基于網(wǎng)絡藥理學探討益母草馬齒莧治療異常子宮出血的作用機制

秦璐璐，劉文瓊

（1.山東中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，山東 濟南 250014；2.山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院婦科，山東 濟南 250014）

異常子宮出血（abnormal uterine bleeding,AUB）是指與正常月經的周期、經期及經量中的任何一項不符、來源于宮腔的異常出血[1,2]。有資料顯示，AUB在生育期婦女中約占l/3，其中20%~50%為功血[3,4]。AUB發(fā)病率及就診率較高，且存在病因及發(fā)病機制復雜、治療局限及復發(fā)率高的問題，成為嚴重危害女性健康的疾病之一。目前西醫(yī)對AUB的治療較為局限，以激素及手術治療為主，人群接受率較低，所以迫切需要從中醫(yī)藥中尋找安全有效防治AUB的藥物。

益母草（Leonurus japonicus Houtt）在《雷公炮制藥性解》中曾記載：“味辛甘，性微寒，無毒，入諸陰經，本功治血”，且具有“行血而不傷新血，養(yǎng)血而不滯瘀血”的特點。益母草作為婦科常用藥物，被稱為“婦科經產之要藥”?，F(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)，益母草具有雙向調節(jié)子宮收縮活動、防止凝血、激素調節(jié)、調節(jié)子宮肌電、保護子宮內膜、促進子宮內膜復舊和抗子宮內膜炎等作用[5,6]。馬齒莧（Portulaca oleracea L.）作為中國傳統(tǒng)的藥食同用的藥物，具有毒副作用小的特點，《唐本草》載其可：“破血癖癥癖”，《滇南本草》中其有“催生下胎、療痔瘡紅腫熱痛”的作用，現(xiàn)在藥理研究發(fā)現(xiàn)馬齒莧不僅有抗炎、抗氧化的作用，而且對子宮具有興奮作用，任何劑量均不會引起子宮肌強直收縮，故馬齒莧的臨床應用安全范圍較大[7-9]。益母草和馬齒莧在臨床上治療異常子宮出血應用頗多，且藥量變化靈活，故本文以益母草馬齒莧作為研究目標，運用網(wǎng)絡藥理學方法篩選出該藥對的主要藥物活性成分，構建“藥物成分靶點通路”網(wǎng)絡，預測該藥對治療AUB的對應靶點及信號通路，從新的層面探討益母草馬齒莧治療AUB的可能作用機制。

1 資料與方法

1.1 提取益母草-馬齒莧的藥物有效成分及靶點

在TCMSP分析平臺（https://tcmspw.com/tcmsp.php）上，以生物利用度（oral bioavailability,OB）≥30%[4]和類藥性（drug likeness,DL）≥0.18[5]為條件指標，并檢索《中藥詞典》及相關文獻，篩選益母草及馬齒莧的化學成分，選擇“Related Targets”一欄，導出結果，提取中藥有效成分所對應的靶點，把獲取的益母草馬齒莧的中藥成分及其對應的靶點通過Uniprot數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）選出作用靶點的標準基因名。

1.2 提取AUB疾病相關基因

將“Abnormal uterine bleeding”分別在GeneCards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）、OMIM數(shù)據(jù)庫（https://omim.org/）中輸入，從而得到AUB相關的靶點基因。

1.3 獲取益母草-馬齒莧和AUB疾病靶點的交集

把益母草馬齒莧藥物靶點和AUB疾病靶點運用相應腳本，通過R 64 4.0.2軟件（https://www.r-project.org/）得到AUB疾病和益母草馬齒莧藥物交集靶點的韋恩圖。

1.4 構建中藥-有效成分-疾病-靶點調控網(wǎng)絡

將1.2中獲得的益母草馬齒莧藥物靶點和1.3中獲得的益母草馬齒莧和AUB交集靶點通過Perl腳本得到相應網(wǎng)絡關系，然后對該網(wǎng)絡通過Cytoscape3.7.2軟件（https://cytoscape.org/）進行可視化呈現(xiàn)，得到中藥 成分 疾病 靶點調控網(wǎng)絡圖，圖中的節(jié)點具體代表了中藥、有效成分、疾病和靶點，連線代表了上述節(jié)點之間的作用聯(lián)系。

1.5 建立中藥-疾病靶點蛋白互作網(wǎng)絡并選取核心基因

將中藥-疾病靶點輸入STRING 11.0在線軟件（http://string-db.org/cgi/input.pl），條件選為homo sapiens（human），保存所得結果，將所得結果輸入R 64 4.0.2軟件，從而獲得蛋白互作網(wǎng)絡核心靶點的條型圖。

1.6 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

運用R 64 4.0.2軟件計算中藥疾病靶點，獲得GO功能富集分析結果（表2、圖5和圖6）和KEGG通路富集分析結果（表3、圖7、圖8和圖9）。

1.7 分子對接技術驗證中藥活性成分與核心基因的結合活性

運用分子對接技術，選擇中藥的3個特征性活性成分與蛋白互作網(wǎng)絡中排名前3的靶點進行分子對接，通過PubChem找到中藥的化合物結構，導入Chem3D軟件對其空間結構進行優(yōu)化，通過RCSB PDB下載蛋白受體結構，使用AutoDock Tools 1.5.6對化合物進行去水、加氫和加電荷處理，根據(jù)配體的位置以及蛋白活性位點的坐標進行分子對接研究，通過結合能的大小對活性成分與靶點之間的結合活性進行評價，并用PyMOL進行分析作圖。

2 結果

2.1 益母草-馬齒莧藥物有效成分及靶點信息

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫（以OB≥30%和DL≥0.18為條件）檢索《中藥詞典》及相關文獻，對益母草-馬齒莧共篩選出19個藥物有效成分（其中益母草10個、馬齒莧12個，共有成分3個）（見表1），匯總去重后，獲取929個藥物靶點，通過UniProt數(shù)據(jù)庫檢索，其中僅有455個靶點可找到對應的標準基因名，然后利用R 64 4.0.2軟件將上述獲得的455個標準基因名與GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫中獲得的AUB相關基因進行匹配，最終得到92個共同靶點，將其作為候選靶點（見圖1）。

圖1 益母草-馬齒莧中藥成分作用靶點和AUB靶點韋恩圖Fig.1 Venn plots of the AUB targets and action targets of the motherwort-purslane

表1 益母草-馬齒莧藥物有效成分及其篩選參數(shù)Table 1 Active components and screening parameters of Motherwort and Portulaca oleracea

2.2 構建中藥-有效成分-疾病-靶點調控網(wǎng)絡的結果

Cytoscape構建調控網(wǎng)絡，得到114個節(jié)點（其中藥物2個，核心有效成分19個，疾病1個，靶點92個）和761條線（圖2）。結果顯示，芹菜素、槲皮素、山柰酚、木犀草素、楊梅黃酮和益母草堿等化合物可能是益母草馬齒莧治療異常子宮出血發(fā)揮治療作用的核心化合物。

圖2 中藥-成分-疾病-靶點調控網(wǎng)絡Fig.2 TCM-component-disease-target regulatory network

2.3 建立中藥-疾病靶點蛋白互作網(wǎng)絡并選取核心基因的結果

根據(jù)圖3、圖4可知，中藥疾病核心基因按鄰接節(jié)點數(shù)目從多至少按順序為IL6、INS、ALB、CASP3、EGFR、VEGFA、MAPK8、MYC、ESR1、CCND1、ERBB2、FOS、CYCS、AR、CASP8、RELA、CTNNB1、MDM2、PPARG、NOS3、ICAM1、MCL1、CASP9、CAV1、PGR、HIF1A、AHR、PARP1TNFRSF1A和CCNB1等，鄰接節(jié)點數(shù)目越多，越有可能成為核心基因。

圖3 中藥-疾病靶點蛋白互作網(wǎng)絡Fig.3 TCM-disease target protein interaction network

圖4 中藥-疾病核心靶點的條圖Fig.4 The bar chart of TCM core disease targets

2.4 GO功能富集分析結果

GO功能富集分析結果，見表2。通過GO功能富集分析共得出114條生物過程，選取P值最小的20條生物過程制作柱狀圖和氣泡圖（見圖5和圖6），其中類固醇結合、泛素樣蛋白連接酶結合、半胱氨酸型內肽酶活性參與凋亡過程、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結合描述因子結合及DNA結合轉錄激活劑活性等生物過程中靶點較為集中。

圖5 GO功能富集分析柱狀圖Fig.5 histogram of GO functional enrichment analysis

圖6 GO功能富集分析氣泡圖Fig.6 Bubble diagram of GO functional enrichment analysis

表2 GO功能富集分析結果Table 2 GO functional enrichment analysis results

2.5 KEGG通路富集分析結果

KEGG通路富集分析結果，見表3和圖9。122條信號通路從KEGG富集分析中得出，選擇P值最小的20條信號通路制作柱狀圖和氣泡圖（見圖7和圖8），靶基因主要集中在脂質和動脈粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、PI3K-Akt信號通路、p53信號通路和TNF信號通路等。

圖8 KEGG通路富集分析氣泡圖Fig.8 Bubble diagram of KEGG pathway enrichment analysis

圖9 KEGG通路分析圖Fig.9 The KEGG pathway analysis diagram

表3 KEGG通路富集分析結果Table 3 Results of the KEGG pathway enrichment analysis

圖7 KEGG通路富集分析柱狀圖Fig.7 The histogram of the KEGG pathway enrichment analysis

2.6 分子對接

選擇中藥的3個特征性活性成分芹菜素、楊梅黃酮和益母草堿與蛋白互作網(wǎng)絡中排名前3的靶點蛋白（IL6、INS和ALB），利用AutoDock軟件進行分子對接，結果見表4、圖10和圖11。本次對接用結合能來評價活性成分與蛋白的相互作用強度，若結合能＜0，表明配體分子均能和受體蛋白自發(fā)結合，結合能小于﹣20.92 kJ moL-1，表示有較好的結合活性，且數(shù)值越小結合活性越強[10]。結果顯示芹菜素與INS、ALB的結合能力均最強，IL6與楊梅黃酮的結合能力最強。

圖10 芹菜素與ALB分子對接模式圖Fig.10 Apigenin and ALB docking pattern diagrams

圖11 楊梅黃酮與IL6分子對接模式圖Fig.11 Myricetin and IL6 docking pattern diagrams

表4 益母草馬齒莧特征性活性成分與核心靶點的分子對接結果Table 4 Molecular docking results of the characteristic active components of Herba Leonuri and Portulaca oleracea with core targets

3 討論

異常子宮出血西醫(yī)病因復雜，如宮腔內膜息肉、子宮平滑肌瘤、子宮腺肌病、排卵功能障礙和凝血相關疾病等都可導致AUB的發(fā)生，中醫(yī)稱為“崩漏”，多是由于腎虛、脾虛、血熱及血瘀等病因導致沖脈任脈損傷，不能約束經血所致，在治療上，西醫(yī)較為單一，且遠期療效欠佳，復發(fā)率較高，中醫(yī)則采用“急則治其標，緩則治其本”的原則，提出了“塞源”、“澄源”、“復舊”的“治崩三法”，中醫(yī)藥采用辨證論治的原則，臨床治療效果較好，因其獨特的價值，臨床挖掘潛力巨大。

本文以益母草馬齒莧藥為研究對象，在最終得到的19個核心有效成分中，以芹菜素、槲皮素、山柰酚、木犀草素、楊梅黃酮和益母草堿與疾病的關系最為密切。芹菜素具有抗氧化、抗炎特性，通過控制自噬以改善組織損傷[11]；楊梅黃酮可增強免疫功能，抑制細胞因子，改善心功能不全，具有抗腫瘤潛能[12]；槲皮素的止血療效是通過抑制血小板激活因子與抗血小板聚集發(fā)揮作用，此外，槲皮素還有較強的防氧化、抗炎和清除氧自由基的作用[13-17]；Chen等[18]發(fā)現(xiàn)木犀草素可以減少脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）對小白鼠肺泡MH-S細胞刺激而產生的促炎癥因子、腫瘤壞死因子（TNF-）、白細胞介素6（IL-6）、炎癥介質一氧化氮（NO）和前列腺素E2（PGE2），減少炎癥因子和過量的活性氧對機體造成的損傷，另外，它還具有免疫調節(jié)、抗腫瘤作用、抗激素和抗氧化的作用[19,20]；山柰酚是一種黃酮類化合物，通過調節(jié)炎癥相關蛋白表達、抑制轉錄因子激活等方式減少炎癥因子的發(fā)生、發(fā)展，且還具有防氧化、防癌抗癌及抗病毒等多種療效[21-24]；益母草堿可減少藥物流產后子宮出血量并縮短出血時間，減少宮內殘留，通過改善下丘腦垂體卵巢軸（HPOA）、增加雌二醇含量，進而改善子宮異常出血[25]。

此外，益母草馬齒莧與異常子宮出血的核心基因很可能是IL6、ALB、VEGFA、CASP3和EGFR。IL6（白介素-6）作為一種細胞因子，對B淋巴細胞的成熟以及炎癥過程起重要的作用，有研究證明在子宮內膜病變過程中常伴有白介素-6的過分表達[26,27]；ALB（白蛋白）具有維持血漿膠體滲透壓的作用，另外ALB作為一種非專一性的載體蛋白，能可逆性地與體內許多難溶性的小分子有機物和無機離子進行結合，利于這些物質在血液循環(huán)中運行，黃敏[28]研究發(fā)現(xiàn)，白蛋白可以運輸紫杉醇作用于腫瘤細胞，從而能使紫杉醇發(fā)揮更強大的抗腫瘤效果；有研究表明，VEGFA（血管內皮生長因子）在圍絕經期子宮平滑肌肌瘤合并AUB患者的子宮內膜組織中具有過分表達，且與BFGF相互調控，促進子宮內膜增長并導致異常出血；另一項研究表明子宮腺肌病和宮腔內膜息肉的發(fā)病原因之一可能是血管的異常生成，已有研究證實VEGFA的過分表達和異常出血的發(fā)生呈正相關的關系[29,30]；CASP3（胱天蛋白酶3）是一種與細胞凋亡密切相關的酶，有研究證明Caspase-3的低表達可能促使細胞抗凋亡的能力增強，從而導致細胞凋亡減少而增殖過度，這可能是子宮內膜異常增生的發(fā)病機制[31]；EGFR（表皮生長因子受體）具有酪氨酸激酶活性，通過與EGF結合，進而促進細胞分裂增殖。有研究結果顯示，子宮內膜癌變組織、子宮內膜非典型增生組織和正常子宮內膜組織中EGFR的陽性比率分別是74.4%、38.1%和18.4%，EGFR在由正常子宮內膜細胞向子宮內膜癌變細胞轉變過程中起到了至關重要的作用[32]。

GO富集分析包括類固醇結合、泛素樣蛋白連接酶結合、半胱氨酸型內肽酶活性參與凋亡過程、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結合描述因子結合和DNA結合轉錄激活劑活性等多種生物學過程。在KEGG富集分析中，結果表示靶基因主要集中在PI3K-Akt、MAPK、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE和TNF等信號通路上。PI3K-Akt信號通路主要參與體內細胞的分化、增殖和凋亡過程，PI3K被激活后會募集并激活下游的信號分子Akt，Akt被激活后會促使mTOR和NF-B的活化，活化后的磷酸化底物會促使細胞的增殖，另外，PI3K/AKT及其關鍵因子PI3K、AKT與血管的生成密切相關[33]；MAPK信號通路可以被炎性因子、細胞因子及物理應激等刺激所激活，從而誘導炎性細胞及其他細胞的增殖與分化；還有研究發(fā)現(xiàn)，MAPK信號通路的激活與子宮內膜容受性和蛻膜的形成密切相關[34-36]；糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路可激活核轉錄因子-B（NF-B），刺激VEGF和TGF-1的產生，誘導MCP-1的表達，從而引起慢性細胞活化和組織損傷，增加血管的通透性，進而促進多種趨化因子、炎癥因子及黏附因子的釋放，如MCP-1、白細胞介素-1等，從而導致機體的損傷[37]。通過本次KEGG富集分析得到的AGE-RAGE信號通路圖中可以看到，益母草馬齒莧可能通過激活下游不同的效應蛋白如JNK、NF-B和Bcl-2等，進而調控下游的靶蛋白如IL-6、VEGF、casp3等對AUB起到治療作用；TNF信號通路是一個炎癥誘導細胞因子通路，TNF信號主要由其細胞膜受體TNF-R1和TNF-R2介導，研究表明TNF家族的細胞因子主要通過激活NF-B途徑誘導和調節(jié)炎癥、細胞存活、增殖和分化基因的快速轉錄，NF-B可以通過TNF-信號通路促進卵巢癌變細胞的增殖和轉移[38,39]，在本次KEGG富集分析中得到的TNF信號通路圖可能是通過激活下游不同的效應蛋白如JNK和NF-B等，進而調控下游的靶蛋白如炎癥細胞因子IL-6、細胞內信號因子NF bia、轉錄因子Fos及細胞黏附因子Icaml等對異常子宮出血起到治療作用。本文通過分子對接技術驗證了益母草馬齒莧兩味中藥的特征性活性成分芹菜素、楊梅黃酮、益母草堿與IL6、INS、ALB具有較強的結合活性，進一步說明了益母草馬齒莧對AUB具有較大的臨床治療潛力。

綜上所述，本文通過網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術，得出益母草馬齒莧可能是通過多成分、多靶點和多通路的方式對異常子宮出血起到相應的治療作用，初步對益母草馬齒莧治療異常子宮出血作用機制進行了闡述，這也為以后臨床應用益母草馬齒莧提供了客觀依據(jù)。