常用抗菌藥物中非法添加氯霉素類藥物的檢測方法研究

劉 佳，高 婷，王亞芳，李應超

（北京市獸藥監(jiān)察所 102629）

我國畜牧業(yè)生產中每年抗生素使用量占全球抗生素使用量的30%，是世界上使用抗生素最多的國家之一。阿莫西林可溶性粉、硫酸新霉素可溶性粉、酒石酸泰樂菌素可溶性粉、鹽酸林可霉素可溶性粉、硫酸粘菌素可溶性粉、阿維菌素粉等常用抗菌藥物，具有良好的抑菌、殺菌作用， 臨床應用廣泛[1-3]。隨著我國獸藥市場競爭的日益激烈，一些不法廠家為了提高抗菌藥物的療效，追逐片面的經濟利益，而在獸藥處方外非法添加其他藥物。這種情況極易導致用戶不知情的情況下，大劑量或長時間連續(xù)使用時，帶來藥物超量使用的中毒風險和藥物殘留隱患，導致細菌耐藥性的產生，動物性產品藥物殘留超標，繼而通過食物鏈傳遞，造成食品安全隱患，給人類健康造成嚴重的危害[4-6]。為此，農業(yè)農村部發(fā)布了多個涉及獸藥非法添加檢測方法的國家標準[7-8]，這對打擊獸藥處方外添加行為提供了強有力的技術支撐。

氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考等屬于氯霉素類藥物，具有廣譜抗菌性，能夠抑制革蘭氏陽性菌和陰性菌，用于預防和治療細菌感染效果較好[9-11]。然而，研究發(fā)現(xiàn)氯霉素對人類的造血系統(tǒng)有較大的毒性作用，甲砜霉素會抑制紅細胞的生成，氟苯尼考具有胚胎毒性[12-13]。但時常發(fā)現(xiàn)氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考等氯霉素類藥物作為非法添加物質在其他處方外添加。目前該類藥物的檢測方法主要有液質聯(lián)用技術[14-15]、高效液相色譜[16-19]、薄層色譜分析[20-21]、顯微鑒別[22-23]，其中高效液相色譜分析速度快、分離性能高，雙重定性保留時間及紫外圖譜，減小了假陽性的可能性。為進一步完善獸藥非法添加檢測國家標準體系建設，本試驗建立了以二極管陣列檢測器（PDA）為檢測手段同時檢測常用抗菌藥物中違規(guī)添加甲砜霉素、氟苯尼考和氯霉素的高效液相色譜法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與試劑

電子天平（Mettler Toledo），高效液相色譜儀（Agilent 1100）。甲醇、乙腈（Fisher），MilliQ-Gradient 超純水系統(tǒng)。

1.2 對照品

氯霉素對照品（來源：中國藥品生物制品檢定研究院，批號130555-201203，含量99.8%）、甲砜霉素對照品（來源：中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號K0241406，含量99.7%)、氟苯尼考對照品（來源：中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號K0301305，含量99.3%)。

1.3 供試品

阿莫西林可溶性粉、硫酸新霉素可溶性粉、酒石酸泰樂菌素可溶性粉、鹽酸林可霉素可溶性粉、硫酸粘菌素可溶性粉、阿維菌素粉等常用抗菌藥物，抽檢或審批合格產品。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱為Waters Atiantis?T3 5μm 4.6×250mm。A為甲醇；B為乙腈； C為水，梯度洗脫。流速1.0mL/min；檢測波長為278nm和224nm；進樣體積為10μL。洗脫方法如表1所示。

表1 梯度洗脫方法

2.2 標準溶液的制備

2.2.1對照品儲備溶液 使用40%甲醇為溶劑，分別配制氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、濃度為0.5mg/mL、0.5mg/mL、1.25mg/mL，用時稀釋至相應濃度。

2.2.2 系統(tǒng)適用性溶液 使用40%甲醇為溶劑，分別配制氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、濃度為50 μg/mL。

2.3 樣品溶液的制備

2.3.1 陰性樣品儲備溶液 0.50g→ 50mL，溶劑為 40%甲醇，6000 r/min離心5min，取上清液備用。

2.3.2 陰性樣品溶液 精密量取2.3.1溶液1 mL，精密加入9 mL 40%甲醇溶液，混勻。

2.3.3 陽性樣品溶液 精密量取2.3.1溶液1 mL，精密加入2.2.1溶液1 mL和8 mL 40%甲醇溶液，混勻。

2.3.4 陽性添加樣品 按照5%、5%、12.5%的比例添加3種氯霉素類藥物。

2.4 重復性考察

準確量取系統(tǒng)適用性溶液，按上述色譜條件，連續(xù)進樣6次，計算各組分峰面積的相對標準偏差(RSD)，考察標液的重復性。

2.5 標準曲線的繪制

使用40%甲醇為溶劑， 3種氯霉素類藥物的濃度分別為500、250、100、50、25、10μg/mL，按照2.1項下色譜條件進行測定，平行測定3次，記錄峰面積，取其平均值，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標做線性回歸。

2.6 檢測限的測定

精密取2.3.1各1mL，精密加入2.2.2適量（0.8mL、0.5mL和0.6mL），40%甲醇為溶劑至10mL，搖勻，按2.1條件檢測，根據(jù)光譜失真程度確定檢測限。

2.7 方法的準確度和精密度

精密取各陰性樣品儲備液1mL，按照2.3.4中三種氯霉素類藥物常用規(guī)格的80%、100%、120%的比例分別添加氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考三種藥物（加入對照品儲備液0.8mL、1.0mL、1.2mL），按照2.3.2處理，平行測定3次，計算加標回收率和RSD。

3 結果與分析

3.1 系統(tǒng)適用性

取40%甲醇溶液、2.2.2、2.3.2、2.3.3，按2.1色譜條件下進樣，記錄色譜峰。見圖1-6，在此測定條件下，各陰性樣品溶液、40%甲醇溶液對三種藥物測定沒有干擾，各藥物之間的分離度良好，甲砜霉素、氟苯尼考和氯霉素的出峰時間分別為9.3min、19.1min、24.2min。各目標峰純度角小于純度閾值，表明峰的純度較好，見圖7-12。

圖1 40%甲醇溶液色譜圖

圖2 氯霉素類藥物對照品溶液（50 μg/mL）色譜圖

圖3 阿莫西林可溶性粉-空白色譜圖

圖4 阿莫西林-添加色譜圖

圖5 硫酸新霉素可溶性粉-空白色譜圖

圖6 酒石酸泰樂菌素可溶性粉-空白色譜圖

圖7 甲砜霉素-對照品（50 μg/mL）光譜圖

圖8 甲砜霉素-對照品（50 μg/mL）純度峰

圖9 氟苯尼考-對照品（50 μg/mL）光譜圖

圖10 氟苯尼考-對照品（50 μg/mL）純度峰

圖11 氯霉素-對照品（50 μg/mL）光譜圖

圖12 氯霉素-對照品（50 μg/mL）純度峰

3.2 重復性考察

按照方法2.4處理樣品，進樣，氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考色譜峰面積的變異系數(shù)分別為0.13%、0.11%、0.11%，表明在2.1條件下檢測，標液精密度良好。

3.3 標準曲線

在本試驗的色譜條件下，甲砜霉素、氟苯尼考和氯霉素的標準曲線和相關系數(shù)可知（見圖13），三種藥物在10～500ug/mL濃度范圍內時，藥物濃度與相應峰面積線性關系良好，相關系數(shù)R2均在0.999以上。

圖13 氯霉素類藥物標準曲線方程與相關系數(shù)

3.4 檢測限

本法對所檢測藥物中氯霉素及氟苯尼考的LOD均為4g/kg、甲砜霉素的LOD為3g/kg。

3.5 加樣回收率試驗

在不含有氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考3種氯霉素類藥物的抗菌藥物中添加陽性樣品，其分離良好。按外標法計算加標回收率，回收率在98.8%～102.1%范圍內，RSD為0.4%～1.1%，其試驗結果見表2。

表2 抗菌藥物中添加氯霉素類藥物（甲砜霉素、氟苯尼考、氯霉素）的回收率和RSD（n=9）

4 討論與結論

4.1 抗菌藥物種類的選擇

抗菌藥物種類繁多，常用于獸醫(yī)臨床的有幾十種。為便于研究和應用，一般根據(jù)它們的化學結構分為β-內酰胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、氯霉素類、大環(huán)內酯類、林可胺類、多肽類等種類。本試驗選擇檢測概率較大的五種藥物，阿莫西林可溶性粉、硫酸新霉素可溶性粉、替米考星預混劑、鹽酸林可霉素可溶性粉和阿維菌素粉。幾種藥物均對革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌有效，為增大藥效，不良廠家存在添加氯霉素類藥物的可能性。

4.2 色譜柱及柱溫的選擇

本試驗共測試3種Waters色譜柱，1種Agilent色譜柱，考慮目標物質的分離度，靈敏度和保留時間，只有Waters Atiantis?T3 5μm 4.6×250mm對甲砜霉素保留時間較長，能使目標成分有效的分離，與其他成分峰不產生干擾。因此選擇該型號色譜柱。改變柱溫，未見色譜圖峰型及保留時間有明顯變化，考慮到本方法檢測較多樣品及采用梯度洗脫的方式，試驗選擇以35℃為檢測溫度，以提高色譜峰的重現(xiàn)性。

4.3 流動相的選擇

為防止儀器堵塞，延長柱子使用壽命，流動相應盡量避免加入酸或鹽類物質。本試驗探究了水、甲醇、乙腈三種流動相組合，三種物質混合流動相比兩兩混合效果要好，因此選擇甲醇-乙腈-水三者混合流動相。由于抗菌藥物結構的一致性，等度洗脫未能完全實現(xiàn)藥物的基線分離，因此選擇梯度洗脫，洗脫程序為表1-1，可實現(xiàn)目標物之間的有效分離。

4.4 結論

本試驗采用高效液相色譜-二極管陣列檢測器建立的抗菌藥物中非法添加氯霉素類藥物檢查方法，可實現(xiàn)目標物與其他成分之間的有效分離，同時該方法環(huán)境友好、快速、重現(xiàn)性好，可用于抗菌藥物中氯霉素類藥物的檢測。此外，經試驗驗證，該方法對于中獸藥等固體藥物制劑中氯霉素類非法添加的檢測也具有較好的效果。