沙棘提取物對幽門螺桿菌脲酶活性的抑制

劉欣,常應(yīng)九,王樹林,2*,高慶超

1(青海大學(xué) 農(nóng)牧學(xué)院,青海 西寧,810016) 2(青海大學(xué) 省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,青海 西寧,810016) 3(江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與營養(yǎng)研究所),江蘇 南京,210014)

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori)是彎曲菌科螺桿菌屬的一種微需氧革蘭氏陰性菌,可定植于人體胃部。H.pylori感染在世界范圍內(nèi)極為常見,世界人口感染率高達(dá)50%[1]。H.pylori與胃炎、消化潰瘍以及胃癌的發(fā)生密切相關(guān),已被世界衛(wèi)生組織列為生物致癌因子[2-3]。臨床上幽門螺桿菌感染最主要采用的治療方案是三聯(lián)療法,即質(zhì)子泵抑制劑配合2種抗生素,常用抗生素為阿莫西林和克拉霉素[4]。由于抗生素的長時(shí)間濫用,H.pylori的耐藥性逐年升高,三聯(lián)療法療效受到嚴(yán)重影響,因此,四聯(lián)療法應(yīng)運(yùn)而生,即在三聯(lián)療法基礎(chǔ)上加入鉍劑輔助治療,但療效并未顯著提高,反而出現(xiàn)了多重耐藥的現(xiàn)象[5]。因此,尋找潛在有效治療H.pylori的替代藥物迫在眉睫。

脲酶(urease,EC3.5.1.5)是H.pylori重要的定殖因子與毒力因子[6],可分解尿素產(chǎn)生氨以中和胃酸,在其周圍形成一片“氨云”,使得H.pylori可以在胃部生長繁殖。研究表明,剔除脲酶突變基因,H.pylori不能在無菌豬仔胃部定殖[7]。脲酶能分解尿素產(chǎn)生過量氨,并進(jìn)一步形成硝酸鹽和亞硝酸鹽損害組織甚至致癌[8]；尿素的水解產(chǎn)物還能激活單核細(xì)胞,促使免疫炎癥遞質(zhì)和超氧自由基的分泌,促使空泡的形成[6,9]。在脲酶的結(jié)構(gòu)單元中,其活性位點(diǎn)的Ni2+和活性位點(diǎn)附近的必需基團(tuán)巰基對脲酶的催化作用是必需的,而脲酶的活性又與H.pylori能否成功定殖胃部,影響生物體氮利用有關(guān)系[4],因此,抑制脲酶活性被視作抗菌物質(zhì)研究的關(guān)鍵[10-11]。

沙棘(HippophaerhamnoidesLinn.)為青藏高原的特色漿果資源,屬藥食同源植物,目前已從沙棘根、莖、葉、果實(shí)中分離了多種生物活性物質(zhì),如甾醇類化合物、多酚類化合物、多糖、不飽和脂肪酸等。沙棘鮮果可直接食用,但因其酸度較大,故主要用于加工,當(dāng)前市場上的沙棘產(chǎn)品主要包括食品、藥品、化妝品、保健品等8大類,沙棘食品主要為沙棘飲料、沙棘茶、沙棘果醋、沙棘酒和沙棘果粉等。在飼用價(jià)值方面,以沙棘葉和沙棘殘?jiān)鼮轱暳匣蜓a(bǔ)充飼料可有效提高乳肉產(chǎn)品的質(zhì)量、數(shù)量,增加了優(yōu)質(zhì)飼料的種類[12]。在藥用價(jià)值方面,沙棘為藏、蒙傳統(tǒng)藥物用于治療燒傷、凍傷、心腦血管疾病等,早期研究表明,沙棘提取物對多種腸道致病菌有抑制作用,沙棘中的抑菌成分多樣,包括沙棘甾醇、沙棘多糖及沙棘黃酮等,且沙棘在調(diào)節(jié)腸道微生物系統(tǒng)方面也有一定功效[13]。研究發(fā)現(xiàn)沙棘籽、葉提取物對白色念珠菌、大腸桿菌、枯草芽胞桿菌等均有很強(qiáng)的抑菌效果[14-17]。黃國棟等[18]用沙棘原花青素治療H.pylori相關(guān)性胃炎,治療組的有效率高達(dá)88%。目前,沙棘資源雖得到一定程度的開發(fā),但是關(guān)于沙棘抗H.pylori感染的潛在機(jī)制鮮有報(bào)道,考慮到幽門螺旋桿菌脲酶(Helicobacterpyloriurease,HPU)作為H.pylori定殖于胃部的重要因子,本試驗(yàn)將研究沙棘提取物對HPU的抑制作用機(jī)制,為探明沙棘提取物抑制H.pylori感染機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù),進(jìn)一步開發(fā)沙棘資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

野生沙棘鮮果,青海省西寧市城北區(qū)；幽門螺桿菌ATCC 43504標(biāo)準(zhǔn)株,美國菌種保藏中心。

1.2 試驗(yàn)儀器與試劑

1.2.1 試驗(yàn)試劑

LA3540哥倫比亞瓊脂基礎(chǔ)、LA3550布氏肉湯、R0010高效RIPA裂解液(組織/細(xì)胞)、BC4110脲酶活性檢測試劑盒,北京索萊寶科技有限公司；A045-2蛋白定量測試盒,南京建成生物工程研究所；RN08-EASYspin細(xì)菌總RNA提取試劑盒,北京艾德萊生物科技有限公司；RR820A熒光定量PCR試劑盒,寶生物工程(大連)有限公司。

1.2.2 試驗(yàn)儀器

SW-CJ-ID單人凈化工作臺(tái),蘇州凈化設(shè)備有限公司；YM50FNG高壓蒸汽滅菌鍋,上海三申醫(yī)療器械；SPX-450FT恒溫生化培養(yǎng)箱,寧波普朗特儀器有限公司；Multiskan Sky微量核酸蛋白測定儀,美國Thermo Fisher公司；Centrifuge 5430R低溫高速離心機(jī),德國Eppendorf有限公司；CFX-96 Touch熒光定量PCR儀,美國Bio-Rad公司。

1.3 樣品制備及主要指標(biāo)測定

1.3.1 沙棘水及乙醇提取物的制備

新鮮沙棘果烘干打粉,果粉分別與水、體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇以料液比1∶20(g∶mL)混合,超聲輔助提取2次(40 ℃,30 min),提取液經(jīng)過濾后濃縮至一定體積,將濃縮的提取液進(jìn)行真空冷凍干燥,所得凍干物按濃度需求以原溶劑進(jìn)行復(fù)溶,并以0.22 μm濾膜過濾除菌。

1.3.2H.pylori的培養(yǎng)

H.pylori接種于布氏肉湯培養(yǎng)基,添加體積分?jǐn)?shù)5%胎牛血清和混合抗生素(萬古霉素0.01 mg/mL,兩性霉素B 0.01 mg/mL,多粘菌素0.000 2 mg/mL,甲氧芐氨0.005 mg/mL),于微需氧條件下(5% O2,10% CO2和85% N2),37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)24 h,得菌液備用。

1.3.3 脲酶的制備

脲酶提取參照XIAO等[19]的方法并進(jìn)行改進(jìn)。肉湯培養(yǎng)物離心(6 000×g,10 min,4 ℃)以收集菌體,以pH 7.4的PBS緩沖液清洗兩遍,加入適量的細(xì)胞裂解液、蛋白酶抑制劑,混勻,冰浴20～30 min。再次離心(15 000×g,5 min,4 ℃)收集脲酶,檢測其活性,并置于-80 ℃冰箱保存。

1.3.4 HPU酶活性測定方法

采用Berthelot法(靛酚藍(lán)顯色法)對HPU的酶活性進(jìn)行測定。按脲酶活性測定試劑盒將尿素溶于蒸餾水,加入脲酶溶液,充分混勻后于37 ℃反應(yīng)1 h,再加入顯色液進(jìn)行顯色,于630 nm處檢測吸光值,測得脲酶活性為1.22 U/mg prot,一個(gè)脲酶活性單位定義為1 mg蛋白1 min產(chǎn)生1 μg NH3-N(氨氮),計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：UE,酶活力,U/mg prot；ΔA(測定)=A(測定管)-A(對照管),吸光值之差；ΔA(標(biāo)準(zhǔn))=A(標(biāo)準(zhǔn)管)-A(空白管),吸光值之差；ρ(標(biāo)準(zhǔn)品),氮標(biāo)液的質(zhì)量濃度,μg/mL；V(酶促),酶促反應(yīng)體系總體積,mL；V(樣本),加入反應(yīng)體系中樣本體積,mL；ρ(pr),樣本蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度,mg/mL；t,反應(yīng)時(shí)間,min。蛋白質(zhì)濃度由考馬斯亮藍(lán)法測定。

1.4 主要研究內(nèi)容及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 沙棘水提物對菌液脲酶活性的影響

將沙棘水提物同H.pylori菌液混合,設(shè)置組間濃度梯度,各組沙棘水提物體系質(zhì)量濃度分別為0、0.5、1、2.5、5 mg/mL,于37 ℃振蕩培養(yǎng)6 h,評價(jià)其HPU活性差異。

1.4.2 脲酶活性抑制試驗(yàn)

將沙棘果粉水提物、80%乙醇提取物與HPU于37 ℃孵育20 min后測定其酶活性,設(shè)置沙棘水提物的體系質(zhì)量濃度為5 mg/mL,設(shè)置pH 3、4的檸檬酸溶液,80%乙醇作為空白對照。試驗(yàn)重復(fù)3次。

參照WU等[20]設(shè)置孵育時(shí)間梯度、抑制劑濃度梯度試驗(yàn)探究沙棘提取物對脲酶活性的抑制作用效力。

將沙棘水提物與HPU混合,設(shè)置沙棘水提物的體系質(zhì)量濃度為5 mg/mL,組間孵育時(shí)間分別為5、10、20、40 min,測定各組HPU活性。試驗(yàn)重復(fù)3次。

將沙棘水提物與HPU混合,設(shè)置各組間沙棘水提物體系質(zhì)量濃度分別為0、2.5、5、7.5、10 mg/mL,孵育20 min后測定各組HPU活性。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.3 HPU脲酶動(dòng)力學(xué)研究試驗(yàn)

沙棘水提物的系列質(zhì)量濃度梯度為0、1、2、3 mg/mL,共4個(gè)組。每個(gè)濃度組8個(gè)試管,每組的8個(gè)試管中含不同濃度的尿素溶液(0.5、1、2、4、6、10、16、20 mmol/L)。根據(jù)分組,分別加入不同濃度的抑制劑和尿素溶液,再加入HPU溶液,混勻,置于37 ℃水浴20 min后分別測定其脲酶活性,試驗(yàn)重復(fù)3次。

根據(jù)Lineweaver-Burk plot雙倒數(shù)法作圖求得動(dòng)力學(xué)參數(shù)Vmax及米氏常數(shù)Km,確定沙棘水提物對HPU的抑制作用類型。

1.4.4 沙棘水提物對HPU脲酶抑制位點(diǎn)影響研究

利用兩類保護(hù)劑,一類為含巰基化合物二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT)；第二類為脲酶無機(jī)保護(hù)劑硼酸(boric acid,BA)。兩類保護(hù)劑分別針對HPU活性位點(diǎn)附近的巰基和活性中心的Ni2+。

采用硫醇化合物進(jìn)行保護(hù),將HPU分別與10 mmol/L DTT于37 ℃預(yù)反應(yīng)20 min,然后將被保護(hù)的每個(gè)脲酶樣品與4 mg/mL沙棘水提物反應(yīng)20 min,測定脲酶活性。試驗(yàn)重復(fù)3次。

采用無機(jī)化合物(BA)進(jìn)行保護(hù),將HPU與5 mmol/L BA于37 ℃預(yù)反應(yīng)20 min,再向反應(yīng)體系加入4 mg/mL沙棘水提物反應(yīng)20 min,測定脲酶活性。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.5 沙棘水提物對HPU毒力基因的影響

設(shè)置沙棘水提物高劑量組(5 mg/mL)、中劑量組(1 mg/mL)、低劑量組(0.2 mg/mL)和空白對照組。

細(xì)菌總RNA的提取與檢測：將沙棘水提物與H.pylori菌液共同孵育12 h,離心收集菌體(4 000 r/min,10 min),參照Aidlab細(xì)菌總RNA提取試劑盒說明書提取細(xì)菌RNA,檢測其純度及濃度,再通過瓊脂糖凝膠電泳檢測提取RNA的完整性,電泳條件：電壓150 V,時(shí)間15 min。凝膠成像儀檢測電泳結(jié)果。

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：所提取RNA的A260/A280達(dá)到純度要求1.8～2.0后,按TAKARA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。

引物設(shè)計(jì)：依據(jù)H.pylori26695標(biāo)準(zhǔn)株脲酶蛋白α亞基(urease subunit α,Ure-α),脲酶蛋白β亞基(urease subunit β,Ure-β),脲酶輔助蛋白E(urease accessory protein E,Ure-E),脲酶輔助蛋白H(urease accessory protein H,Ure-H)相應(yīng)基因的CDS區(qū)序列,所得序列見表1,委托生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成引物。

表1 HPU毒力基因引物序列Table 1 Primer sequence of virulence gene of urease of Helicobacter pylori

實(shí)時(shí)熒光定量PCR：實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增程序按試劑盒說明進(jìn)行操作,于Bio-Rad Real-Time PCR儀上擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性30 s,94 ℃變性5 s,72 ℃延伸30 s,40個(gè)循環(huán)。

以16S為內(nèi)參,以空白組表達(dá)量為參照,計(jì)算各組目的基因的相對表達(dá)量,用2-ΔΔCt表示,ΔCtxx組=Ctxx組目的基因-Ctxx組內(nèi)參基因,ΔΔCtxx組=ΔCtxx組-ΔCt空白組,所得值即為各組目的基因mRNA水平的相對表達(dá)量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度沙棘水提物對菌液脲酶活性影響

不同濃度沙棘水提物對菌液脲酶活性影響試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。隨著沙棘水提物濃度的增加,反應(yīng)體系中的脲酶殘留活性減小,當(dāng)沙棘水提物的體系質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí),菌液的脲酶殘留活性為7.5%,表明沙棘水提物對H.pylori菌液脲酶活性的抑制作用與提取物濃度呈相關(guān)性。

圖1 不同濃度沙棘水提物對菌液HPU活性的影響Fig.1 Effect of concentration of H.rhamnoides water extracts on HPU activities in bacterial solution注：與未加入沙棘水提物的空白組比較,*表示P<0.05,差異顯著； **表示P<0.01,差異極顯著(下同)

2.2 沙棘提取物對HPU的抑制作用

沙棘提取物及其他處理對HPU的抑制作用如圖2所示。在排除溶劑、反應(yīng)體系酸堿度對酶活性的影響后,結(jié)果表明沙棘水提物及乙醇提取物對HPU活性具有明顯抑制作用(P<0.01)。5 mg/mL的沙棘水提物和體積分?jǐn)?shù)80%乙醇提取物作用20 min后,HPU活性分別降至9.6%、6.7%。

圖2 沙棘提取物以及溶劑、體系環(huán)境對HPU活性影響Fig.2 Effect of H.rhamnoides extracts,solvent and system environment on the activities of HPU

2.3 沙棘水提物的IC50值測定結(jié)果

沙棘水提物抑制H.pylori的IC50值測定結(jié)果見圖3。

圖3 不同濃度沙棘水提物對HPU活性影響Fig.3 Effect of concentration of H.rhamnoides water extracts on HPU activities

沙棘水提物對HPU的抑制作用與提取物濃度正相關(guān),當(dāng)提取物質(zhì)量濃度>5 mg/mL時(shí),HPU殘留活性<5%,抑制效果明顯,其IC50值為(2.73±0.10)mg/mL。

2.4 孵育時(shí)間對HPU活性的影響

沙棘水提物與HPU共同孵育時(shí)間對HPU活性的影響試驗(yàn)結(jié)果見圖4。隨著孵育時(shí)間的延長,HPU活性逐漸減小,5 mg/mL沙棘水提物與HPU溶液孵育5、10、20、40 min后,HPU活性分別降至9.3%、6.3%、5.7%、3.8%,表明沙棘水提物對HPU的抑制效果呈時(shí)間依賴性。

圖4 孵育時(shí)間對HPU活性影響Fig.4 Effect of incubation time on HPU activities

2.5 HPU活性動(dòng)力學(xué)方程

HPU的Km和Vmax的測定及Lineweaver-Burk曲線如圖5所示。在Lineweaver-Burk圖中,在沙棘水提物存在下,隨著沙棘水提物濃度的升高,Vmax降低,而Km值并無明顯變化。由Lineweaver-Burk圖分析可知,沙棘水提物對HPU的抑制類型為可逆抑制中的非競爭性抑制,Vmax值為(0.42±0.02)mmol/(L·min),Km值為(1.26±0.10)mmol·L-1,試驗(yàn)結(jié)果表明抑制位點(diǎn)位于HPU活性中心以外的其他位點(diǎn)。

圖5 沙棘水提物抑制HPU的L-B雙倒數(shù)作圖法Fig.5 Double-reciprocal Lineweaver-Burk plot of HPU inhibition by H.rhamnoides water extract

有研究表明多酚類物質(zhì)為非底物類似物的脲酶抑制劑,可通過與HPU活性中心外的必需基團(tuán)相結(jié)合最終形成三元復(fù)合物,因不能生成產(chǎn)物以使HPU活性受到抑制。沙棘中富含多酚類物質(zhì),因此本試驗(yàn)結(jié)果表明沙棘水提物中的抑菌成分之一可能是多酚類物質(zhì)。此外,余曉丹[6]發(fā)現(xiàn)黃芩苷與野黃芩苷對HPU的抑制類型也為非競爭性抑制；PAULO等[21]研究了白藜蘆醇對HPU的抑制作用,酶動(dòng)力學(xué)結(jié)果同為非競爭性抑制。

2.6 HPU活性保護(hù)劑試驗(yàn)結(jié)果

不同位點(diǎn)保護(hù)劑對HPU活性的保護(hù)結(jié)果,以及保護(hù)劑本身對脲酶活性的影響試驗(yàn)結(jié)果見圖6。DTT對HPU活性無明顯影響,BA對脲酶活性有明顯抑制作用(P<0.05)。巰基保護(hù)劑DTT并未降低沙棘水提物對HPU活性的抑制作用,而與沙棘水提物有明顯的協(xié)同抑制作用(P<0.05)；在金屬離子保護(hù)劑BA與沙棘水提物共存時(shí)對HPU活性有明顯的抑制作用(P<0.01)。在抑制位點(diǎn)的試驗(yàn)中,本試驗(yàn)選擇了針對活性位點(diǎn)的Ni2+以及活性位點(diǎn)附近必需基團(tuán)巰基的相應(yīng)保護(hù)劑,巰基試劑的作用機(jī)理是巰基試劑與脲酶活性位點(diǎn)附近的巰基相互作用,而無機(jī)保護(hù)劑BA則通過與Ni2+配位作用阻止抑制劑與HPU的活性位點(diǎn)結(jié)合。

圖6 硫醇化合物與無機(jī)化合物對于被沙棘水提物 抑制HPU活性的影響Fig.6 Effect of thiol-containing compounds and inorganic compounds on the inhibition of HPU activity by H.rhamnoides water extract注：與未加入保護(hù)劑和沙棘提取物的空白組HPU活性比較,*表示P<0.05,差異顯著；**表示P<0.01,差異極顯著;與加入沙棘提取物的試驗(yàn)組比較,#表示P<0.05,差異顯著；##表示P<0.01,差異極顯著

針對巰基所選用的保護(hù)劑DTT并未有任何保護(hù)HPU活性的作用,這點(diǎn)同以往其他研究不同,余曉丹[6]研究表明DTT可激活被黃芩苷與野黃芩苷滅活的HPU；LU等[22]試驗(yàn)結(jié)果表明兩面針可以較好地抑制HPU,且DTT也能有效緩解其抑制作用；談麗華[23]發(fā)現(xiàn)DTT對于被黃連堿滅活的HPU有較好的激活作用,這種作用與黃連堿、HPU和DTT的孵育順序有關(guān)。試驗(yàn)過程中,考慮到沙棘提取物可能使反應(yīng)體系的pH不利于DTT發(fā)揮其作用,故反應(yīng)于pH 7.5的羥乙基哌嗪乙硫磺酸(2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid,HEPES)緩沖液中進(jìn)行。DTT未起到保護(hù)作用表明沙棘水提物抑制HPU的位點(diǎn)可能不是巰基基團(tuán),這一結(jié)果也可能與HPU是粗提液有關(guān)。對于活性中心的Ni2+保護(hù)劑BA的試驗(yàn)結(jié)果顯示,BA可與沙棘提取物協(xié)同抑制HPU的活性,與近些年來同類型研究結(jié)果一致。

2.7 沙棘水提物對HPU毒力基因表達(dá)的影響

各組HPU毒力基因mRNA的相對表達(dá)量見表2。與對照組相比,5 mg/mL沙棘水提物可使ure-α、ure-β、ure-E和ure-H基因表達(dá)出現(xiàn)明顯下降(P<0.05)。結(jié)果表明,質(zhì)量濃度為5 mg/mL的沙棘水提物可抑制HPU活性,可能是通過降低脲酶結(jié)構(gòu)基因ure-α和ure-β的表達(dá),抑制脲酶輔酶基因ure-E和ure-H。該結(jié)果與連大衛(wèi)等[9]研究廣藿香醇抑制HPU相關(guān)基因表達(dá)結(jié)果一致。

表2 沙棘水提物對HPU毒力基因mRNA相對表達(dá)量的影響Table 2 Effect of H.rhamnoides water extracts on mRNA relative expression level of HPU virulence gene

3 結(jié)論

沙棘提取物可明顯抑制HPU活性,是良好的脲酶抑制劑,其抑制類型為非競爭性抑制；抑制位點(diǎn)并非HPU活性中心的Ni2+或活性中心附近的巰基。沙棘提取物抑制脲酶活性可降低脲酶相關(guān)基因ure-α、ure-β、ure-E和ure-H的表達(dá)。沙棘提取物對H.pylori在胃內(nèi)感染定植的影響可能與其抑制脲酶活性有一定的關(guān)系,其抑菌功效可能是多酚及多糖等物質(zhì)共同作用的結(jié)果,需要進(jìn)一步研究。