黑曲霉轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的優(yōu)化及重組菌株高效篩選

李岑,劉松*,堵國(guó)成

1(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué)),江蘇 無(wú)錫,214122) 2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無(wú)錫,214122)

在傳統(tǒng)發(fā)酵食品中,黑曲霉(Aspergillusniger)具有悠久的應(yīng)用歷史。美國(guó)食品與藥物管理局(Food and Drug Administration,FDA)已認(rèn)定黑曲霉生產(chǎn)的多種酶制劑和有機(jī)酸為公認(rèn)安全(Generally Regarded As Safe,GRAS)等級(jí)[1]。黑曲霉在工業(yè)生產(chǎn)中除了具有食品安全性的特性,同時(shí)還具備高生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)性、極端環(huán)境耐受性、強(qiáng)發(fā)酵魯棒性等優(yōu)點(diǎn)[2]。GB 2760—2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中,44%的酶制劑使用黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn),包括應(yīng)用于烘培食品中的天冬酰胺酶(asparaginase,ASN,EC,3.5.1.1)[3]。為了進(jìn)一步開發(fā)黑曲霉細(xì)胞工廠用于表達(dá)重組蛋白,分子手段理性改造黑曲霉宿主成為研究熱點(diǎn)[4]。

黑曲霉與大腸桿菌、枯草芽胞桿菌等工業(yè)表達(dá)宿主相比,生長(zhǎng)周期更長(zhǎng),生長(zhǎng)和生殖方式更復(fù)雜。這些生理特性使黑曲霉分子操作更加耗時(shí)耗力,且菌株之間也存在轉(zhuǎn)化方式和條件的差異[5]。轉(zhuǎn)化效率低下不僅消耗大量的勞力和物力,而且阻礙黑曲霉菌株的進(jìn)一步開發(fā)。CRISPR-Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated protein(Cas))基因編輯系統(tǒng)在黑曲霉中的應(yīng)用需要以高效的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)為前提。因此,構(gòu)建高效的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)對(duì)于黑曲霉菌株開發(fā)至關(guān)重要。目前,電轉(zhuǎn)化、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法(Agrobacteriummediated transformation,AMT)和聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法(Agrobacterium-mediated and PEG-mediated transformation,PMT)是黑曲霉中常用的轉(zhuǎn)化方法[6]。3種轉(zhuǎn)化法中,以電轉(zhuǎn)化最簡(jiǎn)便和快捷,黑曲霉MGG029-△aamA電轉(zhuǎn)化能產(chǎn)生50個(gè)轉(zhuǎn)化子/μg DNA[7],然而,絲狀真菌電轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化效率通常較低[8]。AMT利用農(nóng)桿菌與黑曲霉共培養(yǎng),使轉(zhuǎn)化步驟和周期增加,該方法雖然能提高外源基因同源重組的效率[9],但外源基因在基因組上形成的拷貝數(shù)低[10],黑曲霉CICC2462[11]和CICC2169[12]使用AMT進(jìn)行重組蛋白表達(dá)。PMT在黑曲霉中的應(yīng)用最多,實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)菌株N402及其衍生菌株均使用PMT轉(zhuǎn)化[13]。原生質(zhì)體的制備是提高PMT效率的關(guān)鍵[6],通過優(yōu)化菌絲酶解的體系和條件能提高原生質(zhì)體濃度[14]。因此,篩選適合宿主的轉(zhuǎn)化方法,并系統(tǒng)地優(yōu)化轉(zhuǎn)化關(guān)鍵步驟,提高轉(zhuǎn)化效率有利于CRISPR-Cas基因編輯系統(tǒng)在黑曲霉中的應(yīng)用。

CRISPR-Cas基因編輯系統(tǒng)在不缺失非同源重組基因kusA的黑曲霉菌株中,也能進(jìn)行高效的同源重組[15]。黑曲霉轉(zhuǎn)化子的純化步驟是耗時(shí)的[16],陽(yáng)性轉(zhuǎn)化的獲得約需要2周時(shí)間[15]。為了快速篩選里氏木霉陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子,利用目的基因與綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)融合,再結(jié)合流式細(xì)胞儀(flow cytometer,FCM)分選技術(shù),已構(gòu)建了基于熒光強(qiáng)弱快速篩選高表達(dá)目標(biāo)基因的單孢子平臺(tái)[17]。因此,以GFP為報(bào)告基因,利用FCM可實(shí)現(xiàn)熒光孢子的快速分選。

本研究針對(duì)黑曲霉AG11,考察電轉(zhuǎn)化、AMT和PMT對(duì)外源基因轉(zhuǎn)化效率的影響,系統(tǒng)優(yōu)化PMT中的關(guān)鍵步驟,以期顯著提高轉(zhuǎn)化效率。利用CRISPR-Cas9技術(shù),將融合GFP的ASN基因整合至黑曲霉AG11糖化酶位點(diǎn),并通過流式細(xì)胞儀分選表達(dá)ASN的孢子。研究結(jié)果將為黑曲霉基因編輯提供重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

黑曲霉AG11(CCTCC M 2018881)、大腸桿菌JM109、米曲霉NRRL3488、質(zhì)粒pAN7-1、pUC57和pET-22b(+)/S1-gfp[18],實(shí)驗(yàn)室保存。質(zhì)粒pCAMBIA1301編碼潮霉素基因,淼靈質(zhì)粒平臺(tái)；pFC332(Addgene質(zhì)粒#87845)編碼密碼子優(yōu)化的釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)Cas9基因和潮霉素基因,Addgene。

1.1.2 試驗(yàn)試劑

PrimerSTAR Hs DNA聚合酶、Yatalase、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser)、定量PCR試劑盒(SYBR Premix Ex TaqTMTli RNase H Plus),TaKaRa公司；溶解酶,廣東省微生物菌種保藏中心；幾丁質(zhì)酶、溶壁酶、葡萄糖醛酸酶,Sigma公司；潮霉素、質(zhì)粒提取試劑盒,上海生工公司；ClonExpress Ultra一步克隆試劑盒,南京諾唯贊公司；植物基因組提取試劑盒、植物RNA總提取試劑盒,天根公司；其他常規(guī)試劑及藥品為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分裝。

1.1.3 培養(yǎng)基與緩沖液

LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨 10,酵母提取物 5,NaCl 10。篩選平板中添加50 μg/mL硫酸卡那霉素或者100 μg/mL氨芐青霉素。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯 200,葡萄糖 20。

ME培養(yǎng)基(g/L)：蔗糖 20,麥芽提取物 5,ZnSO4·7H2O 0.001,CuSO4·5H2O 0.000 5,pH 5.5。

改良察氏培養(yǎng)基(modified Czapek-Dox,MCD)(g/L)：蔗糖 20,麥芽糖 10,NaNO33,K2HPO41,MgSO40.5,KCl 0.5,FeSO40.01。作為轉(zhuǎn)化平板時(shí)蔗糖添加量為342.3 g。

種子培養(yǎng)基(g/L)：玉米漿 30、精制黃豆粉 20、玉米淀粉 20、葡萄糖 5,pH 6。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：玉米漿 30、精制黃豆粉 20、玉米淀粉 20、麥芽提取物 30、天冬酰胺 10,pH 6。

以上固體培養(yǎng)基中添加15～20 g/L的瓊脂。

KMC緩沖液：50 mmol/L CaCl2,20 mmol/L 2-(N-嗎啡啉)乙磺酸。

STC緩沖液：1.2 mol/L山梨糖醇,10 mmol/L CaCl2,10 mmol/L Tris,pH 7.5～8。

PEG緩沖液：250 g/L PEG,50 mmol/L CaCl2,10 mmol/L Tris,pH 7.5～8。

磷酸鹽緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)(g/L)：NaCl 8,KCl 0.2,Na2HPO41.44,KH2PO40.24,pH 7.4。

磷酸鹽緩沖液：0.1 mol/L KH2PO4-K2HPO4,pH 7.5。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 轉(zhuǎn)化質(zhì)粒和片段的構(gòu)建

PCR片段使用ClonExpress Ultra一步克隆試劑盒組裝后在大腸桿菌JM109中進(jìn)行構(gòu)建。根據(jù)表1中的引物,以質(zhì)粒pAN7-1為模板用引物HyhB-F/HyhB-R擴(kuò)增潮霉素基因表達(dá)框片段用于轉(zhuǎn)化AG11。

如圖1-b所示,由煙曲霉u3 snRNA啟動(dòng)子和終止子[19]、tRNAGly[19]與靶向glaA基因的gRNA組成的gRNA表達(dá)框由南京金斯瑞合成并克隆至pUC57載體,以此質(zhì)粒為模板,用引物P57-F/P57-R進(jìn)行g(shù)RNA表達(dá)框擴(kuò)增用于黑曲霉轉(zhuǎn)化。靶向glaA的目標(biāo)序列為CATCCTGAATAACATCGGGG。

以黑曲霉AG11基因組為模板用引物Uppy-F/Uppy-R和Dopy-F/Dopy-R分別擴(kuò)增pyrG基因(GeneID：4985706)上游和下游片段。以pUC57質(zhì)粒為模板,用引物Tp57-F/Tp57-R擴(kuò)增載體片段,以上3個(gè)片段通過一步克隆試劑盒組裝成含有pyrG敲除片段的質(zhì)粒。以此質(zhì)粒為模板,pyrG敲除片段通過引物對(duì)P57-F/P57-R擴(kuò)增用于轉(zhuǎn)化。

圖1 黑曲霉CRISPR-Cas系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒/片段Fig.1 Transformation plasmid/fragments of CRISPR-Cas system into A.niger

以黑曲霉AG11基因組為模板用引物對(duì)Pgla-F/Pgla-R、Tgla-F/Tgla-R、A1-F/A1-R、A2-F/A2-R和A3-F/A3-R分別擴(kuò)增GlaA啟動(dòng)子片段(包括GlaA信號(hào)肽,SPgla)、GlaA終止子片段、ASN基因ASN-1(GeneID：4989881)、ASN-2(GeneID：37096104)和ASN-3(GeneID：37104124)。以米曲霉NRRL3488基因組為模板用引物Aopy-F/Aopy-R擴(kuò)增pyrG表達(dá)框(AopyrG)。以pET-22b(+)/S1-gfp為模板用引物GFP-F/GFP-R擴(kuò)增GFP片段。以pUC57質(zhì)粒為模板用引物Tp57-F/Tp57-R擴(kuò)增載體片段。以上片段經(jīng)一步克隆試劑盒如圖1-c中供體DNA片段順序進(jìn)行組裝得到3個(gè)攜帶不同ASN基因的質(zhì)粒。以這些質(zhì)粒為模板用Tp57-F/Tp57-R擴(kuò)增供體DNA片段用于轉(zhuǎn)化黑曲霉。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.2 黑曲霉轉(zhuǎn)化

在MCA平板中分別添加50、100、150、200、250、300、350 μg/mL潮霉素和0.5、1、1.5、2、2.5 mg/mL的5-氟乳清酸對(duì)AG11菌株進(jìn)行梯度抗性耐受性試驗(yàn)。黑曲霉AG11于PDA平板30 ℃培養(yǎng)4～7 d后收集新鮮孢子。電轉(zhuǎn)化使用生長(zhǎng)4 d的孢子,2 h萌發(fā)后在5 kV/cm的電場(chǎng)強(qiáng)度[7]中與10 μg潮霉素基因表達(dá)框片段進(jìn)行轉(zhuǎn)化。使用凍融法將質(zhì)粒pCAMBIA1301轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌AGLI,農(nóng)桿介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的條件為使用OD600為0.9～1.0的農(nóng)桿菌陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子與生長(zhǎng)5 d的黑曲霉AG11孢子,23 ℃共培養(yǎng)48 h后轉(zhuǎn)膜[20-21]。生長(zhǎng)7 d的新鮮孢子接種于裝有10% ME培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中培養(yǎng)32 h,收集0.1 g菌絲用于原生質(zhì)體制備。菌絲在復(fù)合酶液(5 mg/mL溶壁酶、0.2 U/mL幾丁質(zhì)酶和460 U/mL葡萄糖醛酸酶[14]溶于10 mL KMC緩沖液)30 ℃,120 r/min振蕩酶解2 h后,使用過濾膜進(jìn)行過濾,離心棄上清液后用10 mL預(yù)冷的STC洗滌2次原生質(zhì)體。100 μL原生質(zhì)體與10 μg轉(zhuǎn)化片段/質(zhì)粒在PEG緩沖液中混勻,冰上放置25 min后,再加入PEG緩沖液于室溫倒至含抗性的轉(zhuǎn)化MCA平板中[14]。轉(zhuǎn)化平板置于30 ℃培養(yǎng)箱5～7 d后挑取單菌落進(jìn)行轉(zhuǎn)化子傳代純化。黑曲霉菌株基因組參照植物基因組提取試劑盒說明書進(jìn)行。以轉(zhuǎn)化子基因組為模板用相應(yīng)的驗(yàn)證引物對(duì)(表1)擴(kuò)增目標(biāo)基因序列,并在蘇州金唯智公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

在以上初始的PMT基礎(chǔ)上進(jìn)行轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化,優(yōu)化原生質(zhì)體制備的條件依次包括使用酶的種類(初始條件中的復(fù)合酶和Yatalase、溶解酶進(jìn)行比較)、酶解溫度(20～40 ℃)、酶解時(shí)間(0.5～3.5 h)、酶解緩沖液pH(3～8)、菌絲干重(0.2～1.4 g)、菌絲生長(zhǎng)時(shí)間(24～84 h)和菌絲球直徑(0.1～0.5 cm)。PMT過程優(yōu)化的條件包括PEG的種類(PEG 2 000、4 000、6 000和8 000)和Ca2+濃度(10～50 mmol/L)。

1.2.3 FCM分選黑曲霉單孢子

使用PBS洗下MCD轉(zhuǎn)化平板上生長(zhǎng)5 d的黑曲霉孢子,使用膜過濾后離心收集孢子,用2 mL PBS重懸2次,稀釋孢子液OD至0.3～0.5上FCM進(jìn)行熒光檢測(cè)。AG11的孢子懸液樣品作為陰性對(duì)照,樣品由FITC-Log通道檢測(cè)。預(yù)先在48孔板中加入2 mL固體MCD培養(yǎng)基,熒光信號(hào)強(qiáng)的單孢子被分選入單獨(dú)的孔中,分選結(jié)束后孔板置于30 ℃培養(yǎng)4～6 d。

1.2.4 黑曲霉搖瓶發(fā)酵

取48孔板單孔中黑曲霉的孢子涂布于PDA平板30 ℃培養(yǎng)7 d制備孢子懸液,接種500 μL的107個(gè)/mL新鮮孢子菌懸液于含有10%種子液培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中。發(fā)酵24 h后以10%的接種量轉(zhuǎn)接至含有30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基250 mL搖瓶中發(fā)酵48 h進(jìn)行目的基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析；發(fā)酵72 h測(cè)定ASN酶活力。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

黑曲霉48 h發(fā)酵液離心棄上清液,菌體用PBS沖洗2次,離心收集菌體用液氮研磨至細(xì)粉狀,參照植物RNA提取試劑盒說明書提取RNA。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以相應(yīng)菌株的cDNA為模板,使用引物對(duì)GF-RT-F/GF-RT-R和A3-RT-F/A3-RT-R分別對(duì)GFP和ASN-3基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析,操作步驟參照試劑盒說明書。

1.2.6 ASN酶活力測(cè)定

取發(fā)酵上清液100 μL與200 μL天冬酰胺(0.15 mol/L)、900 μL磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L)混合,37 ℃孵育30 min,用Nessler試劑測(cè)定氨的釋放量[22]。ASN酶活性單位定義為:在測(cè)定條件下1 min釋放1 μmol/L氨的酶量。菌絲液氮研磨破碎后用于胞內(nèi)酶活力測(cè)定[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)化方法對(duì)黑曲霉AG11轉(zhuǎn)化效率的影響

抗性結(jié)果表明,潮霉素對(duì)AG11的最小抑制質(zhì)量濃度為300 μg/mL,而5-氟乳清酸對(duì)AG11的致死質(zhì)量濃度為2 mg/mL。通過以上濃度選定轉(zhuǎn)化平板中抗性的添加量。

黑曲霉的3種主要轉(zhuǎn)化方法包括電轉(zhuǎn)化法、AMT和PMT[6]。利用這3種方法分別將潮霉素基因轉(zhuǎn)入AG11,對(duì)比AG11中的轉(zhuǎn)化效率和外源基因的遺傳穩(wěn)定性(圖2)。

圖2 三種轉(zhuǎn)化法在黑曲霉AG11中的轉(zhuǎn)化效率對(duì)比Fig.2 Comparison of transformation efficiency of three transformation methods in A.niger AG11

如圖2所示,AMT和PMT獲得了轉(zhuǎn)化子,而多次電轉(zhuǎn)均未在抗性平板上獲得轉(zhuǎn)化子。將AMT和PMT初級(jí)轉(zhuǎn)化平板上所得轉(zhuǎn)化子經(jīng)過3輪的傳代純化后,檢驗(yàn)外源基因的傳代穩(wěn)定性。結(jié)果顯示,潮霉素抗性片段在PMT產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子中穩(wěn)定性良好,而在農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化子中丟失嚴(yán)重,假陽(yáng)性高。因此,選擇PMT用于AG11的轉(zhuǎn)化。由于PMT產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子較少,轉(zhuǎn)化效率仍需提高用于CRISPR-Cas9系統(tǒng)在AG11中的構(gòu)建。

2.2 PMT的系統(tǒng)優(yōu)化

制備原生質(zhì)體是進(jìn)行高效PMT的關(guān)鍵步驟[10]。酶制劑[10]和菌絲體的生長(zhǎng)狀態(tài)對(duì)原生質(zhì)體的釋放有顯著的影響。因此,本研究從影響酶制劑活性的因素(酶的種類、溫度、時(shí)間和酶解緩沖液pH)和黑曲霉菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)的因素(菌絲生長(zhǎng)時(shí)間、干重和菌絲球直徑)對(duì)原生質(zhì)體制備的條件進(jìn)行優(yōu)化。

如圖3-a所示,在初始轉(zhuǎn)化條件下,對(duì)比酶制劑酶解效果的差異,Yatalase釋放最多的原生質(zhì)體,比復(fù)合酶釋放的原生質(zhì)體個(gè)數(shù)提高了約9倍,達(dá)9×105/mL。由于初始的酶解溫度和緩沖液pH處于較優(yōu)的狀態(tài),因此,優(yōu)化這2個(gè)因素原生質(zhì)體濃度無(wú)顯著提升(圖3-b、圖3-c)。如圖3-d所示,酶解時(shí)間延長(zhǎng)至2.5 h使原生質(zhì)體釋放量增加,其濃度大于106/mL使轉(zhuǎn)化效率得到明顯提升。但是,酶解時(shí)間過長(zhǎng)(>3 h)會(huì)導(dǎo)致原生質(zhì)體在酶解液中破裂,應(yīng)及時(shí)處理酶解好的原生質(zhì)體。10 mL酶解液的適宜添加量為0.8～1 g菌絲,較初始條件約提高8.3～8.9倍,最高達(dá)8.9×106/mL(圖3-e)。菌絲生長(zhǎng)至48～72 h適于制備原生質(zhì)體(圖3-f),而早期的原生質(zhì)體表現(xiàn)出更高的轉(zhuǎn)化效率和活力。最后,菌絲的直徑也會(huì)影響原生質(zhì)體的制備效率,直徑大(0.3～0.5 cm)松散的菌絲球比直徑小(0.1～0.2 cm)緊實(shí)的菌絲球更易被酶解。

a-酶制劑；b-酶解溫度；c-酶解緩沖液pH；d-酶解時(shí)間；e-菌體干重；f-菌體生長(zhǎng)時(shí)間圖3 黑曲霉AG11原生質(zhì)體制備條件優(yōu)化Fig.3 Optimization of protoplast preparation conditions of A.niger AG11

在PMT中,Ca2+介導(dǎo)外源DNA作為信號(hào)分子進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),而PEG的作用可能是負(fù)責(zé)協(xié)助外源DNA進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后的釋放[24]。因此,針對(duì)PEG的種類和緩沖液中Ca2+濃度進(jìn)行優(yōu)化。然而,通過對(duì)比發(fā)現(xiàn),所選PEG的種類和Ca2+濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響不顯著。

在黑曲霉AG11的PMT中,原生質(zhì)體的濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率影響最顯著。優(yōu)化原生質(zhì)體制備的條件下進(jìn)行PMT轉(zhuǎn)化,能產(chǎn)生90個(gè)轉(zhuǎn)化子/μg DNA,陽(yáng)性率達(dá)80%以上。

2.3 GFP單孢子分選及ASN在黑曲霉中的表達(dá)

參考黑曲霉CBS513.88基因組中的基因注釋[25],從黑曲霉AG11菌株基因組中獲得ASN-1(GeneID：4989881)、ASN-2(GeneID：37096104)和ASN-3(GeneID：37104124)3個(gè)ASN基因。為了將ASN與GFP融合表達(dá)的供體DNA片段(圖1-c)轉(zhuǎn)化AG11。在AG11中轉(zhuǎn)化pyrG敲除片段,并利用含有5-氟乳清酸和尿嘧啶的轉(zhuǎn)化平板,構(gòu)建AG11△pyrG菌株。利用CRISPR-Cas系統(tǒng)(圖1),供體DNA在AG11△pyrG菌株的glaA位點(diǎn)進(jìn)行同源重組效率約為30%。收集AG11和轉(zhuǎn)化平板上的孢子,使用FCM進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析。以AG11為陰性對(duì)照,只有ASN-3基因與GFP融合時(shí)檢測(cè)到熒光信號(hào)(圖4-b),在熒光顯微鏡下也能觀察到孢子之間的熒光差異(圖4-a)。FCM分析ASN-3基因與GFP融合轉(zhuǎn)化平板上的30萬(wàn)個(gè)孢子,0.3%的孢子能表達(dá)GFP。分選后的單孢子在48孔板上存活率達(dá)65 %(圖4-c)。隨機(jī)挑選48孔板中的菌絲在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察,孔板中的菌絲均觀察到GFP表達(dá),而AG11菌絲中無(wú)熒光信號(hào)(圖4-d)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證目的基因ASN-3能通過FCM進(jìn)行精準(zhǔn)分選,需要對(duì)48孔板中菌株ASN的表達(dá)情況進(jìn)行驗(yàn)證。

a-轉(zhuǎn)化子孢子表達(dá)GFP在激發(fā)光下產(chǎn)生綠色熒光,左圖為明場(chǎng)拍攝,右圖為藍(lán)光場(chǎng)拍攝；b-黑曲霉孢子利用FCM分選,ASN-GFP：ASN-3與 GFP融合表達(dá)轉(zhuǎn)化子；c-分選熒光孢子在48孔MCA板中生長(zhǎng)60 h；d-黑曲霉菌絲在激發(fā)光下菌絲熒光對(duì)比圖,菌株1和菌株2為48 孔板單孔隨機(jī)挑選菌株,第一行圖為明場(chǎng)拍攝,第二行為藍(lán)光場(chǎng)拍攝圖4 FCM分選黑曲霉GFP單孢子Fig.4 Flow cytometry sorting of GFP spore of A.niger

隨機(jī)挑選48孔板中生長(zhǎng)的6個(gè)菌株進(jìn)行發(fā)酵,以驗(yàn)證ASN-3和GFP基因的轉(zhuǎn)錄水平和ASN表達(dá)情況。如圖5所示,ASN-3基因和GFP基因在AG11菌株中無(wú)轉(zhuǎn)錄水平,而在分選的6個(gè)菌株中ASN-3和GFP的轉(zhuǎn)錄水平明顯提高,說明2個(gè)基因的在6個(gè)菌株中均成功轉(zhuǎn)錄。此外,菌株1～6的胞外和胞內(nèi)均檢測(cè)到ASN活性,菌株5胞外ASN酶活力為0.6 U/mL。綜合圖4和圖5的結(jié)果表明,在黑曲霉中利用GFP與目的基因融合,基于轉(zhuǎn)化平板中孢子熒光強(qiáng)弱的差異,構(gòu)建快速篩選重組單孢子的方法簡(jiǎn)單而有效。

3 結(jié)論與討論

黑曲霉菌株改造過程中,由于轉(zhuǎn)化子需要多輪次純化,分子操作費(fèi)時(shí)費(fèi)力[6],且菌絲形態(tài)阻礙了菌株篩選的高通量。因此,黑曲霉工業(yè)菌株主要采用誘變的手段進(jìn)行改造。然而,隨著模式黑曲霉菌株組學(xué)信息的公布,其中新基因簇的發(fā)現(xiàn)、與酶分泌和形態(tài)學(xué)調(diào)控相關(guān)基因的挖掘?yàn)檠芯空呃硇愿脑炀晏峁┝烁嗟姆较蚝退悸穂25]。提高黑曲霉菌株編輯效率和重組菌株篩選效率將簡(jiǎn)化和促進(jìn)黑曲霉宿主的優(yōu)化。

a-GFP和ASN-3基因轉(zhuǎn)錄水平；b-胞內(nèi)胞外ASN酶活力； 菌株1～6為48孔板單孔生成菌株圖5 FCM分選GFP單孢子生成菌株的ASN表達(dá)驗(yàn)證Fig.5 Asparaginase expression verification of GFP spore strains sorted by flow cytometry

本研究以前期篩選的黑曲霉優(yōu)良表達(dá)宿主AG11為出發(fā)菌株,基于已報(bào)道的最佳轉(zhuǎn)化條件,在AG11中比較電轉(zhuǎn)化、AMT和PMT的轉(zhuǎn)化差異,以PMT的轉(zhuǎn)化陽(yáng)性率最高。對(duì)PMT中原生質(zhì)體的制備進(jìn)行了優(yōu)化,使得0.8～1 g松散的菌絲球于10 mL Yatalase溶液(0.8 mg/mL,pH 5.5)反應(yīng)2.5 h原生質(zhì)體釋放量達(dá)8.9×106個(gè)/mL。以此高濃度、高活力的原生質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化效率較優(yōu)化前提高14倍,獲得90個(gè)轉(zhuǎn)化子/μg DNA,陽(yáng)性率達(dá)80%以上?；跇?gòu)建高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的基礎(chǔ)上,利用CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)將ASN與GFP融合表達(dá)框同源整合至黑曲霉AG11糖化酶位點(diǎn)。以GFP為報(bào)告基因,通過FCM分選確認(rèn)ASN-3基因在黑曲霉中成功表達(dá),其中,0.3%的孢子能表達(dá)GFP(共篩選30萬(wàn)個(gè)孢子),65%表達(dá)熒光蛋白的孢子能表達(dá)ASN,胞外ASN酶活力為0.6 U/mL。構(gòu)建的此篩選的方法能高效分選出重組黑曲霉菌株,省去了轉(zhuǎn)化子挑選和傳代純化的步驟,節(jié)約了時(shí)間和勞動(dòng)力。研究結(jié)果將為黑曲霉基因編輯和重組菌株的快速篩選提供重要方法學(xué)基礎(chǔ)。

基于FCM分選技術(shù)構(gòu)建快速篩選黑曲霉重組孢子方法,所檢測(cè)的目的基因表達(dá)水平仍處于孢子水平。然而,孢子生成菌絲后,目的基因在其中的表達(dá)和分泌還受到蛋白分泌途徑和菌絲形態(tài)的調(diào)控。因此,為了檢測(cè)目的基因在菌絲中的分泌差異,需要構(gòu)建更精細(xì)的篩選技術(shù)的來(lái)分選黑曲霉菌絲。建立高效的黑曲霉微流控高通量篩選技術(shù)將是下一步研究的主要內(nèi)容。