短雙歧桿菌對Aβ1-42導(dǎo)致的阿爾茲海默癥小鼠腸道菌群 及代謝物的影響

朱廣素,趙建新,張灝,陳衛(wèi),王剛

(江南大學(xué) 食品學(xué)院,江蘇 無錫,214122)

阿爾茲海默癥(Alzheimer’s disease,AD)是一種復(fù)雜的進行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)疾病,主要癥狀包括淀粉樣蛋白沉積、神經(jīng)纖維纏結(jié)、記憶認(rèn)知障礙、神經(jīng)炎癥一系列神經(jīng)退行性病變[1-2]。近十年來,越來越多的研究表明,腸道菌群及其代謝產(chǎn)物通過腦腸軸之間的雙向作用,在調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的腦部功能中發(fā)揮重要作用[3-5]。多項臨床研究證實輕度認(rèn)知障礙及AD者腸道菌群結(jié)構(gòu)及組成發(fā)生改變[6-8]。此外,有研究闡述了菌群的代謝物,尤其是脂多糖、短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)、膽汁酸和氨基酸等,能夠緩解機體腦神經(jīng)失調(diào)[9-10]。

HWANG等[11]研究發(fā)現(xiàn),給輕度認(rèn)知障礙的患者膳食補充植物乳桿菌發(fā)酵的豆乳,能夠調(diào)節(jié)腸道菌群的紊亂,增加血清中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的含量,從而緩解認(rèn)知障礙；WANG等[12]發(fā)現(xiàn)甘露特鈉膠囊能夠通過重塑腸道菌群平衡、降低外周相關(guān)代謝產(chǎn)物苯丙氨酸/異亮氨酸的積累,減輕腦內(nèi)神經(jīng)炎癥,進而改善認(rèn)知障礙,達到治療AD的效果。益生菌具有調(diào)節(jié)腸道菌群失調(diào)、增強腸道免疫的作用,而精神益生菌是一類攝入后能夠給具有神經(jīng)性疾病的宿主帶來精神益處的活體微生物,能夠產(chǎn)生及遞送神經(jīng)活性物質(zhì)作用于腦腸軸,從而發(fā)揮有益作用[13]。因此,通過膳食補充益生菌等微生態(tài)制劑調(diào)節(jié)腸道菌群及其代謝產(chǎn)物成為延緩AD進程的新途徑[14]。

本研究團隊通過采集不同地區(qū)不同年齡階段的人體糞便樣品,分離得到了不同來源的短雙歧桿菌菌株；采用腦部海馬區(qū)微注射Aβ1-42蛋白的方法,建立了AD小鼠模型；通過行為學(xué)實驗篩選得到2株具有改善學(xué)習(xí)與記憶功能的菌株?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果,為評價不同菌株干預(yù)對腦部功能受損的小鼠腸道菌群多樣性、物種組成和代謝產(chǎn)物的影響,本研究采用MiSeq二代高通量測序技術(shù),對短雙歧桿菌干預(yù)后的小鼠腸道菌群的差異進行分析；同時,采用GC-MS,對小鼠糞便中SCFAs(乙酸、丙酸、丁酸)的含量進行測定。

1 材料與方法

1.1 試劑與設(shè)備

主要試劑：Aβ1-42蛋白,瑞士Bachem公司；FastDNA Spin Kit for Feces細菌基因組提取試劑盒,美國MP公司；TIANgel Mini Purification Kit膠回收試劑盒,北京天根生化科技有限公司；Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit,美國Life Technologies公司；MiSeq Reagent Kit,美國Illumina公司。

主要實驗設(shè)備：高速冷凍離心機,德國Eppendorf公司；FastPrep-24快速核酸提取儀,美國MP公司；MiSeq測序儀,美國Illumina公司；GC-MS,日本島津公司；腦立體定位儀,美國Stoelting公司；小動物氣體吸入式麻醉機,上海玉研科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實驗菌株

實驗用菌株來自于江南大學(xué)食品生物技術(shù)中心菌種保藏中心(Culture Collection of Food Microorganism,CCFM),菌株具體信息及來源見表1。

表1 菌株信息表Table 1 Strains information

1.3 實驗動物

C57BL/6 J雄性小鼠,購于南京大學(xué)模式動物研究所,飼養(yǎng)于江南大學(xué)實驗動物中心[許可證編號為SYXK (SU) 2016—0011]。動物適應(yīng)1周后,進行腦部微注射手術(shù),術(shù)后隨機分為4組,每組8只,不限制飲食飲水。飼養(yǎng)環(huán)境溫度為20～25 ℃,環(huán)境濕度為50%～60%,每12 h進行光暗交替。

1.4 實驗方法

1.4.1 菌株的培養(yǎng)及菌懸液的制備

將待活化的菌株以2%的接種量接種于含 0.5 g/LL-半胱氨酸鹽酸鹽的MRS培養(yǎng)基中,置于37 ℃的厭氧工作站中培養(yǎng)20 h?；罨?代后,將培養(yǎng)好的菌液在4 ℃下,以8 000×g的轉(zhuǎn)速離心15 min,無菌PBS清洗菌體2遍,調(diào)整活菌數(shù)為5×1010CFU/mL,用體積分?jǐn)?shù)30%的甘油溶液重懸后,于-80 ℃保藏備用。灌胃前將菌體用等體積無菌PBS緩沖液清洗后,用100 g/L的脫脂乳溶液稀釋10倍,每天上午同一時間灌胃1次。

1.4.2 Aβ1-42的溶解及寡聚體的制備

參照J(rèn)AN等[15]的方法,并按照說明書的要求溶解Aβ1-42：將1 mg Aβ1-42粉末于8 000×g室溫離心30 s,加入200 μL 0.1 mol/L 的氨水溶液 (1 mg/mL,pH>9),輕輕振蕩溶解至5 μg/μL的工作液,分裝保存于-20 ℃冰箱。使用前稀釋至2 μg/μL,4 ℃孵育24 h,制備成Aβ寡聚體。

1.4.3 腦部微注射手術(shù)方法[16]

小鼠適應(yīng)1周后,經(jīng)3%的異氟烷誘導(dǎo)麻醉后,以1%的濃度維持麻醉。將小鼠頭頂去毛,用75%酒精消毒后,固定于腦立體定位儀上。暴露頭骨,醫(yī)用棉簽取雙氧水擦拭顱骨以暴露其前囪的交錯十字區(qū),找到前囪位置,做好標(biāo)記。參照小鼠腦立體定位圖譜,于前囪后2.0 mm,中線旁開1.8 mm處,用顱骨鉆輕輕打孔。5 μL微量進樣器自顱骨表面垂直向下進針2.0 mm,注射樣品量為2 μL,進樣速度為0.2 μL/min。模型組和益生菌干預(yù)組注射寡聚肽Aβ1-42,質(zhì)量濃度為2 μg/μL,假手術(shù)組注射等量無菌PBS。注射后,留針5 min,后緩慢退針。

1.4.4 動物分組與處理條件

動物實驗方案見表2。動物實驗所涉及的實驗操作由江南大學(xué)動物實驗倫理委員會審批,倫理編號為JN.No20190415c0800618(74)。

表2 動物實驗方案Table 2 Protocol of animal experiment

1.4.5 糞便收集及腸道菌群分析

在實驗結(jié)束前,收集小鼠糞便,按照試劑盒的步驟提取小鼠糞便中細菌基因組。細菌16S rDNA的擴增,擴增產(chǎn)物的純化、定量及等質(zhì)量混樣,文庫構(gòu)建及上機測序等流程參考先前的研究[17]。

測序完成后,在QIIME平臺進行物種分類注釋,使用MicrobiomeAnalyst[18]在線網(wǎng)站對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和功能分析。

1.5 糞便中SCFAs的測定

用GC-MS檢測小鼠糞便中主要的SCFAs(乙酸、丙酸、丁酸)的含量,GC-MS的具體條件參照參考文獻[19]。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(mean±SEM)表示。使用Graphpad Prism 8繪圖,并對實驗數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析。model與control組相比具有顯著性用#表示,NMG、MY與model組相比具有顯著性用*表示,P<0.05代表具有顯著性差異；*或#代表P<0.05,**或##代表P<0.01,***或###代表P<0.001。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠腸道菌群的多樣性

2.1.1 α多樣性分析

測序共產(chǎn)生3 311 638條高質(zhì)量的16S rDNA的V3～V4區(qū)序列；按照參考序列聚類及97%的相似性劃分OTU,共產(chǎn)生221 593個OTU；對所有下機數(shù)據(jù)進行抽平及標(biāo)準(zhǔn)化后用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

圖1為當(dāng)前測序量下各組樣品的稀釋曲線,結(jié)果表明,隨著測序深度的增加,微生物的種類已接近飽和,故該測序深度已足夠滿足對糞便中主要細菌分布的探究。所有樣品的Shannon指數(shù)、Simpson 指數(shù)的結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明,model模型組與control對照組相比,α多樣性顯著降低。灌胃短雙歧桿菌NMG與MY均提高了Shannon指數(shù)及Simpson指數(shù)；其中,NMG組的顯著性更高,與control組水平相當(dāng),與測序的OTU結(jié)果相吻合。

圖1 不同組別小鼠腸道菌群的稀釋曲線Fig.1 Rarefaction analysis of the gut microbiota in different groups

a-Shannon指數(shù)；b-Simpson指數(shù)圖2 短雙歧桿菌對代謝綜合征小鼠α多樣性指數(shù)的影響Fig.2 Effects of B.breve on α diversity index in Aβ-injected mice

2.1.2 β多樣性分析

基于Bray-Curtis距離對樣品進行主坐標(biāo)分析(principal co-ordinates analysis,PCoA)結(jié)果如圖3所示。

圖3 基于Bray-Curtis距離對樣品進行主坐標(biāo)分析Fig.3 Principal coordinates analysis (PCoA) plots based on Bray-Curtis distance

結(jié)果顯示,不同顏色代表的組別可以很好的區(qū)分,僅PC1和PC2兩個坐標(biāo)軸形成的平面展示了樣品間幾乎一半的差異,表明不同的干預(yù)方式顯著改變了小鼠腸道菌群的結(jié)構(gòu),置換多元方差分析(PERMANOVA)表明各組間存在顯著差異(P<0.001)。

PC1可解釋樣品間所有差異的21.5%,將control組與其他腦部微注射組完全分開,表明PC1反映的條件可能是腦部注射Aβ1-42蛋白的影響；PC2可解釋樣品間所有差異的18.3%,將短雙歧桿菌干預(yù)組與model組和control組分開,表明PC2反映的可能是不同干預(yù)方式對小鼠菌群結(jié)構(gòu)的影響。

2.2 小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)

2.2.1 短雙歧桿菌對小鼠腸道菌群門水平相對豐度的影響

對小鼠糞便的腸道菌群組成進行分析,發(fā)現(xiàn)在門水平(圖4),主要由Firmicutes、Bacteroidetes、Deferribacteries、Proteobacteria和Actinobacteria組成,其中Bacteroidetes和Firmicutes門的相對豐度最高。

從圖5可知,與control組相比,model組Firmicutes和Proteobacteria的相對豐度顯著降低,而Bact-eroidetes和Actinobacteria豐度明顯升高；而NMG和MY灌胃后能部分逆轉(zhuǎn)菌群的紊亂；同時,2株短雙歧桿菌干預(yù)顯著提高了Tenericutes的相對豐度；此外,TM7在NMG組小鼠腸道中的豐度最高,且與control和model組相比,均具有統(tǒng)計學(xué)差異。

圖4 不同組別小鼠腸道菌群在門水平上的組成Fig.4 Composition of gut microbiota in different groups of mice at phylum level

a-Firmicutes;b-Bacteroidetes;c-TM7;d-Actinobacteria;e-Proteobacteria;f-Tenericutes圖5 不同組別小鼠菌群主要門的相對豐度的變化Fig.5 Relative abundance of dominant phylum in different groups

2.2.2 短雙歧桿菌對小鼠腸道菌群屬水平相對豐度的影響

在屬水平上,進一步分析小鼠腸道菌群的組成(圖6),所有樣品中共檢測179個屬。Firmicutes門作為小鼠腸道中的優(yōu)勢菌群,共包含了76個屬。

采用隨機森林(random forest)對所有小鼠樣品屬水平分析(圖7),共檢出15個特征屬,包括Anaeroplasma、Oscillospira、Dehalobacterium、Coprococcus、Rhodococcus、Dorea、Allobaculum、Anaerovorax、Bifidobacterium、Pseudomonas、Mucispirillum、Akkermansia、Adlercreutzia、Roseburia、Lactobacillus,圖8所示為特定屬的相對豐度的變化。

與control組相比,Aβ1-42注射使小鼠腸道中Oscillospira和Desulfovibrio的含量下降,而Mucispirillum和Coprococcus的豐度顯著升高。NMG組小鼠腸道中

圖6 不同組別小鼠腸道菌群在屬水平上的組成Fig.6 Composition of gut microbiota in different groups of mice at genus level

Allobaculum、Oscillospira和Desulfovibrio的豐度較高,Mucispirillum和Bifidobacterium的豐度較低,與正常組相當(dāng)；Akkermansia和Coprococcus在MY干預(yù)組小鼠腸道中的相對含量明顯高于其他組別,且具有統(tǒng)計學(xué)差異；Lactobacillus在各組小鼠中的含量無明顯變化。短雙歧桿菌干預(yù)顯著提高了小鼠腸道中Allobaculum、Oscillospira和Desulfovibrio的相對豐度,同時降低了小鼠腸道中Mucispirillum的相對豐度。

圖7 隨機森林鑒定的差異屬Fig.7 Significant features identified by random forest classification

a- Lactobacillus;b- Allobaculum;c- Mucispirillum;d- Oscillopira;e- Akkermansia;f- Bifidobacterium;g-Coprococcus;h-Desulfovibrio圖8 不同組別小鼠主要屬的相對豐度變化Fig.8 Relative abundance of dominant genus in different groups

2.2.3 短雙歧桿菌對小鼠腸道菌群種水平相對豐度的影響

進一步采用采用線性判別分析(linear discriminant analysis effect size,LEfSe)的方法,探究各組菌群組成在種水平上的差異,發(fā)現(xiàn)Bifidobacteriumadolescentis、Ruminococcusgnavus、Lactobacillusreuteri、Bifidobacteriumpseudolongum、Mucispirillumschaedleri、Akkermansiamuciniphila等為差異種,圖9所示為差異種的相對豐度變化。

與control組相比,model組小鼠腸道中B.adolescentisde的豐度顯著降低、B.pseudolongum的豐度顯著升高,NMG和MY干預(yù)逆轉(zhuǎn)了2種菌豐度的變化；值得注意的是,與model組相比,NMG組小鼠腸道中L.reuteri的豐度明顯升高,M.schaedleri的豐度顯著降低；此外,A.muciniphilas在MY組小鼠中的含量高于其他組別,model組豐度最低。

2.3 短雙歧桿菌對SCFAs的調(diào)控

為進一步探討短雙歧桿菌干預(yù)對小鼠腸道菌群主要代謝物的影響,對小鼠糞便中SCFAs的含量進行分析,結(jié)果如圖10所示。與control組相比,Aβ1-42蛋白注射導(dǎo)致小鼠糞便中乙酸和丁酸的含量顯著降低；補充NMG和MY均顯著提高了糞便中乙酸和丁酸的含量；雖然丙酸含量在control組與model組無顯著變化,但補充MY使丙酸含量顯著升高,且高于control組。

a-Bifidobacterium adolescentis;b-Ruminococcus gnavus;c-Akkermansia muciniphila;d-Bifidobacterium pseudolongum; e-Lactobacillus reuteri;f-Mucispirillum schaedleri圖9 不同組別小鼠差異種的相對豐度的變化Fig.9 Relative abundance of specific species in different groups

a-乙酸；b-丙酸；c-丁酸圖10 短雙歧桿菌對糞便中乙酸、丙酸和丁酸含量的影響Fig.10 Effects of B.breve on levels of fecal acetate,propionate and butyrate

3 討論

淀粉樣蛋白沉積是AD的最核心病理學(xué)表征,其在腦部堆積形成斑塊會引發(fā)一系列的神經(jīng)炎癥,通過腦腸軸之間的雙向作用,導(dǎo)致腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[20-21]。近年來,越來越多的研究表明,腸道菌群紊亂與AD的發(fā)展相關(guān),但其在延緩AD進程中發(fā)揮的作用仍不明確[22]。本研究通過海馬微注射Aβ1-42蛋白建立了AD小鼠模型[23],采用MiSeq高通量測序及GC-MS技術(shù),深入分析了2株人體來源的短雙歧桿菌干預(yù)對AD小鼠腸道菌群及其代謝物的影響。

對下機數(shù)據(jù)進行種內(nèi)多樣性分析,發(fā)現(xiàn)每組小鼠糞便樣品的稀釋曲線(豐富度曲線)均已趨于飽和,表明測序深度已基本覆蓋到樣品中所有的物種。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)綜合表示菌群多樣性和豐富度,補充短雙歧桿菌NMG和MY可顯著提高小鼠菌群的多樣性。主坐標(biāo)分析結(jié)果表明,Aβ1-42蛋白注射顯著改變了小鼠的菌群結(jié)構(gòu),短雙歧桿菌干預(yù)雖然能夠在一定程度上調(diào)節(jié)腸道菌群的紊亂,但并不能完全逆轉(zhuǎn)。

腸道菌群在其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病(如帕金森綜合癥)中發(fā)揮的作用雖已逐步被闡明,但在AD中,腸道菌群與腦部功能障礙的聯(lián)系尚不清楚[24]。LIU等[7]通過對輕度認(rèn)知障礙和AD患者的腸道菌群進行對比,證實了AD發(fā)展的不同階段菌群差異較大；比如,Bacteroidetes在AD發(fā)展早期豐度增加,隨著認(rèn)知障礙的加重,其豐度轉(zhuǎn)而降低。同樣在本研究中,Bacteroidetes的在model組含量最少,提示模型處于AD的早期階段。此外,補充NMG能逆轉(zhuǎn)model組升高的Actinobacteria的相對豐度,該變化主要歸功于Actinobacteria最豐富的屬Bifidobacterium。

在屬水平上,LIU等[7]發(fā)現(xiàn)Ruminococcus屬的相對豐度與AD患者認(rèn)知評估量表中命名和延遲回憶的評分成正相關(guān)；而Bacteroides屬的相對豐度與計算力的評分成正相關(guān)。本研究進一步在屬水平上分析不同樣品的物種組成,發(fā)現(xiàn)Bifibobacterium屬在各組差異中起關(guān)鍵性作用。Bifibobacterium屬的多種細菌被用作益生菌,以飲食干預(yù)的形式來緩解消化系統(tǒng)疾病、代謝類疾病和神經(jīng)退行性疾病。TIAN等[24]研究發(fā)現(xiàn)補充長雙歧桿菌CCFM687可以緩解慢性應(yīng)激導(dǎo)致的早期抑郁癥；臨床研究表明飲食補充雙歧桿菌可緩解輕度認(rèn)知障礙和重度癡呆患者的認(rèn)知障礙[25-26]。先前的研究曾證實了Bifibobacterium在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病(包括抑郁癥、帕金森綜合癥和孤獨癥等)中的豐度顯著升高[27],與前人的研究一致,model組小鼠腸道中Bifidobacterium的含量明顯升高。

考慮到同屬不同種的細菌對同一疾病狀態(tài)的作用效果存在差異,深入探索短雙歧桿菌干預(yù)在種水平上對AD小鼠腸道菌群的差異尤為必要。LEfSe分析發(fā)現(xiàn)B.adolescentis、R.gnavus、L.reuteri、B.pseudolongum、M.schaedleri、A.muciniphila是組間差異較大的種。BUFFINGTON等[28]研究發(fā)現(xiàn)補充羅伊氏乳桿菌可恢復(fù)社交行為,改善腹側(cè)被蓋區(qū)突出可塑性,反轉(zhuǎn)自閉癥癥狀。作為小鼠腸道雙歧桿菌中的優(yōu)勢物種,與B.pseudolongum生理功能相關(guān)的報道仍較少。TIAN等[27]通過抑郁癥小鼠模型,發(fā)現(xiàn)B.pseudolongum的豐度與結(jié)腸5-HTP的含量呈負相關(guān)。本研究表明,補充短雙歧桿菌可以提高小鼠腸道中有益菌B.adolescentis、L.reuteri和A.muciniphila的含量。目前,在AD動物模型和臨床實驗中,暫未見文獻報道腸道菌群在種水平上的變化；且腸道菌群在不同分類水平上變化與AD的關(guān)系仍局限于現(xiàn)象和關(guān)聯(lián)性階段,深入探討特定菌群豐度的變化緩解AD的機制在未來研究中仍是一項大的挑戰(zhàn)。

除腸道菌群自身對腦部功能的調(diào)節(jié)以外,其代謝產(chǎn)物同樣對宿主大腦認(rèn)知和學(xué)習(xí)功能發(fā)揮著重要作用[9]。WANG等[11]通過建立動物模型,發(fā)現(xiàn)新型AD治療藥物GV-971通過重塑腸道菌群平衡,降低外周相關(guān)代謝產(chǎn)物苯丙氨酸/異亮氨酸的積累,減輕腦內(nèi)神經(jīng)炎癥,進而改善認(rèn)知障礙,達到治療AD的效果；SCFAs調(diào)節(jié)AD的機制較為復(fù)雜,目前已被證實的是SCFAs能夠調(diào)節(jié)血腦屏障的通透性,通過腸腦軸刺激神經(jīng)遞質(zhì)的產(chǎn)生,繼而發(fā)揮強大的抗炎作用[29]。本結(jié)果顯示,Aβ1-42蛋白注射的小鼠糞便中乙酸和丁酸的含量明顯降低,而灌胃短雙歧桿菌MY使腸道中乙酸、丙酸和丁酸的含量均得到較為顯著的升高,與產(chǎn)SCFAs菌株Coprococcusspp.、Akkermansiamuciniphila豐度的增加相一致,從而表明短雙歧桿菌MY可能通過對腸道代謝產(chǎn)物SCFAs的調(diào)節(jié)來改善認(rèn)知功能。

4 結(jié)論

本研究通過對AD小鼠糞便樣品進行測序,發(fā)現(xiàn)灌胃短雙歧桿菌能夠提高AD小鼠菌群的多樣性,且可在一定程度上調(diào)節(jié)菌群結(jié)構(gòu)的紊亂,提高大鼠腸道中產(chǎn)SCFAs菌株Coprococcusspp.、L.reuteri和A.muciniphila的相對豐度；短雙歧桿菌尤其是MY可有效調(diào)控腸道內(nèi)3種SCFAs的水平,這與其在調(diào)節(jié)特定菌群豐度的變化的作用相吻合。此外,本研究也為通過膳食補充益生菌來靶向調(diào)控菌群-SCFAs-大腦,從而改善大腦認(rèn)知功能、延緩AD進程提供了新思路。