添加釀酒酵母的切達(dá)干酪風(fēng)味研究

田詩宇,范婉寧,王芳

1(北京農(nóng)學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院, 食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室,農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及 農(nóng)殘安全檢測(cè)與控制北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京,102206) 2(魯東大學(xué) 食品工程學(xué)院,山東 煙臺(tái),264025)

風(fēng)味是評(píng)價(jià)干酪品質(zhì)最重要的指標(biāo)之一[1]。輔助發(fā)酵劑是一類可以提高干酪風(fēng)味或加快干酪成熟的微生物制劑[2],對(duì)于改善干酪的風(fēng)味具有重要意義[3]。目前常見的輔助發(fā)酵劑多為非發(fā)酵劑乳酸菌[4]。某些酵母菌可以作為輔助發(fā)酵劑對(duì)成熟過程中干酪的風(fēng)味形成產(chǎn)生積極影響[5-7],如乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)、發(fā)酵畢赤酵母(Pichiafermentans)、漢遜德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)等。

釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)是藍(lán)紋干酪、卡門貝爾干酪等干酪中較為常見的酵母菌[8]。HANSEN等[9]將釀酒酵母FB7用于藍(lán)紋干酪中,發(fā)現(xiàn)釀酒酵母FB7能夠促進(jìn)青霉菌的生長(zhǎng)、加速成熟過程中蛋白質(zhì)的分解、改善干酪的風(fēng)味。S?RENSEN等[10]在干酪模型中添加釀酒酵母D7能夠顯著增加干酪中酯類化合物的含量。

切達(dá)干酪是世界上銷量最大的干酪品種之一,成熟期長(zhǎng),是研究外源物質(zhì)對(duì)干酪成熟過程中風(fēng)味影響的最佳模型之一[11]。在前期研究中,我們采用單因素和正交實(shí)驗(yàn),以感官評(píng)價(jià)和干酪產(chǎn)量為主要評(píng)定指標(biāo),優(yōu)化了添加釀酒酵母的切達(dá)干酪的加工工藝。在此基礎(chǔ)上,本研究選定了3種加工工藝制作添加釀酒酵母的切達(dá)干酪,并通過頂空固相微萃取和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)確定產(chǎn)品中揮發(fā)性風(fēng)味化合物的組成,通過感官評(píng)價(jià)方法評(píng)定消費(fèi)者對(duì)產(chǎn)品的接受度,通過聚類分析探究干酪的揮發(fā)性風(fēng)味化合物與成熟期之間的關(guān)系,為新型風(fēng)味干酪的開發(fā)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛋白質(zhì)含量為2.97%～3.05%,脂肪含量為3.71%～3.94%,抗生素檢測(cè)為陰性的新鮮牛乳,蒙牛乳業(yè)(北京)有限責(zé)任公司；蔗糖,廣州福正東海食品有限公司；活性干釀酒酵母,安琪酵母股份有限公司；CHY-MAX powder Extra NB凝乳酶、R-704直投式干酪發(fā)酵劑,科漢森(中國(guó))有限公司。

CaCl2、NaCl等均為分析純,北京化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

DK-8B水浴鍋,中國(guó)精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；干酪槽和干酪壓榨器,實(shí)驗(yàn)室自制；DSHZ-300A水浴恒溫振蕩器,蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；ME204分析天平,梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司；CJ78-1磁力攪拌器,常州市金壇大地自動(dòng)化儀器廠；PHB-4精密酸度計(jì),上海儀電科學(xué)儀器有限公司；7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)機(jī),美國(guó)Agilent公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 干酪制作工藝

添加蔗糖的原料乳于90 ℃加熱滅菌15 min,然后冷卻至23 ℃,接種0.2 g/L釀酒酵母發(fā)酵72 h。酒精發(fā)酵結(jié)束后升溫至32 ℃,接種干酪發(fā)酵劑發(fā)酵30 min,加入CaCl2和凝乳酶進(jìn)行凝乳,到達(dá)凝乳終點(diǎn)后用干酪刀切割凝塊排出乳清,以5 min/℃的速度勻速升溫至39 ℃并進(jìn)行堆疊。當(dāng)pH下降至5.5時(shí)將凝塊進(jìn)行鹽漬、壓榨,壓榨壓力為120 kg,時(shí)間為12 h,真空包裝,并在4 ℃下成熟90 d,分別于第1、30、60、90天取樣分析。

KY組(正交實(shí)驗(yàn)中以感官評(píng)分為指標(biāo)優(yōu)化得到的理論最優(yōu)干酪)：蔗糖添加量50 g/L,干酪發(fā)酵劑添加量0.02 g/L,凝乳酶添加量0.1 g/L；KH組(正交實(shí)驗(yàn)中感官評(píng)分最高的干酪)：蔗糖添加量50 g/L,干酪發(fā)酵劑添加量0.02 g/L,凝乳酶添加量0.2 g/L；KC組(正交實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)量最高的干酪)：蔗糖添加量40 g/L,干酪發(fā)酵劑添加量0.02 g/L,凝乳酶添加量0.1 g/L。

1.3.2 頂空固相微萃取和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

稱取5 g切碎的干酪樣品于20 mL頂空玻璃瓶中,密封并在50 ℃平衡10 min。插入頂空微萃取針吸附40 min,將吸附后萃取頭插入氣質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)樣口,250 ℃下解吸5 min。色譜條件：DB-WAX毛細(xì)管柱(30.0 m×250 μm×0.25 μm),起始溫度35 ℃保持2 min,3 ℃/min升溫至150 ℃,再以10 ℃/min升溫至230 ℃保持5 min,載氣為He,流速為1.2 mL/min。質(zhì)譜條件：電離方式為電子電離(electronic ionization,EI),電子能量70 eV,掃描范圍為12～550 amu,離子源溫度為230 ℃,四極桿溫度為150 ℃,界面溫度為280 ℃。

1.3.3 感官評(píng)價(jià)

參照BIAGIOTTI等[12]的方法。由10名來自北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院具有干酪品嘗經(jīng)驗(yàn)的品鑒員(5男5女,年齡20～35歲)對(duì)成熟1和90 d的干酪樣品進(jìn)行感官評(píng)價(jià),從外觀(25分)、口感(25分)、氣味(25分)、滋味(25分)4個(gè)方面進(jìn)行打分,總分100分,以10人平均分作為干酪感官得分的最終值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有樣品均重復(fù)測(cè)定3次。方差分析借助SPSS 23.0完成；圖表借助Origin 2018完成；熱圖借助Heml完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 揮發(fā)性風(fēng)味化合物

表1～表3分別是KY、KH、KC三組干酪成熟1、30、60、90 d揮發(fā)性風(fēng)味化合物的變化。3組干酪成熟過程中揮發(fā)性風(fēng)味化合物的種類和含量發(fā)生顯著性變化(P<0.05)。隨著干酪成熟時(shí)間的延長(zhǎng),3組干酪的揮發(fā)性風(fēng)味化合物的種類都呈現(xiàn)增加趨勢(shì)：KY、KH、KC三組干酪在成熟1 d分別檢測(cè)到揮發(fā)性風(fēng)味化合物13、13、14種,在成熟90 d分別檢測(cè)到揮發(fā)性風(fēng)味化合物19、21、23種。3組干酪成熟過程中,KY、KH兩組揮發(fā)性風(fēng)味化合物的含量基本呈現(xiàn)增加趨勢(shì)(P<0.05),而KC組則基本呈現(xiàn)降低趨勢(shì)(P<0.05)。在同一成熟時(shí)間,3組干酪中揮發(fā)性風(fēng)味化合物的種類和含量存在顯著性差異(P<0.05)。在3組干酪中都含有且含量較高的揮發(fā)性風(fēng)味化合物包括乙醇、異戊醇、苯乙醇、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙基9-癸烯酸酯、苯乙烯等。3組干酪中不同種類風(fēng)味物質(zhì)的分布有一定的相似性,含量最高的是醇類和酯類。KY、KH兩組揮發(fā)性風(fēng)味化合物的種類和含量與KC組差異顯著(P<0.05),揮發(fā)性風(fēng)味化合物的含量顯著高于KC組(P<0.05)。

醇類化合物主要通過乳糖代謝、氨基酸代謝等生化反應(yīng)生成[13]。與傳統(tǒng)工藝制作的干酪不同,3組干酪的加工過程中添加了釀酒酵母,因此釀酒酵母的無氧代謝也是醇類化合物的重要生成途徑。3組干酪在所有成熟期內(nèi)均檢測(cè)到乙醇、異戊醇和苯乙醇,其中乙醇與酒的氣味有關(guān)；異戊醇被認(rèn)為是干酪的主要香氣之一,提供了一種甜味,與水果味和果渣味有關(guān)[14]；苯乙醇是苯丙氨酸在酵母菌的代謝作用下形成的,與玫瑰香氣有關(guān)[15]。隨著干酪成熟時(shí)間的延長(zhǎng),KY、KH兩組中乙醇、異戊醇和苯乙醇含量顯著增加(P<0.05)；KC組中乙醇和苯乙醇含量顯著降低(P<0.05),異戊醇則呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。3組干酪的加工工藝顯示KY、KH兩組中蔗糖添加量高于KC組,導(dǎo)致前兩者中釀酒酵母的數(shù)量高于KC組(結(jié)果未顯示),可能是成熟90 d時(shí)KY、KH兩組中醇類化合物含量顯著高于KC組的主要原因。

表1 KY組干酪成熟過程中揮發(fā)性風(fēng)味化合物的變化(峰面積×106)Table 1 Changes in volatile flavor substances of KY during ripening (peak area×106)

表2 KH組干酪成熟過程中揮發(fā)性風(fēng)味化合物的變化(峰面積×106)Table 2 Changes in volatile flavor substances of KH during ripening (peak area×106)

續(xù)表2

表3 KC組干酪成熟過程中揮發(fā)性風(fēng)味化合物的變化(峰面積×106)Table 3 Changes in volatile flavor substances of KC during ripening (peak area×106)

酸類化合物主要來源于干酪成熟過程中的脂肪降解、蛋白質(zhì)水解和乳糖發(fā)酵。3組干酪中都存在的酸類化合物包括辛酸、正癸酸和棕櫚酸,且都存在于成熟后期。辛酸與微弱的水果酸、油脂酸敗的氣味有關(guān),僅存在于KH組中的己酸與羊乳氣息、腐臭味、汗氣和油脂味有關(guān)[16],對(duì)干酪的風(fēng)味有不利影響。

酮類化合物多由不飽和脂肪酸氧化、熱降解、氨基酸降解和微生物代謝產(chǎn)生。干酪中酮類化合物的含量較低,但是它們具有較低的感知閾值和典型的氣味,是干酪揮發(fā)性風(fēng)味化合物的來源之一。在3組干酪的不同成熟期均能檢測(cè)到2-壬酮,2-壬酮是3種干酪中含量最高的酮類化合物,與干酪的花香味、水果味、桃子味有關(guān)。在成熟過程中,KY、KH兩組中2-壬酮含量顯著增加(P<0.05),KC組中2-壬酮含量顯著降低(P<0.05)。除此之外,在3組干酪成熟后期還檢測(cè)到少量的2-十一烷酮和2-十三烷酮,其中2-十一烷酮與脂肪和黃油的香味有關(guān),2-十三烷酮與蠟香、脂香、乳品和椰子香氣有關(guān),3種酮類物質(zhì)均賦予干酪積極的風(fēng)味。

酯類化合物主要由酸和醇的酯化反應(yīng)及氨基酸代謝產(chǎn)生。酯類化合物與干酪的花香味、水果味和甜味有關(guān),還可以削弱脂肪酸產(chǎn)生的刺激味和苦味[17],對(duì)干酪風(fēng)味具有重要作用。在3組干酪不同成熟期均檢測(cè)到的酯類化合物有乙酸異戊酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯和乙基9-癸烯酸酯,主要以乙酯類為主,乙酯類對(duì)干酪香氣影響最大。已有研究報(bào)道切達(dá)干酪中關(guān)鍵的酯包括己酸乙酯和辛酸乙酯[18]。己酸乙酯與橘子風(fēng)味有關(guān)[19],對(duì)干酪的風(fēng)味有積極影響。辛酸乙酯可以使干酪散發(fā)出一種令人愉快的、新鮮的、類似丁香的甜味。在成熟過程中,KY、KH兩組中己酸乙酯和辛酸乙酯的含量均顯著增加(P<0.05),而KC組中這兩種物質(zhì)的含量則顯著降低(P<0.05)。在KY、KH兩組中,隨著成熟時(shí)間的增加,酯類化合物的含量也顯著增加(P<0.05)。研究表明乙醇可能是一些干酪中酯合成的限制因素[20-21],因此高濃度的乙醇會(huì)增加干酪中酯類化合物的含量。這與本研究中具有高濃度乙醇的KY、KH兩組中酯類化合物含量高的結(jié)果是一致的。相似的現(xiàn)象在其他研究中也有報(bào)道[10]。

除了種類和含量較多的醇類、酸類、酮類和酯類以外,干酪中還檢測(cè)出苯乙烯和苯乙醛。在3組干酪中均檢測(cè)出的苯乙烯具有橡膠味,對(duì)干酪的風(fēng)味有消極影響。醛是干酪中不穩(wěn)定的中間化合物,性質(zhì)較為活潑,很容易進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為醇或酯[22],在KC、KY兩組檢測(cè)到少量苯乙醛的存在,苯乙醛呈強(qiáng)烈的風(fēng)信子香氣,在低濃度時(shí)與杏仁味、櫻桃味有關(guān),對(duì)切達(dá)干酪的風(fēng)味具有很好的修飾作用。

2.2 揮發(fā)性風(fēng)味化合物聚類分析

圖1為3組干酪成熟過程中揮發(fā)性風(fēng)味化合物聚類分析熱圖。3組干酪中揮發(fā)性風(fēng)味化合物的聚類情況在成熟前期和后期具有顯著差異。

Alcohol 1-乙醇；Alcohol 2-異戊醇；Alcohol 3-正辛醇；Alcohol 4-苯乙醇；Acid 1-庚酸；Acid 2-己酸；Acid 3-辛酸；Acid 4-正壬酸；Acid 5-正癸酸；Acid 6-棕櫚酸；Acid 7-硬脂酸；Ketone 1-2-壬酮；Ketone 2-2-十一烷酮；Ketone 3- 2-十三烷酮；Ester 1-乙酸乙酯；Ester 2-甲酸異戊酯；Ester 3-丁酸乙酯；Ester 4-乙酸異戊酯；Ester 5-己酸乙酯；Ester 6-庚酸乙酯；Ester 7-辛酸甲酯；Ester 8-辛酸乙酯；Ester 9-壬酸乙酯；Ester 10-乙基9-癸烯酸酯；Ester 11-辛酸異丁酯；Ester 12-癸酸乙酯；Ester 13-月桂酸異戊酯；Ester 14-辛酸異戊酯；Ester 15-月桂酸乙酯；Ester 16-癸酸異戊酯；Ester 17-十三酸乙酯；Ester 18-十四酸乙酯；Ester 19-十六酸乙酯；Alkene 1-苯乙烯；Aldehyde 1-苯乙醛；KY1、KY30、KY60、KY90：KY組成熟1、30、60、90 d樣品；KH1、KH30、KH60、KH90：KH組成熟1、30、60、90 d樣品；KC1、KC30、KC60、KC90：KC組成熟1、30、60、90 d樣品圖1 干酪成熟過程中揮發(fā)性風(fēng)味化合物聚類分析熱圖Fig.1 Heat map of cluster analysis of volatile flavor compounds in cheeses during ripening

在成熟前期,KY1(KY組成熟1 d)和KY30可歸為一類；KC1和KC30可歸為一類,二者又可與KH1歸為一類,并進(jìn)一步與KH30歸為一類,表明成熟前期KY組與KH、KC兩組的揮發(fā)性風(fēng)味化合物存在顯著差異。在成熟后期,KY60和KY90可歸為一類,二者又可與KH60歸為一類,并進(jìn)一步與KH90歸為一類；KC60與成熟前期的KC組的揮發(fā)性風(fēng)味化合物較為相似,而KC90與其他各組差異較大,表明隨著成熟過程的進(jìn)行,KY組與KH組中揮發(fā)性風(fēng)味化合物更為接近,KC組與其他兩組差異顯著。對(duì)3組干酪成熟過程中揮發(fā)性風(fēng)味化合物進(jìn)行聚類分析可知,己酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯和乙酸異戊酯這些含量較高的酯類化合物可與乙醇?xì)w為一類,這與先前的結(jié)果一致,表明乙醇可能是一些干酪中酯合成的限制因素[20-21]。

2.3 感官評(píng)價(jià)

圖2為3組干酪在成熟1 d和90 d的感官評(píng)價(jià)雷達(dá)圖。成熟1 d時(shí),KY組感官評(píng)價(jià)總分為82.76,KH組感官評(píng)價(jià)總分為75.55,KC組感官評(píng)價(jià)總分為75.64。隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng),3組干酪的感官評(píng)價(jià)總分和各感官指標(biāo)得分均呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì),其中口感評(píng)分下降最顯著(P<0.05)。成熟90 d時(shí),KY組感官評(píng)價(jià)總分為73.51,KH組感官評(píng)價(jià)總分為67.10,KC組感官評(píng)價(jià)總分為66.24。

圖2 干酪成熟1 d和90 d的感官評(píng)價(jià)雷達(dá)圖Fig.2 Radar charts of sensory evaluation at day 1 and day 90 of cheeses ripening

干酪的風(fēng)味形成是一個(gè)較為漫長(zhǎng)的過程。成熟1 d時(shí),3組干酪滋氣味濃郁,尤其是KC組中酒香味十分突出,這與本研究中KC組具有最高的乙醇含量的結(jié)果是一致的。但KC組由于乙醇含量較高導(dǎo)致酒香味過重,以至掩蓋了干酪特有的乳脂味,因此KC組感官評(píng)分低于其他兩組。而KY組由于酒香味與乳脂味較為均衡,因此感官評(píng)分最高,與KH組相比差異顯著(P<0.05)。成熟90 d時(shí),3組干酪酒香味均有所下降,而水果味顯著增加。有研究表明,乙醇可以通過酯化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為酯,而過量的酯類物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致干酪的果味缺陷[20],3組干酪的氣味和滋味評(píng)分較成熟1 d時(shí)均有所降低。除此之外,隨著干酪成熟時(shí)間的增加,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得脆弱,導(dǎo)致3組干酪的口感評(píng)分顯著降低。

3 結(jié)論

3組干酪在成熟過程中揮發(fā)性風(fēng)味化合物的種類均有所增加,KY、KH兩組干酪揮發(fā)性風(fēng)味化合物的含量顯著增加,尤其是乙醇、己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯。3組干酪揮發(fā)性風(fēng)味化合物在成熟前期和后期差異顯著,其中KY組干酪在成熟前期感官評(píng)分較高,酒香味與乳脂味較為均衡,成熟后期由于酯類化合物過量累積及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得脆弱導(dǎo)致感官評(píng)分較低。綜上所述,釀酒酵母能夠促進(jìn)KY組切達(dá)干酪風(fēng)味的形成,短成熟期內(nèi)具有最佳食用品質(zhì)。