牛多殺巴氏桿菌的生物學(xué)特性研究

傅偉文

（合浦縣畜牧技術(shù)推廣中心 536199）

多殺巴氏桿菌是一種革蘭氏陰性菌，能感染家禽、豬、牛、羊等多種動物，其中，牛、羊感染多殺巴氏桿菌通常表現(xiàn)為出血性敗血癥，家禽感染可引起禽霍亂，豬感染可引起豬肺疫，成為危害畜牧行業(yè)的病原之一[1]。本研究以廣西某養(yǎng)殖場出現(xiàn)呼吸道癥狀的病牛為研究對象，采集肺臟組織，采用細(xì)菌的分離培養(yǎng)、多殺性巴氏桿菌特異性基因kmt擴增、血清型擴增鑒定、毒力基因（轉(zhuǎn)鐵蛋白tbpA、編碼4型菌毛基因ptfA、血紅色獲得受體hasR、脂蛋白plpE、外膜蛋白ompH）的擴增、藥敏試驗、致病性試驗等方法對細(xì)菌特性進行研究，旨在了解該牛呼吸道病例病原種類的確定及病原的致病機理，為該病的防控、疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 病料樣品

2021年7月，病料來源于廣西某養(yǎng)牛場送檢的肺臟組織。據(jù)主訴，該病例臨床癥狀表現(xiàn)為咳嗽、流鼻涕；剖檢發(fā)現(xiàn)肺出血、水腫；腸道黏膜充血等癥狀。

1.2 試驗動物

6～8周齡、體重為22g左右的健康昆明鼠10只，購自廣西中醫(yī)藥大學(xué)。

1.3 試劑及儀器

PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)，購自Bio-rad公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒、2×Taq MasterMix等，均購自北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司；藥敏紙片，購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.4 引物合成

特異性基因kmt引物、5種莢膜血清型引物（A/B/D/E/F型）、5種毒力相關(guān)基因（tbpA、ptfA、hasR、plpE、ompH）引物參照吳翠蘭、馬曉菁、何傳雨等文獻[2-4]的引物序列，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

2 方法

2.1 細(xì)菌分離與培養(yǎng)

無菌采取病料組織劃線接種于血平板瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24～48h觀察，記錄情況。挑取單個菌落進行革蘭氏染色，鏡檢。

2.2 分離菌PCR擴增

用細(xì)菌基因組DNA試劑盒提取分離株基因組DNA，以該DNA為模板，用多殺巴氏桿菌特異性基因kmt引物、5種莢膜血清型引物（A/B/D/E/F型）、5種毒力相關(guān)基因（tbpA、ptfA、hasR、plpE、ompH）進行PCR擴增鑒定。擴增程序為：95℃預(yù)變性5min；然后進行30個循環(huán)95℃變性1min、50℃～60℃退火1min、72℃延伸1min 30s；最后再進行72℃延伸10min。擴增結(jié)束后，取7μL的PCR產(chǎn)物在1.5%的凝膠瓊脂糖上進行電泳，觀察電泳結(jié)果。

2.3 分離株的藥敏試驗

選取多粘菌素、頭孢拉定、新霉素、四環(huán)素、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、氟苯尼考、頭孢曲松、強力霉素、慶大霉素、阿奇霉素、頭孢氨芐、頭孢噻肟、青霉素等14種藥物進行測定分離株的耐藥情況。

2.4 分離株的致病性試驗

在無菌的操作下，5只試驗組小鼠按劑量為0.2mL/只腹腔注射純培養(yǎng)菌，另5只對照組則按劑量為0.2mL/只腹腔注射生理鹽水。觀察記錄小鼠的精神狀態(tài)和死亡時間等。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)菌分離與培養(yǎng)結(jié)果

將肺病料接種于血瓊脂平板置于37℃培養(yǎng)24～48h后，平板上生長有露珠樣、透明、不溶血中等大小的菌落，挑取單個菌落革蘭氏染色鏡檢可觀察到革蘭氏陰性短桿菌。

3.2 分離菌PCR擴增

將多殺巴氏桿菌特異性基因kmt引物進行PCR擴增、電泳后，結(jié)果顯示，可擴出目的條帶大小為456 bp的基因片段（圖1），說明該分離株為多殺巴氏桿菌。

用5種莢膜血清型引物（A/B/D/E/F型）進行PCR擴增鑒定莢膜血清型，結(jié)果顯示，只有A型能擴增出條帶大小為1048 bp片段（圖1）。

用5種毒力相關(guān)基因（tbpA、ptfA、hasR、plpE、ompH）進行PCR擴增鑒定，結(jié)果顯示只有ptfA、plpE、ompH毒力基因擴增出與之相符的目的條帶，目的條帶大小分別為488 bp、1000 bp、438 bp（圖1）。對目的條帶進行切膠、回收、連接、轉(zhuǎn)化、測序，測序結(jié)果經(jīng)BLAST驗證，該分離株含有ptfA、plpE、ompH這3個毒力基因。

圖1 PCR結(jié)果

3.3 分離株的藥敏試驗結(jié)果

藥敏結(jié)果檢測顯示，該分離株對頭孢噻肟、頭孢曲松、氧氟沙星、環(huán)丙沙星等敏感，對頭孢氨芐、頭孢拉定、強力霉素、慶大霉素等中敏；對多粘菌素、新霉素、四環(huán)素、氟苯尼考、阿奇霉素、青霉素耐藥，見表1。

表1 藥敏試驗結(jié)果

3.4 分離株的致病性試驗

試驗組小鼠在接種后3h開始出現(xiàn)精神沉郁、運動減少；接種6h后小鼠運動遲鈍；接種24h內(nèi)小鼠全部死亡。剖開發(fā)現(xiàn)肺臟、脾臟腫大、出血，并從中分離到革蘭氏陰性菌，經(jīng)PCR驗證，該菌與所注射的菌一致。而對照小鼠連續(xù)觀察5d，未發(fā)現(xiàn)異常。結(jié)果表明，該分離株具有很強的致病性。

4 討論

多殺巴氏桿菌是一種條件性致病菌，廣泛存在于動物上呼吸道黏膜，當(dāng)動物機體抵抗力水平下降，易導(dǎo)致病原體的侵入，進而使動物致病。根據(jù)莢膜血清型可將多殺巴氏桿菌分為5個血清型，即A、B、D、E、F型，不同的莢膜血清型引發(fā)的臨床癥狀有所不同[5]。經(jīng)過PCR驗證，本次研究從牛肺中分離出1株A型多殺巴氏桿菌，符合國內(nèi)多地報道的牛源多殺巴氏桿菌流行血清型[6-9]。

藥物敏感性試驗結(jié)果顯示，該A型多殺巴氏桿菌分離株對頭孢噻肟、頭孢曲松、氧氟沙星、環(huán)丙沙星等敏感，對頭孢氨芐、頭孢拉定、強力霉素、慶大霉素等中敏；對多粘菌素、新霉素、四環(huán)素、氟苯尼考、阿奇霉素、青霉素耐藥。結(jié)果表明，該分離株存在耐藥性。吳同壘[10]對河北分離株進行藥敏試驗，結(jié)果顯示，分離株對大多數(shù)藥物敏感，但對復(fù)方新諾明、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶和林可霉素耐藥較高，達到80%以上。杜英立等[6]對廣西株進行藥敏試驗，結(jié)果顯示，分離株對阿米卡星、卡那霉素、諾氟沙星敏感，對氟苯尼考、丁胺卡那、頭孢曲松、慶大霉素、四環(huán)素中敏，對鏈霉素、紅霉素、環(huán)丙沙星、青霉素耐藥。由此可見，不同地區(qū)分離的菌株，細(xì)菌的耐藥程度有所差異，因此，應(yīng)在藥敏試驗結(jié)果的指導(dǎo)下合理用藥，避免盲目用藥。

本研究還對該分離株進行致病性試驗，結(jié)果表明，該A型多殺巴氏桿菌廣西分離株具有很強的致病性。多殺巴氏桿菌的毒力因子很多，例如黏附素相關(guān)因子在細(xì)菌黏附等方面具有非常重要的作用；莢膜多糖，具有抗吞噬、抗溶菌酶等作用；外膜蛋白在菌體對宿主感染和致病過程中起著非常重要的作用[4]。本研究對5種毒力基因tbpA、ptfA、hasR、plpE、ompH進行檢測，結(jié)果顯示ptfA、plpE、ompH這3個基因能檢測出來，這些結(jié)果與馬曉菁[3]、何傳雨[4]等報道一致。Ewers等報道86.9%的多殺巴氏桿菌中隱含黏附有關(guān)的基因ptfA等[11]。ptfA菌毛是革蘭氏陰性菌黏附宿主上皮組織細(xì)胞表面的重要毒力因子，具有黏附作用，其表達的蛋白質(zhì)的免疫厡性已被證實，該基因的研究成為研究多殺巴氏桿菌的熱點基因。plpE為多殺巴氏桿菌脂蛋白E，該蛋白具有高度的免疫厡性。ompH是多殺巴氏桿菌的外膜蛋白中的孔蛋白，作為研制疫苗的一種抗原蛋白[12]。目前我國預(yù)防的多殺巴氏桿菌苗主要是B型滅活疫苗，而目前國內(nèi)頻繁發(fā)生的主要是A型流行株，各血清型之間的交叉保護低，對多殺巴氏桿菌毒力因子研究為研制疫苗奠定基礎(chǔ)。

參看文獻

[1] 魏詩謠， 王麗揚， 張信軍， 等.3株羊源D型多殺性巴氏桿菌的生物學(xué)特性研究[J].揚州大學(xué)學(xué)報(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版)， 2021， 42(4): 12-17.

[2] 吳翠蘭， 劉琰， 李軍， 等. D型多殺性巴氏桿菌和綿羊肺炎支原體引起山羊的混合感染[J].動物醫(yī)學(xué)進展， 2020， 41(3):57-61.

[3] 馬曉菁. 致犢牛肺炎多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及部分生物學(xué)特性研究[D].石河子:石河子大學(xué)， 2010.

[4] 何傳雨. 牛源多殺性巴氏桿菌莢膜和毒力相關(guān)基因的克隆及序列分析[D].石河子:石河子大學(xué)， 2011.

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