豬圓環(huán)病毒2型抗體與病原檢測(cè)相關(guān)性分析

袁翠平，賀會(huì)利，馬宇毅，岑 敏，李 軍

（廣西獸醫(yī)研究所/廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 530001）

豬圓環(huán)病毒（Porcinecircovirus，PCV）屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬的DNA病毒，呈閉合單股環(huán)狀，是負(fù)鏈無(wú)囊膜結(jié)構(gòu)，為目前已知的最小哺乳動(dòng)物病毒[1-2]。根據(jù)其抗原性及基因組，可以分為：豬圓環(huán)病毒1型（PCV-1）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV-2）、豬圓環(huán)病毒3型（PCV-3），其中PCV-1幾乎不引起豬群疾病[3]。PCV-2對(duì)豬群有非常強(qiáng)的致病性，主要引起斷奶豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）、豬皮炎與腎病綜合征（PDNS）、豬呼吸道疾病復(fù)合征（PRDC）、母豬繁殖障礙及豬間質(zhì)性肺炎等癥狀[4-5]。PCV-3引起母豬皮炎腎病綜合征與繁殖障礙，仔豬腹瀉，現(xiàn)處于研究階段。2019年，豬群中發(fā)現(xiàn)了基因大小為1770bp的圓環(huán)病毒，定為豬圓環(huán)病毒4型(PCV-4)[6]，PCV-4在我國(guó)也廣泛存在，但由于PCV-4是2019年才發(fā)現(xiàn)的，研究資料較少。PCV-2目前是養(yǎng)殖場(chǎng)豬的主要元兇[7]，雖然疫苗在PCV-2的防控中發(fā)揮一定作用，但是國(guó)內(nèi)豬群普遍存在PCV-2的感染情況[8]，PCV-2主要破壞機(jī)體的免疫功能，以淋巴腫大、淋巴細(xì)胞減少為特征，從而引起免疫抑制，增加了與其他病原體混合感染的機(jī)會(huì)，從而導(dǎo)致病豬的死亡率升高，極大地阻礙了養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)豬群PCV-2的抗體和病原檢測(cè)，對(duì)比結(jié)果分析抗體水平和野毒感染之間的關(guān)系，從而發(fā)現(xiàn)潛在的易感群體，評(píng)估疫病的防控效果，進(jìn)而為PCV-2的診斷提供科學(xué)依據(jù)，減少經(jīng)濟(jì)損失，提高養(yǎng)殖業(yè)收入。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和儀器病毒DNA提取試劑盒、2×ESTaq-MasterMix、DNAMarker2000等由北京康為世紀(jì)生物科技有限公司提供；瓊脂糖凝膠購(gòu)自西班牙GENE公司；LifePCR儀、凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自Bio-rad公司。PCV-2ELISA抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)自韓國(guó)JBT公司；臺(tái)式離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；LabsystemsDragonMK3酶標(biāo)儀購(gòu)自芬蘭雷勃公司。

1.1.2 臨床樣品采集自廣西南寧規(guī)?；i場(chǎng)的保育豬血清115份、育肥豬血清183份，共298份。陽(yáng)性樣品由廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。所有檢測(cè)豬均過(guò)免疫PCV-2滅活疫苗。

1.2 方法

1.2.1 PCV-2抗體水平無(wú)菌前腔靜脈采血，采集的全血8000r/min離心5～10min后，取上清液，PCV-2抗體檢測(cè)操作步驟和結(jié)果判斷按使用的說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.2 樣品RNA/DNA提取取1.2.1離心后的上清液，按照病毒DNA提取試劑盒中的說(shuō)明書提取血清樣品中DNA，提取的病毒核酸樣品放于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物合成PCV-2的PCR檢測(cè)方法按連慧香等[9]方法進(jìn)行。引物序列：PCV-2-F:CCGCGGGCTGGCTGAACTT，PCV-2-R:ACCCCCGCCACCGCTACC。引物交由廣州華大基因科技有限公司合成。

1.2.4 PCR擴(kuò)增以PCV-2引物序列對(duì)298份血清進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR的反應(yīng)體系為：樣品DNA模板3μL，2×Es-TaqMasterMix13μL，上游引物、下游引物各1μL（引物濃度25pmol/μL），ddH2O7μL，總反應(yīng)體系共25μL。PCR的反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性溫度95℃，預(yù)變性時(shí)間5min；同一溫度下變性1min；退火溫度55℃，退火時(shí)間1min；延伸溫度72℃延伸時(shí)間1min30s；30～35個(gè)循環(huán)后，需72℃再延伸10min，目的片段大小為1154bp。使用1.5%～2.0%的瓊脂糖凝膠對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物做電泳檢測(cè)，電泳時(shí)間25～30min，使用凝膠成像儀觀察試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析用Excel軟件對(duì)PCV-2的抗體和病原結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 PCV-2抗體檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)對(duì)298份豬血清樣品檢測(cè)PCV-2抗體，抗體的陽(yáng)性率為89.93%（268/298），PCV-2抗體的檢測(cè)結(jié)果達(dá)到群體免疫合格率（70%以上）。其中保育豬的陽(yáng)性率為90.43（104/115），育肥豬的陽(yáng)性率為89.61%（164/183）。

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

對(duì)298份血清樣品和陽(yáng)性樣品同時(shí)進(jìn)行PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示陽(yáng)性樣品的片段為1154bp，血清樣品與陽(yáng)性結(jié)果一致則說(shuō)明PCV-2病原陽(yáng)性，血清樣品無(wú)條帶則說(shuō)明PCV-2陰性（圖1）。病原檢測(cè)298份血清樣品中，21份病原陽(yáng)性，277份病原陰性。

圖1 部分樣品中PCV-2擴(kuò)增電泳結(jié)果

2.3 結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析

抗體檢測(cè)298份血清樣品中，268份PCV-2抗體陽(yáng)性，30份PCV-2抗體陰性。病原檢測(cè)298份血清樣品中，21份病原陽(yáng)性，277份病原陰性。30份PCV-2抗體陰性中圓環(huán)病毒陽(yáng)性率為43.33%（13/30）；268份PCV-2抗體陽(yáng)性中圓環(huán)病毒陽(yáng)性率為2.99%（8/268）；268份抗體陽(yáng)性的平均S/P值為1.417；21份病原陽(yáng)性的血清抗體陽(yáng)性的平均S/P值為0.503；8份病原陽(yáng)性且抗體陽(yáng)性的血清樣品平均S/P值為1.041；13份病原陽(yáng)性且抗體陰性的血清樣品平均S/P值為0.222，說(shuō)明當(dāng)PCV-2抗體陰性時(shí)圓環(huán)病毒陽(yáng)性率更高。豬血清中病原含量與抗體水平之間呈現(xiàn)不同的相關(guān)性。

3 討論

本試驗(yàn)采用韓國(guó)JBT公司生產(chǎn)的試劑盒，檢測(cè)樣品為血清，298份豬血清PCV-2抗體的S/P都小于1.8，268份抗體陽(yáng)性的平均S/P值為1.417，21份病原陽(yáng)性的血清抗體陽(yáng)性的平均S/P值為0.503，說(shuō)明當(dāng)PCV-2抗體陰性時(shí)圓環(huán)病毒陽(yáng)性率更高。通過(guò)查閱相關(guān)資料，發(fā)現(xiàn)這與孫華偉等[10]人的研究有出入。分析原因：本豬場(chǎng)的豬疫苗免疫時(shí)間已久，未發(fā)現(xiàn)PCV-2抗體的S/P高于1.8；PCV-2進(jìn)入體內(nèi)后首先在扁桃體和淋巴結(jié)中復(fù)制，隨后通過(guò)初級(jí)淋巴組織進(jìn)入全身淋巴組織器官，最后進(jìn)入全身各組織器官，肺臟是PCV-2侵染的主要靶組織。本試驗(yàn)的樣品為血清，血清中的成分易受環(huán)境影響，干擾因素比組織樣品多；豬群PCV-2感染比例隨著年齡增加而升高，因此豬群的年齡與此也有一定關(guān)系。因此檢測(cè)的穩(wěn)定性需要更多數(shù)據(jù)支撐。本試驗(yàn)只是初步探討血清中抗體與病原之間的關(guān)系，尚存在很多不足。試驗(yàn)說(shuō)明僅僅根據(jù)抗體檢測(cè)，還不能準(zhǔn)確地判定豬群是否感染了野毒，還有待更深入的研究通過(guò)抗體檢測(cè)判斷豬群是否感染了野毒。

自2000年，郎洪武等[11]初次分離出PCV-2，目前，我國(guó)多地均有PCV-2感染情況的報(bào)道[12-16]。PCV-2不僅在豬群分離到，在人、牛、嚙齒動(dòng)物等以及水、空氣、人用疫苗中都發(fā)現(xiàn)有PCV-2這為PCV-2的防控帶來(lái)嚴(yán)峻的考驗(yàn)[17]。PCV-2對(duì)外界抵抗力極強(qiáng)，可與其他病毒發(fā)生混合感染，如：豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、豬細(xì)小病毒等病原，從而誘發(fā)其他疾病發(fā)生，導(dǎo)致豬只死亡率明顯升高，最終給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。潘奕凡等[18]人研究發(fā)現(xiàn)增加免疫頻次可以提高豬的抗體水平，增強(qiáng)對(duì)PCV-2的抵抗力，達(dá)到降低PCV-2病原陽(yáng)性率，目前獸醫(yī)臨床上除豬偽狂犬病病毒 gpI 抗體(野毒)檢測(cè)試劑盒外，其余抗體檢測(cè)試劑盒均不能區(qū)分檢測(cè)到的抗體來(lái)是疫苗免疫還是野毒感染。由本試驗(yàn)可知，無(wú)論豬群的疫苗免疫接種是否合格，豬群都有可能感染圓環(huán)病毒2型。臨床上不僅需要檢測(cè)豬群的抗體水平，同時(shí)應(yīng)該檢測(cè)其病原，將攜帶有病毒的豬群進(jìn)行有效的淘汰和凈化，對(duì)抗體檢測(cè)為陰性的豬群進(jìn)行強(qiáng)化免疫。本試驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)抗體與病原，揭示其之間的相關(guān)性，為該病的診斷提供參考。