)合，形成比較穩(wěn)定的碳氧血紅蛋白，CO與血紅蛋白的親和力比氧與血紅蛋白的親和力大240倍（37.0℃時(shí)）?？諝庵械腃O濃度越高，接觸時(shí)間越長(zhǎng)，血液中形成的碳氧血紅蛋白就越多。碳氧血紅蛋白既不能攜帶氧，又不易解離，其解離速度是氧合血紅蛋白解離速度的1/3 600，因此阻礙了氧的運(yùn)輸，造成血液性缺氧[4-5]。急性CO中毒可致全身缺氧，腦缺氧癥狀最為突出，可出現(xiàn)腦梗死、遲發(fā)性腦病等并發(fā)癥[6-8]。心肌損傷也是中、重度CO中毒常見(jiàn)的臨床并發(fā)癥，可評(píng)估患者死亡率[9-10]。醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中ICR小鼠是復(fù)制病理模型較常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[11-12]。

3.1 改進(jìn)裝置能觀察ICR小鼠呼吸變化，提高實(shí)驗(yàn)教學(xué)效率

目前，醫(yī)學(xué)機(jī)能實(shí)驗(yàn)教學(xué)中有用兩個(gè)廣口瓶經(jīng)橡皮塞和硅膠管連接組成傳統(tǒng)裝置，將ICR小鼠放入廣口瓶中吸入CO氣體。一個(gè)廣口瓶盛有蒸餾水用來(lái)計(jì)算氣泡，另一個(gè)廣口瓶?jī)?nèi)放1只ICR小鼠，通氣后ICR小鼠快速中毒并死亡。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，一個(gè)班級(jí)學(xué)生需要做4組實(shí)驗(yàn)，每組1只ICR小鼠，依次進(jìn)行。此實(shí)驗(yàn)裝置1次只能復(fù)制1只ICR小鼠動(dòng)物模型，ICR小鼠死亡較快不利于觀察呼吸變換指標(biāo)，同時(shí)廣口瓶為玻璃材質(zhì)易破損影響實(shí)驗(yàn)，故實(shí)驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)中這種傳統(tǒng)裝置使得ICR小鼠迅速出現(xiàn)躁狂蹦跳后四肢癱軟甚至大小便失禁，平均造模時(shí)間（113.66±33.50）秒，所以ICR小鼠死亡時(shí)間太快，未出現(xiàn)呼吸代償即死亡，不利于觀察ICR小鼠的呼吸變化。針對(duì)該裝置的不足，我們?cè)O(shè)計(jì)了一種新型實(shí)驗(yàn)教學(xué)裝置——密閉桶，分為外桶、內(nèi)桶與密封蓋。內(nèi)桶設(shè)有4個(gè)隔斷，4只ICR小鼠同時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。ICR小鼠先出現(xiàn)興奮，呼吸急促，爬動(dòng)頻繁，之后再出現(xiàn)躁狂，最后四肢癱軟，大小便失禁死亡。改進(jìn)組平均造模時(shí)間（180.25±41.77）秒，ICR小鼠死亡時(shí)間延長(zhǎng)，可出現(xiàn)呼吸代償，有利于觀察ICR小鼠呼吸變化。實(shí)驗(yàn)中兩組ICR小鼠均死亡，出現(xiàn)皮膚黏膜櫻桃紅、臟器與血液顏色鮮紅色，造模成功率均為100%，說(shuō)明改進(jìn)組能夠成功復(fù)制CO中毒模型。改進(jìn)組總操作時(shí)間11.08分鐘，傳統(tǒng)組總操作時(shí)間22.73分鐘，改進(jìn)組總操作時(shí)間減少，提高了實(shí)驗(yàn)教學(xué)效率。

3.2 改進(jìn)裝置能減少有毒氣體使用，保證實(shí)驗(yàn)教學(xué)的安全性

傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)裝置1次復(fù)制1只ICR小鼠動(dòng)物模型，實(shí)驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)，每只ICR小鼠消耗氣體量為（75.77±22.33）氣泡，消耗的CO氣體較多，對(duì)環(huán)境污染較大。改進(jìn)組中4只ICR小鼠同時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，根據(jù)總的氣體消耗量及每只ICR小鼠的造模時(shí)間計(jì)算“矯正消耗氣體”，每只ICR小鼠消耗氣體量為（36.90±8.55）氣泡。改進(jìn)組消耗氣體量明顯少于傳統(tǒng)組，說(shuō)明改進(jìn)裝置能減少有毒氣體的使用，減少學(xué)生有毒氣體暴露時(shí)間，保證實(shí)驗(yàn)教學(xué)的安全性。

總之，實(shí)踐證明，改進(jìn)裝置用于機(jī)能實(shí)驗(yàn)教學(xué)，有利于觀察小鼠的呼吸變化，提高實(shí)驗(yàn)效率，減少有毒氣體使用量，保證實(shí)驗(yàn)教學(xué)的安全性。另外，此裝置也可向密封桶內(nèi)通氮?dú)鈴?fù)制動(dòng)物低氧模型。但是也有不足之處，如不能監(jiān)測(cè)密封桶內(nèi)CO氣體與氧氣濃度，需進(jìn)一步完善。