分子動(dòng)力學(xué)探究高壓對(duì)β-乳球蛋白與多酚結(jié)合的影響

孔慶新,羅麗梅,黃業(yè)傳,徐偉平,張徑舟,劉碧林,任麗萍

1(重慶化工職業(yè)學(xué)院 制藥工程學(xué)院,重慶,401228) 2(荊楚理工學(xué)院 生物工程學(xué)院,荊門,448000) 3(西南政法大學(xué)醫(yī)院,重慶,401120)

牛乳是一種營(yíng)養(yǎng)豐富、老少皆宜的食物,除直接飲用外,現(xiàn)也將一些植物原料如茶、果汁加入牛奶中,使產(chǎn)品形式和口味多樣、營(yíng)養(yǎng)更全面。植物原料中大都含有多酚,其具有保健作用,但也易與牛乳中蛋白形成復(fù)合物,進(jìn)而影響多酚的生物活性、牛乳蛋白的性質(zhì)和產(chǎn)品品質(zhì)。很多學(xué)者都對(duì)蛋白與多酚的結(jié)合進(jìn)行了研究,如兩者間的結(jié)合類型、結(jié)合位點(diǎn)、結(jié)合機(jī)理等[1-4]。多酚與蛋白的交聯(lián)主要靠非共價(jià)鍵,如氫鍵、疏水相互作用、范德華力、靜電相互作用,在一定條件下也發(fā)生共價(jià)交聯(lián)[5-6]。乳制品的殺菌仍以熱殺菌為主,熱殺菌對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)有負(fù)面影響。超高壓是一種冷殺菌技術(shù),其具有良好殺菌效果且?guī)缀跄軌蛲旰帽Ａ羰澄镏行》肿訝I(yíng)養(yǎng)和風(fēng)味物質(zhì),因此在包括乳制品的食品中應(yīng)用越來越廣[7-8]。超高壓應(yīng)用于牛乳時(shí)會(huì)改變?nèi)榈鞍椎慕Y(jié)構(gòu),進(jìn)而影響乳制品的品質(zhì)。一些學(xué)者報(bào)道了超高壓處理對(duì)牛乳蛋白結(jié)構(gòu)的影響,RUSSO等[9]表明壓力處理時(shí)β-乳球蛋白的結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定,僅300 MPa以上的壓力會(huì)使蛋白逐漸展開；CONSIDINE等[10]發(fā)現(xiàn)超高壓條件下β-乳球蛋白的變性或聚集主要是蛋白中二硫鍵重排引起的,小于100 MPa為天然構(gòu)象階段,150～350 MPa為二硫鍵發(fā)生重排的單體及二聚體,高于500 MPa主要為多聚體。超高壓用于植物乳飲料處理后是否影響到多酚與蛋白的結(jié)合目前報(bào)道很少,CHEN等[11]報(bào)道了大豆蛋白與茶多酚在400 MPa高壓下主要靠疏水作用和氫鍵交聯(lián),高壓下蛋白對(duì)茶多酚的生物活性有保護(hù)作用。

光譜技術(shù)、波譜技術(shù)、量熱技術(shù)、原子力顯微鏡等都被用于研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),但測(cè)得的只是靜態(tài)結(jié)構(gòu)；生物體內(nèi)蛋白質(zhì)一直處于動(dòng)態(tài)變化,現(xiàn)分子動(dòng)力學(xué)模擬已成為研究蛋白結(jié)構(gòu)的一種有效手段,成為繼實(shí)驗(yàn)和理論手段后從分子水平了解和認(rèn)識(shí)蛋白質(zhì)世界的第3種手段,是一種具有足夠小的時(shí)間尺度和空間尺度的模擬技術(shù)[12]。牛乳蛋白與許多小分子的結(jié)合都用分子動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了模擬,如柑橘黃酮[13]、姜黃素[14]、芹菜素[15]、茶多酚[4]等。而超高壓下的分子模擬較少,一些學(xué)者對(duì)胰島素[16]和脂肪酶[12]在高壓下的結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行了模擬。

β-乳球蛋白是乳清中含量最為豐富的一種蛋白質(zhì),由于其良好的功能和營(yíng)養(yǎng)特性在食品工業(yè)中有廣泛的應(yīng)用,其每個(gè)單體含有162個(gè)氨基酸,分子質(zhì)量為180 kDa,是由8條反向平行的β-折疊構(gòu)成的桶狀結(jié)構(gòu),其外側(cè)含有α-螺旋結(jié)構(gòu),對(duì)疏水及兩性配體均具有良好的親和力[17],而表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)是茶多酚中最主要的成分之一。因此本研究以β-乳球蛋白和EGCG為研究對(duì)象,用分子對(duì)接和分子模擬技術(shù)探討蛋白經(jīng)0.1、200、500、800 MPa的壓力處理后,其與小分子結(jié)合能和結(jié)合機(jī)理的變化,以期為進(jìn)一步提高茶乳飲料的質(zhì)量和超高壓殺菌技術(shù)在乳飲料中的應(yīng)用奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 β-乳球蛋白與茶多酚的分子對(duì)接

β-乳球蛋白數(shù)據(jù)從RCSB網(wǎng)站下載(ID號(hào)：3npo),用PyMOL除去結(jié)晶水。EGCG的結(jié)構(gòu)用ChemDraw Professional 17.1和 Chem3D 17.1準(zhǔn)備,并用自帶的MM2力場(chǎng)進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化,通過AutoDock Tools (1.5.6版本)分別對(duì)蛋白和小分子進(jìn)行處理,其中小分子加氫、計(jì)算Gasteiger電荷,蛋白加氫、計(jì)算Gasteiger電荷、合并非極性氫,生成β-乳球蛋白和EGCG的pdbqt文件。采用盲對(duì)接,小分子設(shè)置為全柔性,盒子大小設(shè)定為40 ?×40 ?×40 ?,中心坐標(biāo)為默認(rèn)值,設(shè)置間隔為1 ?。對(duì)接過程中采用AutoDock Vina搜索前20個(gè)最優(yōu)的構(gòu)象,對(duì)接參數(shù)energy_range設(shè)置為5,exhaustiveness設(shè)置為100。

1.2 不同壓力條件下EGCG與乳球蛋白結(jié)合的分子動(dòng)力學(xué)模擬

以1.1中的最優(yōu)構(gòu)象作為分子動(dòng)力學(xué)模擬的初始結(jié)構(gòu),剝離出小分子的pdb結(jié)構(gòu),并在ATB網(wǎng)站生成小分子的top文件。分子動(dòng)力學(xué)模擬采用Gromacs(2019.6)軟件,首先將小分子合并到蛋白中,修改復(fù)合物的top文件；模擬時(shí)選用GROMOS54a7力場(chǎng),將蛋白放入立方體水盒子中,水模型采用SPC模型,使蛋白離盒子邊緣最短距離為1 nm并添加Na+使體系達(dá)到電中性,并使用最速下降法對(duì)體系進(jìn)行能量最小化[13]。然后在NVT和NPT系綜下分別進(jìn)行400 ps的平衡,平衡后溫度為300 K,壓力達(dá)到預(yù)先設(shè)定的壓力值。最后進(jìn)行150 ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬,使用LINCS算法約束所有鍵,使用PME計(jì)算靜電作用,范德華相互作用使用截?cái)喟霃綖?.4 nm進(jìn)行計(jì)算。選用Parrinello-Rahman壓浴方式,Isotropic為控壓方式,使用V-rescale的控溫方式。模擬步長(zhǎng)為2 fs,每10 ps貯存1次數(shù)據(jù),每個(gè)處理平行模擬2次。

模擬結(jié)束后,先去除周期性邊界條件,然后使用gmx的rms命令分析各壓力下小分子與蛋白的均方根誤差(root mean squared error,RMSD)；并用gmx的相應(yīng)命令分析各壓力下蛋白殘基的波動(dòng)[均方根漲落(root mean square fluctuation,RMSF]、蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)、可及表面積的變化；并用能量分析命令分析蛋白的體積變化。RMSD分析全部150 ns的數(shù)據(jù),而其余指標(biāo)分析結(jié)構(gòu)穩(wěn)定后的數(shù)據(jù),即100～150 ns。分析時(shí)每100 ps選取1個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn),作圖用Origin 8.0軟件。

另外,將初始純蛋白(3npo)也按上述方法在不同壓力下進(jìn)行150 ns的分子模擬,然后分別提取130、135、140、145、150 ns的蛋白結(jié)構(gòu),并按1.1的方法分別和小分子EGCG進(jìn)行對(duì)接,以觀察高壓處理后小分子在蛋白的對(duì)接位點(diǎn)是否發(fā)生了變化。

1.3 MMPBSA計(jì)算小分子與蛋白的結(jié)合自由能

提取模擬過程中100～150 ns的軌跡(xtc文件),借助于g_mmpbsa工具,利用MMPBSA(molecular mechanics Poisson-Boltzmann surface area)方法計(jì)算小分子與蛋白之間的結(jié)合自由能[15]。

1.4 小分子與蛋白結(jié)合的二維平面圖和表面結(jié)構(gòu)圖

提取各壓力條件下復(fù)合物100～150 ns的平均pdb結(jié)構(gòu),用LigPlot+(V 2.2)軟件分析小分子與蛋白在結(jié)合位點(diǎn)的疏水和氫鍵作用；并在PyMOL中繪制蛋白的表面結(jié)構(gòu)圖及與小分子結(jié)合情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶多酚在蛋白的結(jié)合位點(diǎn)

通過分子對(duì)接,發(fā)現(xiàn)EGCG在β-乳球蛋白前20個(gè)能量較高的結(jié)合位點(diǎn)主要分布在2個(gè)區(qū)域,如圖1所示,其中主要是結(jié)合在疏水腔上部的1號(hào)區(qū)域,另外還有位于蛋白表面的2號(hào)區(qū)域,在1號(hào)區(qū)域的平均對(duì)接能大于2號(hào)區(qū)域。關(guān)于多酚在β-乳球蛋白結(jié)合位點(diǎn)的報(bào)道較多,其中有研究認(rèn)為在中性pH時(shí)小分子主要結(jié)合在疏水腔,而在酸性條件下則結(jié)合在蛋白表面[4,19],AL-SHABIBN等[20]也發(fā)現(xiàn)蘆丁既可以結(jié)合在疏水腔也可以結(jié)合在蛋白表面,其中疏水腔的結(jié)合力更大,這與本研究結(jié)論一致。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)小分子吸附在乳球蛋白的表面,未結(jié)合在疏水腔[1,21],這可能與小分子結(jié)構(gòu)、對(duì)接的蛋白初始結(jié)構(gòu)、模擬條件等差異有關(guān)。

蛋白在不同壓力條件下進(jìn)行150 ns模擬后再進(jìn)行分子對(duì)接,對(duì)接位點(diǎn)發(fā)生了明顯變化,500 MPa及以下的壓力處理后小分子仍結(jié)合到1、2號(hào)區(qū)域,其中常壓下(0.1 MPa)的前20個(gè)位點(diǎn)主要仍是位于1號(hào)區(qū)域；而200和500 MPa處理后則在2號(hào)區(qū)域?yàn)樽顑?yōu)區(qū)域,其結(jié)合能高于1號(hào)區(qū)域；800 MPa處理后,小分子的結(jié)合位點(diǎn)增多,除了1、2號(hào)區(qū)域外還增加了其他結(jié)合位點(diǎn),如3、4和5號(hào)區(qū)域,沒有明顯的規(guī)律性,這種現(xiàn)象可能與蛋白的結(jié)構(gòu)變化有關(guān),800 MPa下蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化后使可結(jié)合小分子的位點(diǎn)增加,或1、2號(hào)區(qū)域發(fā)生了不利于小分子結(jié)合的構(gòu)象變化。

圖1 EGCG在β-乳球蛋白的主要結(jié)合位點(diǎn)Fig.1 Main binding sites of EGCG to β-lactoglobulin

2.2 EGCG與β-乳球蛋白結(jié)合的分子動(dòng)力學(xué)

2.2.1 分子動(dòng)力學(xué)模擬過程中RMSD的變化

RMSD是衡量特定時(shí)間蛋白結(jié)構(gòu)與原始構(gòu)象的平均偏差,是評(píng)價(jià)研究體系是否穩(wěn)定的重要指標(biāo)。由圖2-a可知,500 MPa下小分子的波動(dòng)較大,100 ns后才達(dá)到平衡,而其他壓力下基本在30 ns左右就達(dá)到了平衡,從平衡后(均取100 ns后的數(shù)據(jù))的平均值來對(duì)比,常壓下為0.192 nm,與200 MPa下相當(dāng)(0.194 nm),500 MPa(0.266 nm)時(shí)最高,800 MPa時(shí)為0.213 nm。就蛋白的RMSD而言(圖2-b),均是40 ns左右就達(dá)到了平衡,且整體波動(dòng)很小,說明β-乳球蛋白與EGCG的結(jié)合過程對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)影響很小,兩者的結(jié)合總體平穩(wěn)。同樣,取100 ns后的平均值來衡量,常壓下為0.249 nm,200 MPa下蛋白的RMSD低于常壓(0.238 nm),隨著壓力的繼續(xù)增加,蛋白的RMSD也增加,且高于常壓,其中500和800 MPa下分別為0.272和0.259 nm。說明200 MPa的壓力處理能使蛋白結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定,而500和800 MPa的壓力處理能使β-乳球蛋白的穩(wěn)定性略為降低。SAHIHI等[13]報(bào)道柑橘黃酮與β-乳球蛋白間的結(jié)合很平穩(wěn),得到的RMSD值也較低；GHOLAMI等[21]研究柚皮苷和β-乳球蛋白的結(jié)合時(shí)發(fā)現(xiàn)柚皮苷的波動(dòng)比蛋白小；ABDULATIF等[20]發(fā)現(xiàn)蘆丁與β-乳球蛋白結(jié)合時(shí),小分子與蛋白的波動(dòng)相當(dāng),本研究中小分子的波動(dòng)略低于蛋白,與上面的報(bào)道基本一致。KURPIEWSKA等[16]報(bào)道胰島素在200或500 MPa處理時(shí)殘基位移會(huì)減小;HATA等[22]也報(bào)道高壓下蛋白的結(jié)構(gòu)波動(dòng)會(huì)減小,而本研究只發(fā)現(xiàn)200 MPa時(shí)蛋白波動(dòng)小于常壓。

a-小分子；b-蛋白圖2 不同壓力處理模擬過程中小分子和蛋白的RMSD對(duì)比Fig.2 RMSD of small molecule and protein during different pressure simulations

2.2.2 分子動(dòng)力學(xué)模擬過程中RMSF的變化

RMSF主要反映蛋白中各氨基酸殘基在不同壓力處理時(shí)的波動(dòng)情況,波動(dòng)越大,說明該殘基在壓力處理中柔性越大,平均柔性越高蛋白結(jié)構(gòu)也就越不穩(wěn)定。從圖3可知,不同壓力處理體系中RMSF值相當(dāng),沒有明顯差異,說明高壓總體上對(duì)殘基波動(dòng)影響不大。就小分子和蛋白結(jié)合口袋附近而言,殘基波動(dòng)較大的有86號(hào)位的Ala,87號(hào)位的Leu和88號(hào)位的Asn。RMSF大小與模擬常壓下柑橘黃酮與β-乳球蛋白結(jié)合時(shí)得到的數(shù)據(jù)基本一致[13],但本研究中個(gè)別殘基的波動(dòng)更大,可能是受高壓的影響。

圖3 分子模擬過程中不同壓力處理蛋白R(shí)MSF對(duì)比Fig.3 RMSF of different pressure treatment during molecular dynamics simulation

2.2.3 分子動(dòng)力學(xué)模擬過程中蛋白體積的變化

如圖4所示,隨壓力的增加,蛋白體積顯著減少,且體積在150 ns的模擬過程中保持恒定。根據(jù)Le Chatelier原理,高壓下蛋白朝體積減小的方向進(jìn)行,這可能是壓力下,水分子進(jìn)入疏水腔使疏水腔變形,導(dǎo)致蛋白的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化進(jìn)而體積減小[22]。KURPIEWSKA等[16]也報(bào)道了胰島素在100 MPa下體積減少約1.4%。

圖4 不同壓力處理模擬過程中蛋白體積變化Fig.4 Volume comparison of different pressure treatment during molecular dynamics simulation

2.2.4 分子動(dòng)力學(xué)模擬過程中蛋白溶劑可及表面積的變化

由表1可知,500 MPa以上的高壓處理可以明顯減少蛋白的溶劑可及表面積,其主要是由疏水表面積的減少所致,而親水表面積變化不大。這可能是由于高壓能導(dǎo)致蛋白總體積減少,從而使溶劑可及表面也減少,更多的疏水表面在壓力作用下被掩埋。但各壓力下親水表面積均大于疏水表面積,因此壓力作用不會(huì)改變蛋白的水溶性。疏水表面積的減少可能是高壓條件下水分子滲透進(jìn)入蛋白分子內(nèi)部使更多的疏水區(qū)域暴露在極性水溶液中[23]。其他一些研究者也報(bào)道了高壓下蛋白疏水性的變化,但結(jié)果并不一致,有的研究者認(rèn)為隨壓力的增加蛋白的疏水作用減弱[11,22],而另一些學(xué)者報(bào)道高壓下蛋白的疏水性增加[24-25]。這些研究均是采用實(shí)驗(yàn)手段研究表面疏水性,而本研究采用分子模擬研究疏水表面積的變化。

表1 不同壓力處理對(duì)蛋白溶劑可及表面積的影響 單位:nm2

2.2.5 分子動(dòng)力學(xué)模擬過程中蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化

如表2所示,200 MPa時(shí)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化不大,主要是彎曲減少而轉(zhuǎn)角增加；而500和800 MPa條件下,蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大的變化,α-螺旋明顯減少,β-折疊也有所降低,而無規(guī)則卷曲顯著增加,500和800 MPa兩者間差異并不明顯。因此,壓力較低時(shí)(200 MPa)對(duì)β-乳球蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)影響不大,而壓力較高時(shí)(500 MPa以上)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)則變化較大。邱春江[24]研究高壓處理肌原纖維蛋白時(shí)也發(fā)現(xiàn)在高壓下蛋白的α-螺旋下降,α-螺旋對(duì)壓力比較敏感,可能是高壓下蛋白的氫鍵受到一定程度破壞,而氫鍵對(duì)α-螺旋的穩(wěn)定至關(guān)重要[26],本研究也發(fā)現(xiàn)500 MPa及以上壓力處理對(duì)α螺旋的破壞更大。白雨鑫[25]的研究表明500 MPa的壓力對(duì)β-乳球蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)影響很小,CHEN等[11]研究發(fā)現(xiàn)400 MPa的壓力處理能使大豆蛋白的α-螺旋減少而β-折疊增加,陳剛[12]報(bào)道脂肪酶在400 MPa處理時(shí)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化不大,而500 MPa以上時(shí)α-螺旋部分轉(zhuǎn)化為無規(guī)則卷曲或β-折疊,這些差異可能是由蛋白不同或測(cè)定方法不同引起,上述報(bào)道大都采用實(shí)驗(yàn)手段測(cè)得而本研究是分子模擬。

表2 不同壓力處理對(duì)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響Table 2 Effect of different pressure on the secondary structure of lactoglobulin

2.3 MMPBSA分析小分子與蛋白間的結(jié)合自由能

由表3可知,小分子和蛋白間的結(jié)合主要靠范德華力,靜電作用力和非極性溶劑化自由能也有一定的貢獻(xiàn),而極性溶劑化自由能為正值,對(duì)蛋白的穩(wěn)定有負(fù)面作用。隨著壓力的不斷增加,靜電相互作用力有所增加,但范德華力相比常壓模擬體系均降低,另外極性溶劑化所消耗的能量也增加,而非極性溶劑化能基本不變。在以上幾種作用力的綜合作用下,總結(jié)合自由能隨壓力增加逐漸降低,因此在超高壓作用下,小分子與蛋白的結(jié)合不如常壓下穩(wěn)定。除了高壓對(duì)小分子結(jié)合的直接影響以外,這也可能與分子模擬只選擇了對(duì)接能最高的1號(hào)結(jié)合位點(diǎn)有關(guān),在2.1的分析中可知,高壓處理后的蛋白更易結(jié)合在2號(hào)或其他位點(diǎn),因此可以推斷,β-乳球蛋白高壓處理后在1號(hào)結(jié)合位點(diǎn)可能發(fā)生了不利于小分子結(jié)合的蛋白結(jié)構(gòu)變化,具體通過后面的機(jī)制分析來闡明。

表3 不同壓力對(duì)蛋白與EGCG結(jié)合的MMPBSA自由能的影響 單位：kJ/mol

AL-SHABIBN等[20]研究蘆丁和β-乳球蛋白的結(jié)合時(shí),用MMGBSA計(jì)算出兩者在蛋白表面的結(jié)合能為-68.011 2 kcal/mol,大于本研究的結(jié)果,這可能與小分子結(jié)構(gòu)不同有關(guān),也可能與計(jì)算方法不同有關(guān),他們使用的是MMGBSA。ZHAN等[27]研究β-乳球蛋白與辣椒素結(jié)合時(shí)用MMPBSA計(jì)算得到的結(jié)合能是-142.744 kJ/mol,也是范德華作用為主要結(jié)合力,與本研究結(jié)果一致。陳剛[12]發(fā)現(xiàn)200 MPa處理時(shí)脂肪酶與乙酸乙酯的結(jié)合能增加,而400和600 MPa時(shí)結(jié)合能下降,其中600 MPa時(shí)下降更多,與本研究的結(jié)果稍有不一致。

從各個(gè)殘基對(duì)能量的貢獻(xiàn)來看,4個(gè)壓力下貢獻(xiàn)值均超過1 kJ/mol的有8個(gè)殘基,分別是Leu31、Leu39、Val41、Leu58、Ile71、Val92、Met107、Glu108,大部分為疏水氨基酸,說明蛋白與小分子的結(jié)合疏水作用也是一種主要結(jié)合力。特別值得注意的是,壓力增加時(shí),Leu87、Met107和Ala118等殘基的貢獻(xiàn)顯著減弱,具體的機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

2.4 蛋白與小分子可能的結(jié)合機(jī)制分析

由圖5-a可以看出0.1 MPa時(shí)小分子與蛋白的7個(gè)氨基酸存在疏水作用,分別是Leu39、Val41、Lys69、Ile71、Ala86、Met107、Glu108,小分子所處氨基酸環(huán)境與CHENG等[28]報(bào)道的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和KANAKIS等[17]報(bào)道的EGCG結(jié)合在β-乳球蛋白后所處的氨基酸環(huán)境基本一致。小分子與蛋白間形成6個(gè)氫鍵,分別與Asn88形成2個(gè)氫鍵、與Asn90間1個(gè)氫鍵、與Asn109間2個(gè)氫鍵,另外與Ser116間形成1個(gè)氫鍵。200 MPa時(shí)小分子所處的疏水環(huán)境和形成的氫鍵均和0.1 MPa沒有差異,500 MPa時(shí)所處的疏水環(huán)境和0.1 MPa相同,但形成的氫鍵少了1個(gè),其中與Asn109間只形成了1個(gè)氫鍵(200和500 MPa條件下的二維平面圖未顯示)。而800 MPa時(shí)所處的疏水環(huán)境和形成的氫鍵均發(fā)生了比較明顯的變化,如圖5-b所示,雖然也是和周圍的7個(gè)氨基酸存在疏水相互作用,但氨基酸與前面3個(gè)壓力不同,其中多了Leu87和Asn90,而少了Lys69和Ala86；形成的氫鍵只有4個(gè),分別與Lys69、Asn88、Asn109和Ser116形成氫鍵。

非配體鍵; 配體鍵; 氫鍵及長(zhǎng)度; 參與疏水作用的非配體殘基; 參與疏水作用的相應(yīng)原子 a-0.1 MPa；b-800 MPa圖5 0.1 和800 MPa下小分子與蛋白相互作用的二維平面圖Fig.5 The 2D plot for interaction between EGCG and β-lactoglobulin under 0.1 and 800 MPa注：B6e163在二維平面圖中代表小分子

由表2可知,隨著處理壓力的增加,小分子與蛋白間的靜電作用力也增加,可能的原因是除了氫鍵以外,蛋白與小分子間的其他弱靜電相互作用也很重要[29]。結(jié)合2.3的結(jié)果可推斷,壓力處理整體上對(duì)小分子與蛋白間的疏水作用影響不大,但800 MPa時(shí)小分子所處的疏水環(huán)境有微小改變；另外,隨著壓力的增加(500 MPa及以上),小分子與蛋白間的氫鍵會(huì)有一定程度的破壞,這可能是高壓下小分子與蛋白間結(jié)合能降低的重要原因之一。

賈晶晶[30]研究EGCG與β-乳球蛋白結(jié)合時(shí)發(fā)現(xiàn),結(jié)合力以疏水作用為主,同時(shí)也有范德華力和氫鍵。CHENG等[28]報(bào)道矢車菊素-3-O-葡萄糖苷與β-乳球蛋白交聯(lián)時(shí)發(fā)現(xiàn)主要結(jié)合力為氫鍵和疏水作用,且形成的其中2個(gè)氫鍵是與Asn109和Ser116,與本研究基本一致。本研究中隨壓力增加,小分子與蛋白間結(jié)合能逐漸降低應(yīng)該是氫鍵、范德華力和靜電相互作用力變化引起的綜合效果,其中范德華力和氫鍵均減弱,靜電作用有所增加；疏水作用雖然對(duì)兩者的結(jié)合也很重要,但500 MPa及以下的壓力沒有影響到疏水結(jié)合力和小分子的疏水環(huán)境。

為進(jìn)一步了解高壓對(duì)蛋白表面結(jié)構(gòu)及與小分子結(jié)合的影響,用PyMOL軟件繪制了蛋白分子表面結(jié)構(gòu)圖,圖6-a和圖6-b分別為0.1和800 MPa下100～150 ns模擬過程中蛋白的平均表面結(jié)構(gòu)及多酚與蛋白的結(jié)合情況,可以看出,蛋白在800 MPa時(shí)表面結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化,特別是上部臨近疏水腔的口袋處,結(jié)合位點(diǎn)處蛋白結(jié)構(gòu)的變化肯定會(huì)引起小分子結(jié)合姿勢(shì)與結(jié)合能的差異,表3的數(shù)據(jù)也證實(shí)了不同壓力下小分子與蛋白的結(jié)合能差異較大,說明壓力越大,小分子與蛋白的結(jié)合位點(diǎn)處發(fā)生了越不利于兩者結(jié)合的變化；前面的分子對(duì)接也表明壓力處理后小分子的最佳結(jié)合位點(diǎn)并不在1號(hào)位；另外,0.1 MPa時(shí)小分子結(jié)構(gòu)更加伸展(圖6-a),能與蛋白更多殘基發(fā)生作用,從而結(jié)合力也更高；這也與前面的分析是一致的,0.1 MPa時(shí)小分子與蛋白間形成的氫鍵更多。

a-0.1 MPa；b-800 MPa圖6 0.1和800 MPa下蛋白分子表面結(jié)構(gòu)及與多酚結(jié)合情況Fig.6 Surface structure and polyphenol binding of protein at 0.1 and 800 MPa

3 結(jié)論

不同壓力下茶多酚在β-乳球蛋白上的結(jié)合位點(diǎn)不一樣,其中常壓下主要結(jié)合在疏水腔的1號(hào)位點(diǎn),蛋白在200和500 MPa處理后主要結(jié)合在蛋白表面的2號(hào)位點(diǎn),而800 MPa處理后除了1號(hào)和2號(hào)外,還增加了其他結(jié)合位點(diǎn),這可能與高壓下蛋白體積的收縮和蛋白變性引起的蛋白結(jié)構(gòu)變化有關(guān)。以1號(hào)結(jié)合位點(diǎn)為目標(biāo)進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬,發(fā)現(xiàn)在150 ns的模擬過程中,200 MPa的壓力處理能使小分子和蛋白的波動(dòng)都較小,而500和800 MPa下小分子和蛋白的波動(dòng)都增加,但蛋白整體上在結(jié)合過程中結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。500 MPa及以上的高壓下蛋白的α-螺旋和β-折疊會(huì)受到一定程度的破壞、蛋白疏水表面積減少,蛋白的表面結(jié)構(gòu)也會(huì)在高壓下發(fā)生較大的改變,特別是小分子與蛋白的結(jié)合口袋處,這些差異造成小分子與蛋白的結(jié)合自由能隨壓力的增加而降低,其中主要是范德華力和氫鍵的減少所致,而靜電作用力雖然高壓下有所增強(qiáng),但影響有限。本研究為更好地了解蛋白與多酚在高壓下的結(jié)合,進(jìn)而促進(jìn)高壓在植物蛋白飲料殺菌的應(yīng)用奠定了一定的理論基礎(chǔ)。