超聲提取廣西白木香葉黃酮的工藝研究

蘇偉雄

515300廣東省普寧市中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部，廣東普寧

資料與方法

實(shí)驗(yàn)所使用的材料為白木香葉，取材所用白木香來自于廣西的沉香種植園，經(jīng)定種確定為白木香，取葉于實(shí)驗(yàn)室條件下洗凈晾干，剪碎后以粉碎機(jī)打成粗粉，以50℃烘干15 min后混勻過60目篩。

試劑：無水乙醇、醋酸鈉、乙酸鈉與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品。

儀器：除實(shí)驗(yàn)室常用儀器外，本文所使用的主要儀器見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)主要儀器

方法：實(shí)驗(yàn)首先構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后通過重復(fù)實(shí)驗(yàn)測定方法的有效性，最后進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。①構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，精密稱取20 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，以60%乙醇轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中并仔細(xì)沖洗，使用60%乙醇定容，顛倒多次使之均勻，形成標(biāo)準(zhǔn)液。精密吸取0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL標(biāo)準(zhǔn)液于試管中，逐個(gè)加入2 mL 0.1 mol/L AlCl3，3 mL 1 mol/L 醋酸鈉和5 mL 60%乙醇，于室溫下反應(yīng)20 min，以60%乙醇轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中并定容，分別于分光光度儀450 nm 波長下測定吸光度從而構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。②構(gòu)建提取方法，準(zhǔn)確稱取1 g白木香葉過篩干粉，置于50 mL離心管中，加入一定濃度和體積的乙醇，置于超聲波粉碎儀，設(shè)定超聲工作模式，即5 s超聲與靜置交替，功率50 W，持續(xù)工作一段時(shí)間后取出冷卻，6 000 r/min離心20 min后取上清液，于分光光度儀450 nm 波長下測定。測定結(jié)果根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算獲得對(duì)應(yīng)總黃酮含量。③進(jìn)行精密度測試、重復(fù)性測試、加樣回收與正交實(shí)驗(yàn)。正交實(shí)驗(yàn)的條件設(shè)置見表2。

表2 正交實(shí)驗(yàn)條件

結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)曲線：實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果顯示蘆丁濃度與吸光度結(jié)果見表3。

表3 蘆丁濃度與吸光度間的關(guān)系

基于此，則可相應(yīng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

如上表所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線函數(shù)為y=0.259x+0.385，R2=0.994，基于此，可以進(jìn)一步測定待測白木香葉中的總黃酮含量，從而對(duì)其進(jìn)行提取工藝優(yōu)化。

精密度實(shí)驗(yàn)：精密度測試結(jié)果見表4。

如表4所示，平行實(shí)驗(yàn)下不同樣本的標(biāo)準(zhǔn)差普遍較小，顯示出超聲提取法的方法穩(wěn)定性相對(duì)較高，實(shí)驗(yàn)方法的精密度較高，方法可靠性良好。

表4 精密度測試結(jié)果

重復(fù)性實(shí)驗(yàn)：重復(fù)性測試結(jié)果見表5。

表5 重復(fù)性測試結(jié)果

重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中超聲提取法有著相對(duì)較低水平的標(biāo)準(zhǔn)差和較低水平的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差，總體上重復(fù)性實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)相對(duì)較好，顯示出重復(fù)性測試自身的穩(wěn)定性，能夠得到更為穩(wěn)定的檢測結(jié)果。

加樣回收實(shí)驗(yàn)：加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6。

如表6所示，加樣回收的結(jié)果穩(wěn)定性極高，全部加樣回收實(shí)驗(yàn)測定的回收率均圍繞著98.4%上下波動(dòng)，波動(dòng)幅度極小，不同稱樣量下的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差高度接近，顯示出方法良好的穩(wěn)定性和回收率。

表6 加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

正交實(shí)驗(yàn)：正交實(shí)驗(yàn)的測定結(jié)果，見表7。

如表7所示，不同濃度乙醇對(duì)測定結(jié)果的影響顯著，60%濃度乙醇顯著表現(xiàn)出較好的提取率，不同條件下實(shí)驗(yàn)測定總黃酮類物質(zhì)平均提取率可以達(dá)到4.9%。稍高或稍低于60%濃度的乙醇的提取率均有著較大差異，而與此同時(shí)，60%濃度的乙醇提取方法也表現(xiàn)出了最低水平的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，進(jìn)一步驗(yàn)證了這一方法的有效性和穩(wěn)定性。見表8。

表7 不同濃度乙醇測定結(jié)果整理

如表8 所示，不同料液比對(duì)測定結(jié)果的影響顯著，25 mL乙醇∶1 g白木香葉過篩干粉顯著表現(xiàn)出較好的提取率，不同條件下實(shí)驗(yàn)測定總黃酮類物質(zhì)平均提取率可以達(dá)到5.07%。稍高的料液比同樣能夠取得較高的提取率，30 mL乙醇∶1 g白木香葉過篩干粉仍然能夠達(dá)到平均5.01%的提取率，整體而言料液比的影響較為顯著，在剔除料液比變化的條件下，不同乙醇濃度與不同超聲處理時(shí)間累積形成的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差普遍較低。見表9。

表8 不同體積乙醇測定結(jié)果整理

如表9所示，不同超聲處理時(shí)長對(duì)于測定結(jié)果影響顯著，20 min 的處理時(shí)長顯著表現(xiàn)出較好的提取率，不同條件下實(shí)驗(yàn)測定總黃酮類物質(zhì)平均提取率可以達(dá)4.89%。

表9 不同超聲處理時(shí)長測定結(jié)果整理

累積考慮不同影響因素，全部正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果中的最高平均提取率60%乙醇25 mL∶1 g白木香葉，過篩干粉經(jīng)20 min 超聲處理后所獲得的提取率是5.62%，該提取率為最高值，符合各類正交實(shí)驗(yàn)分類測定對(duì)比結(jié)果形成的最佳工藝條件。

討論

白木香又稱沉香，是我國傳統(tǒng)中藥材。沉香取自其具樹脂的莖，白木香葉非傳統(tǒng)入藥部位，較少得到研究者關(guān)注。白木香葉中的天然活性成分較多，主要為總黃酮類物質(zhì)，其與沉香的結(jié)香過程密切聯(lián)系，從而得到了較多研究與討論。

中藥材中，沉香多來自于我國西南地區(qū)與東南亞地區(qū)，而國產(chǎn)沉香則為桃金娘目瑞香科，沉香屬白木香，種于廣州和云南部分地區(qū)，稱白木香，于廣東地區(qū)又稱女兒香、芫香，于《海南植物志》稱香材，于《中國植物志》稱土沉香，于《本草綱目拾遺》稱棧香，于《名醫(yī)別錄》稱沉香。白木香老莖受傷產(chǎn)出的樹脂稱沉香，可作香料。

相較于沉香，白木香葉并非白木香的傳統(tǒng)藥用部位，相應(yīng)化學(xué)成分分析和藥用價(jià)值研究相對(duì)較少。梁林源和甘超勝(2019)采用文獻(xiàn)研究、訪談法和野外調(diào)查法等方法調(diào)查、了解了野生白木香葉中的黃酮類物質(zhì)，對(duì)其研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，對(duì)其抗癌活性進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測定。汪元元等[1](2019)對(duì)白木香葉相關(guān)領(lǐng)域的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，對(duì)其化學(xué)成分及其所具有的藥理價(jià)值分別進(jìn)行了分析與討論，并從活性化學(xué)成分、提取工藝優(yōu)化等角度分別進(jìn)行了綜述。

本文構(gòu)建了白木香葉中總黃酮的超聲提取方法，實(shí)驗(yàn)測定形成標(biāo)準(zhǔn)曲線而使得實(shí)驗(yàn)人員能夠基于這一方法與標(biāo)準(zhǔn)曲線測定樣本白木香葉中的黃酮含量。精密度實(shí)驗(yàn)顯示其多組平行試驗(yàn)的結(jié)果，標(biāo)準(zhǔn)差僅為0.000 35；重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)差與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差擴(kuò)大，說明需要經(jīng)過重復(fù)性實(shí)驗(yàn)以穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果；加樣回收實(shí)驗(yàn)顯示出實(shí)驗(yàn)方法高度穩(wěn)定，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差約為0.001 7。

黃酮類物質(zhì)自身屬于植物常見的次生代謝產(chǎn)物，包含黃酮、黃酮醇、異黃酮、鞣酐、原花青素、花色素和橙酮等，普遍以苯丙氨酸為共同前體，與結(jié)香過程中的抗逆性密切聯(lián)系，因而在代謝過程和提取工藝方面普遍有著較高的相似性，總稱黃酮類物質(zhì)。大量先行研究對(duì)超聲提取黃酮類物質(zhì)的測定方法進(jìn)行了多樣化的研究。黃靖等[2]對(duì)福建佛手采用超聲提取總黃酮的工藝進(jìn)行了分析，測定采用60%濃度乙醇與料液比1∶35 提取方式取得最高提取率。肖牧原[3]對(duì)于超聲提取薄荷總黃酮工藝進(jìn)行了優(yōu)化，測定采用41.14%濃度乙醇與21.57∶1料液比能夠獲得最大提取效率。鄒維等[4]對(duì)超聲聚能醇鹽雙水相提取藜麥中的總黃酮工藝進(jìn)行了分析，測定采用固液比28∶1與醇水體積比0.9∶1為最佳條件。王志偉等[5]對(duì)超聲輔助提取三七花總黃酮工藝進(jìn)行了優(yōu)化，測定采用73%濃度乙醇與料液比1:40提取方式取得最高提取率。

綜上，有關(guān)于植物中黃酮類物質(zhì)超聲提取的相關(guān)工藝研究與分析數(shù)量較多。所采用的超聲提取工藝多為醇提法，使用固液比和醇水比普遍較大。對(duì)比而言，白木香葉所采用固液比較小而乙醇濃度較低，主要來自于白木香為革質(zhì)葉而使醇提法需水量增長。