基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討二妙散治療濕疹的作用機(jī)制※

徐小港 王鈺 徐義峰 章德林

濕疹（eczema）是一種臨床常見的炎癥性皮膚病，可侵及人體真皮淺層及表皮[1-2]，以丘疹、糜爛、滲出及瘙癢為主要癥狀，具有對(duì)稱性、反復(fù)發(fā)作性、多形損害等特點(diǎn)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。本病好發(fā)于嬰幼兒和青少年，調(diào)查顯示，1～7歲兒童濕疹的粗患病率為12.94%，與早產(chǎn)、被動(dòng)吸煙、營養(yǎng)不均衡等因素密切相關(guān)[3]。目前，西醫(yī)主要采用糖皮質(zhì)激素、抗組胺藥、免疫調(diào)節(jié)劑等對(duì)癥治療，短期收效顯著，長期使用則易產(chǎn)生不良反應(yīng)和依賴性[4]。中醫(yī)藥則通過辨病、辨證、辨體結(jié)合的診療模式，以較好的臨床療效與安全性，為本病改善癥狀、預(yù)防復(fù)發(fā)提供了有益的參考[5]。

二妙散由蒼術(shù)、黃柏組成，首載于元代旴江醫(yī)家危亦林所著的《世醫(yī)得效方》，原方名為蒼術(shù)散，后朱丹溪稱之為二妙散。其中，蒼術(shù)辛烈溫燥，可升可降，長于祛風(fēng)勝濕；黃柏苦寒沉降，善清下焦?jié)駸帷６幒嫌?，一溫一寒，并走于下，主治濕熱流注之筋骨疼痛、下部濕瘡、腳氣赤腫等。蒼術(shù)、黃柏配伍精良，方簡(jiǎn)效宏，是古今眾多醫(yī)家治療濕熱類疾病的核心藥組，被廣泛運(yùn)用于臨床各科。姚高升[6]以二妙散為基礎(chǔ)方隨證加減治療濕疹，收效顯著。王振剛等[7]運(yùn)用二妙散加味治療陰囊濕疹165例，總有效率達(dá)97.54%。可見，二妙散治療濕疹效果確切，但多集中于臨床研究，相關(guān)藥效成分及其作用機(jī)制尚需進(jìn)一步闡明[8]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是大數(shù)據(jù)時(shí)代背景下系統(tǒng)生物學(xué)、多向藥理學(xué)、計(jì)算機(jī)軟件等相融合的新興學(xué)科，其通過可視化技術(shù)、組學(xué)方法等展示疾病-靶點(diǎn)-藥物的多層次網(wǎng)絡(luò)，尤其適合揭示中藥及復(fù)方的多成分、多靶點(diǎn)、多途徑協(xié)同作用的機(jī)理[9]。本文采用生物信息學(xué)分析方法，結(jié)合分子對(duì)接技術(shù)[10]，以二妙散入血活性成分為研究對(duì)象，分析其治療濕疹的作用靶點(diǎn)與信號(hào)通路，進(jìn)一步闡釋其臨床應(yīng)用的科學(xué)內(nèi)涵，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)及新藥研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 二妙散藥物活性成分及相關(guān)靶點(diǎn)的篩選通過TCMSP數(shù)據(jù)庫（https://old.tcmsp-e.com/）收集并篩選二妙散中蒼術(shù)和黃柏的有效成分，設(shè)定口服生物利用度（OB）≥30%與類藥性（DL）≥0.18的2個(gè)藥物代謝動(dòng)力學(xué)（ADME）屬性值為篩選條件，獲取有效入血成分及其對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)，并利用UniProt數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）將靶點(diǎn)的蛋白名統(tǒng)一轉(zhuǎn)換為基因名。

1.2 濕疹相關(guān)靶點(diǎn)的獲取及共同靶點(diǎn)的Venny分析以“eczema”為關(guān)鍵詞，在GeneCards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org）和Disgenet數(shù)據(jù)庫（https://www.disgenet.org/）檢索濕疹相關(guān)靶點(diǎn)，運(yùn)用Excel去除重復(fù)靶基因。將藥物和疾病靶點(diǎn)上傳至Venny作圖平臺(tái)（http://jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html），得到疾病與藥物的共同靶點(diǎn)，即二妙散治療濕疹的潛在作用靶點(diǎn)。

1.3 二妙散“中藥-化合物-靶點(diǎn)-濕疹”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及拓?fù)浞治鰧?.2所得的潛在作用靶點(diǎn)在EXCEL中進(jìn)行反向篩選，獲得相應(yīng)的活性化合物，采用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建二妙散“中藥-化合物-靶點(diǎn)-濕疹”網(wǎng)絡(luò)，并運(yùn)用Cytoscape 3.7.1進(jìn)行有效成分的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)分析，以度（Degree）值為標(biāo)準(zhǔn)篩選出重要的成分，Degree值越大，則該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中就越重要。

1.4 二妙散成分-濕疹靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及拓?fù)浞治鰧?.2所得的潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫（https://www.string-db.org/），得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖及蛋白質(zhì)相互作用（PPI）數(shù)據(jù)，將PPI數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1進(jìn)行圖像優(yōu)化，并運(yùn)用其中Network Analysis分析有效成分的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，以Degree值為標(biāo)準(zhǔn)篩選出重要的靶點(diǎn)，Degree值越大，則該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中就越重要。

1.5 二妙散成分-濕疹功能富集分析和KEGG通路富集分析將1.2所得的潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫（https://www.david.ncifcrf.gov/），“Select Identifier”設(shè)置為“OFFICIAL GENE SYMBOL”，“Select species”設(shè)置為“Homo sapiens”，設(shè)定P＜0.05，實(shí)現(xiàn)功能富集分析和KEGG通路富集分析。

1.6 分子對(duì)接驗(yàn)證為驗(yàn)證篩選出的二妙散治療濕疹潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)的準(zhǔn)確性，將1.3所得Degree值前10的核心活性成分與1.4所得的6個(gè)度值較高的靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接。在TCMSP數(shù)據(jù)庫下載活性成分的3D分子結(jié)構(gòu)，從PDB數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）下載靶點(diǎn)蛋白結(jié)構(gòu)。采用PyMOL、Autoduck軟件對(duì)活性成分與靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行脫水（輸出pdb格式）、預(yù)處理（輸出pdbqt格式），最后進(jìn)行分子對(duì)接，對(duì)接的最低標(biāo)準(zhǔn)為結(jié)合能≤-5.0 kJ/mol。對(duì)接完成后，將對(duì)接結(jié)果用熱圖展示，對(duì)接圖像運(yùn)用Pymol、Discovery Studio 2016軟件進(jìn)行輸出優(yōu)化。

2 結(jié)果

2.1 二妙散的活性成分及其靶點(diǎn)TCMSP數(shù)據(jù)庫得到蒼術(shù)、黃柏的活性成分共189個(gè)，篩選后共確定46個(gè)，去除無相關(guān)靶點(diǎn)的活性成分，最終保留29個(gè)活性成分，其中，蒼術(shù)4個(gè)，黃柏25個(gè)，見圖1、表1。收集活性成分相關(guān)作用靶點(diǎn)，其中蒼術(shù)93個(gè)，黃柏287個(gè)，去除重復(fù)靶點(diǎn)后，二妙散活性成分潛在作用靶點(diǎn)為290個(gè)。

圖1 二妙散活性成分分布圖

表1 TCMSP數(shù)據(jù)庫中保留的藥物活性成分信息表

2.2 二妙散治療濕疹的潛在作用靶點(diǎn)通過Disgenet、Gencards數(shù)據(jù)庫進(jìn)行濕疹疾病靶點(diǎn)篩選，去除重復(fù)靶點(diǎn)，得到相關(guān)靶點(diǎn)3481個(gè)。運(yùn)用Venny作圖平臺(tái)獲得二妙散活性成分與濕疹共同靶點(diǎn)（潛在作用靶點(diǎn)）141個(gè)，見圖2。

圖2 二妙散治療濕疹的潛在作用靶點(diǎn)

2.3 二妙散“中藥-化合物-靶點(diǎn)-濕疹”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1構(gòu)建二妙散“中藥-化合物-靶點(diǎn)-濕疹”可視化網(wǎng)絡(luò)，見圖3。通過Cytoscape 3.7.1內(nèi)置Network Analysis分析有效成分的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，得到度值前10的核心作用成分，見表2。結(jié)果顯示：主要的活性成分為槲皮素（MOL000098）、漢黃芩素（MOL000173）等。由圖3可知，二妙散存在一個(gè)化合物作用于多個(gè)靶點(diǎn)及不同化合物作用于一個(gè)靶點(diǎn)的情況，可見二妙散可通過多種有效成分作用于多個(gè)靶基因治療濕疹。

圖3 二妙散“中藥-化合物-靶點(diǎn)-濕疹”網(wǎng)絡(luò)圖

表2 二妙散治療濕疹核心成分信息表

2.4 二妙散治療濕疹潛在作用靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將二妙散治療濕疹的潛在作用靶點(diǎn)上傳至STRING數(shù)據(jù)庫，得到PPI網(wǎng)絡(luò)及相關(guān)信息，并將PPI信息文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1，得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖（見圖4），通過Network Analysis分析有效成分的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，發(fā)現(xiàn)INS、AKT1、IL6、TNF、VEGFA、TP53等節(jié)點(diǎn)度值較高，提示這些靶基因在PPI網(wǎng)絡(luò)中較重要，其可能是二妙散發(fā)揮治療作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖4 二妙散與濕疹共同基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 富集分析通過DAVID數(shù)據(jù)庫對(duì)二妙散治療濕疹的潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，均保留P＜0.05的結(jié)果，得到GO條目651條，包括：藥物應(yīng)答（response to drug）、細(xì)胞對(duì)脂多糖的反應(yīng)（cellular response to lipopolysaccharide）等生物過程（BP）條目507條；細(xì)胞外空間（extracellular space）、質(zhì)膜的組成部分（integral component of plasma membrane）等細(xì)胞組成（CC）條目49條；藥物結(jié)合（drug binding）、酶結(jié)合（enzyme binding）等分子功能（MF）條目95條。對(duì)較重要條目運(yùn)用Origin 2018繪制柱狀圖進(jìn)行可視化，見圖5。

圖5 二妙散GO功能富集分析圖

KEGG通路富集分析顯示，濕疹可能與TNF信號(hào)通路（TNF signaling pathway）、利什曼病信號(hào)通路（Leishmaniasis）、癌癥信號(hào)通路（Pathways in cancer），Toll樣受體信號(hào)通路（Toll-like receptor signaling pathway）等120條通路有關(guān)。對(duì)前20條通路運(yùn)用Origin 2018進(jìn)行可視化，見圖6。其中，橫坐標(biāo)為通路名稱（Term）；縱坐標(biāo)為Gene Ratio值，表示富集在信號(hào)通路上的靶點(diǎn)占該通路靶點(diǎn)數(shù)的比例；氣泡大小表示富集靶點(diǎn)數(shù)目（Count）；氣泡顏色用于表示LgP，LgP越小，代表富集程度越顯著。

圖6 二妙散KEGG通路富集分析圖

2.6 分子對(duì)接驗(yàn)證為明確靶點(diǎn)蛋白與所對(duì)應(yīng)的成分之間的結(jié)合活性，本研究選取度值前10的核心活性成分作為配體，以INS、AKT1、IL6、TNF、VEGFA、TP53共6個(gè)度值較高的基因作為受體，進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。配體具有的潛在作用活性越強(qiáng)，與受體結(jié)合能量越低，對(duì)接打分則越高。分子對(duì)接所得結(jié)果顯示Docking Score均大于5，且形成范德華力、氫鍵、Pi-Sigma作用等，提示核心活性成分與靶點(diǎn)均具有較好的結(jié)合活性，分子對(duì)接結(jié)果見圖7，部分分子對(duì)接見圖8。

圖7 二妙散核心活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接打分熱圖

圖8 二妙散中活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的部分分子對(duì)接圖（左側(cè)為3D，右側(cè)為2D）

3 討論

濕疹是一種由內(nèi)外多種因素引起的過敏性皮膚病，病因尚未明確，且發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，導(dǎo)致其治療缺乏針對(duì)性和特異性。研究[11-12]表明，濕疹的發(fā)病主要與遺傳、免疫紊亂、內(nèi)分泌失調(diào)及外界不良刺激等諸多因素有關(guān)。其中，由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫在本病的發(fā)展中起到了重要作用，其通過分泌IL-6、IL-10等細(xì)胞因子，并與各種炎癥細(xì)胞共同作用，引起皮膚血管壁通透性增加、血管擴(kuò)張而形成濕疹樣病變[13]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，濕疹可緣于腠理不密，外感毒邪，雖發(fā)于表，但亦與內(nèi)在臟腑功能失調(diào)有關(guān)，尤其與心火、脾濕關(guān)系甚為密切[14]。對(duì)本病的治療，歷代醫(yī)家重視從風(fēng)、濕、熱論治。據(jù)報(bào)道，在治療濕疹的常用藥物中，清熱藥與利水滲濕藥占比最高，其中蒼術(shù)與黃柏均為使用頻率排名前十的中藥[15]。相關(guān)研究顯示，蒼術(shù)具有顯著的抗炎作用，可抑制TNF、IL-6、IL-8等炎性細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，并且其化合物還具有多種抗菌活性[16-19]；黃柏可通過降低毛細(xì)血管通透性，有效緩解濕疹炎癥的滲出度，其有效成分小檗堿對(duì)濕疹的主要致病菌金黃色葡萄球菌還具有較強(qiáng)的抑制作用[20-21]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果顯示，槲皮素、漢黃芩素、豆甾醇等29個(gè)成分為治療濕疹的潛在活性成分。其中，槲皮素已被證實(shí)能夠抑制組胺的釋放，有助于緩解皮膚病的過敏性炎癥[22]。研究[23]表明，漢黃芩素可通過誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡，從而有效降低其數(shù)量，具有治療過敏性炎癥的作用。根據(jù)PPI分析，結(jié)合“中藥-化合物-靶點(diǎn)-濕疹”網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)AKT1、IL6、TNF等為關(guān)鍵靶點(diǎn)。AKT1是表皮末端分化的重要信號(hào)分子，可影響角質(zhì)層的脆性及屏障功能，其活性的降低會(huì)引起角質(zhì)形成細(xì)胞分化樣改變，導(dǎo)致濕疹皮炎中的角化不全[24]。研究表明，金黃色葡萄球菌感染是濕疹發(fā)病的重要原因，同時(shí)還可加重病情，在相關(guān)動(dòng)物模型中IL6等促炎性細(xì)胞因子水平顯著升高[25]。TNF細(xì)胞因子的部分家族成員及其受體的表達(dá)水平與濕疹病變呈正相關(guān)，具有潛在的致病性[26]。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，二妙散調(diào)治濕疹主要涉及TNF信號(hào)通路、利什曼病信號(hào)通路、癌癥信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路等。利什曼病是由利什曼原蟲感染所致，其可通過在細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)遲發(fā)型超敏性肉芽腫反應(yīng)，加重局部組織損傷，從而引發(fā)皮膚或皮膚黏膜疾病[27]。濕疹的發(fā)病還與Toll樣受體的多態(tài)性有關(guān)，其可通過細(xì)菌定植或阻礙Th1反應(yīng)/Th2轉(zhuǎn)移，誘發(fā)變態(tài)反應(yīng)性疾病[28]。分子對(duì)接結(jié)果表明，槲皮素、谷甾醇、豆甾醇等活性成分與靶蛋白AKT1、IL6、TNF具有良好的對(duì)接活性，提示二妙散活性成分與靶蛋白結(jié)合穩(wěn)定，以此發(fā)揮治療濕疹的作用。

旴江醫(yī)學(xué)，名方璀璨，其中二妙散以其藥簡(jiǎn)效宏著稱，后世多有依此化裁者，流傳古今，具有較強(qiáng)的生命力。本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)初步分析了二妙散治療濕疹的活性成分、潛在作用靶點(diǎn)及生物學(xué)過程等，得出TNF信號(hào)通路、利什曼病信號(hào)通路、癌癥信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路等可能是其治療濕疹的主要途徑。綜上，本研究可為旴江古方科學(xué)內(nèi)涵的現(xiàn)代化詮釋提供參考借鑒。