人參三醇組皂苷質(zhì)量標準的初步研究

陳小玲，司函瑞，付東興，趙瑩，李平亞

（吉林大學藥學院，吉林 長春 130021）

關鍵字：人參三醇組皂苷；指紋圖譜；聚類分析；質(zhì)量標準；高效液相色譜法

人參是五加科多年生草本植物人參（Panaxginseng C.A.Mey.）的干燥根和根莖，人參皂苷是其主要的成分之一，具有延緩衰老、抗疲勞、保護肝臟和心血管系統(tǒng)、抗應激、抗誘變、抗癌、抗糖尿病、抗氧化和抗炎等藥理作用[1]，人參皂苷是一種固醇類化合物，根據(jù)苷元結(jié)構(gòu)的不同可分為人參二醇型皂苷、人參三醇型皂苷和齊墩果烷型皂苷[2]，目前已知人參三醇組皂苷主要含有人參皂苷Re、Rf、Rg1、Rg2、Rh1和PPT（皂苷元原人參三醇）等，結(jié)構(gòu)見圖1。研究表明，人參三醇組皂苷經(jīng)過徹底水解能得到PPT，人參三醇組的人參皂苷Re首先通過水解C-20位的葡萄糖生成人參皂苷Rg2，再水解C-6位的鼠李糖生成人參皂苷Rg1；Rg2水解C-6位的鼠李糖和葡萄糖，Rg1繼續(xù)水解C-20位的葡萄糖均生成人參皂苷Rh1，人參皂苷Rf通過水解C-6位的葡萄糖亦生成Rh1；Rh1繼續(xù)再水解C-6位的葡萄糖生成PPT[3,4]。人參皂苷Re、人參皂苷Rg2和人參皂苷Rh1作為人參三醇組皂苷的主要成分，又是人參三醇組皂苷水解制備PPT的重要原料藥以及中間體成分，因此選擇測定人參三醇組皂苷的人參皂苷Re、人參皂苷Rg2、人參皂苷Rh1以及PPT的含量作為控制人參三醇組皂苷原料質(zhì)量的指標成分。

圖1 人參三醇組皂苷結(jié)構(gòu)圖Fig.1 The structure diagrams of the protopanaxtriol saponins

研究發(fā)現(xiàn)，PPT具有較好地改善心肌細胞損傷的功效，可能是治療心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia/reperfusion injury，MI/RI）的一個有效的單體藥物，其作用機制主要與其抗氧化能力以及抗細胞凋亡的能力有關[5]；PPT還具有調(diào)節(jié)代謝紊亂和抑制脂質(zhì)合成作用[6]，在多種腫瘤中發(fā)揮抗腫瘤作用[7]。擬對PPT研究開發(fā)成治療心肌缺血的新藥，而人參三醇組皂苷原料是制備PPT的重要來源，建立人參三醇組皂苷原料的質(zhì)量標準可以在源頭上控制PPT的質(zhì)量，因此，建立人參三醇組皂苷原料的質(zhì)量標準是非常有必要的。

本研究建立了HPLC法同時測定人參三醇組皂苷Re、Rg2、Rh1及PPT的含量[8-10]，對人參三醇組皂苷進行性狀和薄層鑒別[11-14]并建立了指紋圖譜[15-18]，為人參三醇組皂苷質(zhì)量標準的初步建立提供了一定的參考依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

人參莖葉總皂苷（含量為37%）（購于吉林瑞隆藥業(yè)有限公司，批號：200801）；人參皂苷Re、Rg2、Rh1和PPT標準品（自制），含量均在98%以上；95%乙醇；甲醇和乙腈為色譜純，水為純凈水，其余試劑為分析純。

1.2 設備

Acchrom高效液相色譜儀（華譜新創(chuàng)科技有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器XD-2000A（上海賢德實驗儀器有限公司）；恒溫浴鍋（上海豫康科教儀器設備有限公司）；DLSB-2L/-20低溫冷卻液循環(huán)泵（長春吉豫科教儀器設備有限公司）；GZX-9076 MBE數(shù)顯鼓風干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）；PTX-FA210S電子天平[華志（福建）電子科技有限公司]。

2 實驗與結(jié)果

2.1 人參三醇組皂苷的制備工藝

取人參莖葉總皂苷適量用水使其完全溶解，上AB-8大孔樹脂至完全吸附，然后依次用30%、40%、80%和90%的乙醇溶液洗脫，收集30%和40%的乙醇溶液洗脫，合并，回收溶劑，烘干，得人參三醇組皂苷，標號第1批。

取人參莖葉總皂苷10 g，溶于100 mL 95%乙醇中，濾過得濾液（溶液A）；另取氫氧化鈉2.5 g，溶于7.5mL水中，充分溶解后向其中加入95%乙醇500mL，得0.5%（W/V）氫氧化鈉乙醇溶液（溶液B），不斷攪拌下，將溶液B緩慢加到溶液A中，可見絮狀沉淀生成，室溫靜止24 h，減壓過濾，收集濾液，回收溶劑，烘干，得到人參三醇組皂苷，標號第2批，平行制備得第3批、第4批[19]。

取人參莖葉總皂苷3.0 kg，加入95%乙醇5 L，水浴80℃溶解，得A液；取160 g NaOH，溶于250 mL水中，再加入18 L乙醇，混勻，得B液；將B液在攪拌下緩慢加入A液中，逐漸有沉淀析出，靜止過夜；過濾，收取濾液部分，80℃烘干，粉碎，得人參三醇組皂苷，標號第5批。平行制備得第6批、第7批、第8批、第9批、第10批。

2.2 性狀鑒別

取第1批、第2批、第5批的人參三醇組皂苷粉末適量進行觀察鑒別[20]，其性狀鑒別結(jié)果，見表1和圖2。

表1 人參三醇組皂苷性狀鑒別結(jié)果（n=3）Table 1 Identification results of protopanaxtriol saponins(n=3)

圖2 人參三醇組皂苷粉末Fig.2 The powder of the protopanaxtriol saponins

根據(jù)3批人參三醇組皂苷粉末的性狀結(jié)果，規(guī)定本品為淡黃色或黃色粉末，氣微，味苦。

2.3 薄層鑒別

取本品粉末約0.05 g，加甲醇制成1mL，使其充分溶解，作為供試品溶液。另取人參皂苷Re、Rg2、Rf、Rh1和PPT標準品適量，用甲醇制成每1mL含有2mg的溶液作為對照品溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗[21]吸取上述溶液各1~2L，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（2:2:4:1）常溫放置的下層溶液為展開劑展開，取出，晾干，噴以10%的硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應位置上，分別顯相同顏色的斑點，結(jié)果見圖3。

圖3 薄層色譜鑒別結(jié)果Fig.3 The TLC identification results

2.4 含量測定

2.4.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18（250 mm4.6 mm,5m）；流動相為乙腈（A）水（B），梯度洗脫（程序見表2）；檢測波長：203 nm；柱溫：30℃；體積流量：1.0mL/min；進樣量：10L。

表2 梯度洗脫程序Table 2 The gradient elution program

2.4.2 溶液的制備

2.4.2.1 混合對照品溶液的制備取標準品人參皂苷Re、Rg2、Rh1及PPT標準品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含人參皂苷Re 0.66 mg、Rg20.7 mg、Rh10.26 mg和PPT 0.36 mg的混合對照品溶液。

2.4.2.2 供試品溶液按“2.1”項下方法制備人參三醇組皂苷粉末，取粉末適量，精密稱定，用甲醇溶解，并轉(zhuǎn)移到10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得供試品溶液。

圖4 高效液相色譜圖Fig.4 High performance liquid chromatogram

2.4.5 精密度的考察取同一供試品（第5批）溶液適量，按“2.4.1”項下的色譜條件重復進樣5次，記錄峰面積。結(jié)果，人參皂苷Re、Rg2、Rh1和PPT的RSD分別為1.76%、2.60%、2.21%和0.62%（n=5），表明精密度較好。

2.4.6 穩(wěn)定性的考察取樣品（第5批）適量，按“2.4.1”項下方法制備供試品溶液，分別于放置0 h、4 h、8 h、12 h、24 h和48 h時按照“2.4.1”項下的色譜條件進樣測定并記錄峰面積。結(jié)果，人參皂苷Re、Rg2、Rh1和PPT的RSD分別為2.87%、2.38%、1.27%和1.96%（n=6）。這表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.4.7 重復性試驗取樣品（第5批）適量，共6份，按“2.4.4”項下方法制備供試品溶液，再按“2.4.1”項下色譜條件測定，記錄峰面積，并計算樣品含量。結(jié)果，人參皂苷Re、Rg2、Rh1和PPT的含量分別為209.37mg/g、8.59 mg/g、2.72 mg/g和1.39 mg/g，RSD分別為2.12%、2.20%、2.35%和3.85%（n=5）。方法重現(xiàn)性較好。

2.4.8 加樣回收率試驗 按照“2.4.3”項下操作制備混合對照品溶液，混合對照品溶液中人參皂苷濃度分別為Re 0.66 mg/mL、Rg20.7 mg/mL、Rh10.26 mg/mL和PPT 0.36 mg/mL。精密稱取已知含量的樣品（第5批）6份，每份約0.05 g，精密稱定，分別精密加入上述混合對照品溶液100L，定容至10mL，按照“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率，結(jié)果見表3。

表3 加樣回收率試驗結(jié)果（n=6）Table 3 The experimental results of the sample recovery rates(n=6)

2.4.9 樣品含量測定取“2.1”項下制備的第1批、第2批、第5批以及第8批約0.05 g，按“2.4.4”項下方法制備供試品溶液，并按照“2.4.1”項下的色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，結(jié)果如表4。

表4 樣品含量測定結(jié)果Table 4 The sample contents of the determination results

2.5 指紋圖譜的建立與分析

2.5.1 指紋圖譜的建立與共有峰的確定取10批的人參三醇組皂苷粉末適量，按照“2.4.2.2”項下制備供試品溶液，按照“2.4.1”項下的色譜條件進樣分析，記錄樣品的色譜圖并導出指紋圖譜，將這10批人參三醇組皂苷的指紋圖譜導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A版”軟件中，以編號為S10的指紋圖譜為參照圖譜，時間窗寬度設置為0.10，經(jīng)多點校正，自動匹配，生成人參三醇組皂苷樣品粉末的疊加圖譜見圖5，以平均數(shù)法生成人參三醇組皂苷的對照圖譜見圖6。共確定17個共有峰，通過與對照品圖譜對比可知，1為人參皂苷Re，3為人參皂苷Rg2，5為人參皂苷Rh1，17為PPT，10批人參三醇組皂苷指紋圖譜的共有峰的相對保留時間和峰面積的RSD分別為0.01%~1.3%和9.48%~142.08%，這說明10批的人參三醇組皂苷的成分類似，各成分間含量差異較大[22,23]。

圖5 10批人參三醇組皂苷的HPLC指紋圖譜Fig.5 The HPLC fingerprints for the 10 batches of protopanaxtriol saponins

圖6 人參三醇組皂苷的對照指紋圖譜Fig.6 The control fingerprint of protopanaxtriol saponins

2.5.2 相似度評價選擇“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A版”軟件中的分析檢驗對10批人參三醇組皂苷樣品粉末的指紋圖譜進行相似度計算，結(jié)果見表5。觀察表5可知，人參三醇組皂苷的指紋圖譜與對照品的指紋圖譜相似度范圍為0.829~0.998，其中第1批（S1）與其他9批相比，相似度均小于0.9；第2批（S2）、第3批（S3）、第4批（S4）、第5批（S5）與第9批（S9）、第10批（S10）相比，相似度也小于0.9，而與第6批（S6）、第7批（S7）、第8批（S8）樣品相比相似度均大于0.9；第9批、第10批樣品與第6批、第7批、第8批樣品相比，相似度均大于0.9。這表明第1批樣品與其他9批樣品相似度較低，第2批、第3批、第4批、第5批與第9批、第10批相比相似度較低，而第6批、第7批、第8批與第2批、第3批、第4批、第5批以及第9批、第10批的相似度較好，化學成分相似。

表5 10批人參三醇組皂苷的相似度結(jié)果Table 5 The similarity results for the 10 batches of protopanaxtriol saponins

2.5.3 聚類分析使用SPSS 25.0軟件，以人參三醇組皂苷的指紋圖譜中17個共有峰的峰面積為變量，聚類方法采用平均組間聯(lián)接，區(qū)間平均歐氏距離測量繪制樹狀圖[24]，如圖7，結(jié)果表明，當歐氏距離為5時，10批樣品被分為4類，第1批為一類；第2批為一類；第3批、第4批為一類；第5批、第6批、第7批、第8批、第9批以及第10批為一類；當歐氏距離為10時，10批樣品被分為3類，第2批為一類；第1批、第3批和第4批為一類；第5批、第6批、第7批、第8批、第9批以及第10批為一類；當歐氏距離為15時，10批樣品被分為2類，第1批、第2批、第3批和第4批為一類；第5批、第6批、第7批、第8批、第9批以及第10批為一類。這種分類方式可能與其制備方式有關，其中當歐式距離為5、10、15時，第5批、第6批、第7批、第8批、第9批以及第10批均為一類，這說明第3種制備方法中人參三醇組皂苷的含量差異較小，制備方法穩(wěn)定。從工藝穩(wěn)定性上建議采用第3種制備方法制備人參三醇組皂苷。

圖7 10批人參三醇組皂苷的聚類分析結(jié)果圖Fig.7 The cluster analysis results for the 10 batches of protopanaxtriol saponins

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

通過對比4批樣品可知，“2.1”項下的3種方法制備的人參三醇組皂苷中的人參皂苷Re、Rg2、Rh1及PPT含量相差較大，且第3種方法具有節(jié)約時間，操作簡單的優(yōu)點，工業(yè)上宜采用第3種方法制備人參三醇組皂苷。

已有文獻采用的HPLC法同時測定人參皂苷Re以及其他皂苷的方法梯度復雜，檢測時間長，且測定的皂苷多以總皂苷為主[25-28]。本研究建立了HPLC法測定人參莖葉人參三醇組皂苷Re、Rg2、Rh1以及PPT的含量方法，在保證分離度以及不影響檢測結(jié)果的前提下，克服了已有檢測方法檢測時間長的缺點，提高了檢測效率，且人參皂苷Re、Rg2、Rh1以及PPT既是人參三醇組皂苷的重要組成成分，亦是制備PPT的重要原料藥及中間體，選擇測定這4種皂苷對于制定人參三醇組皂苷質(zhì)量標準有著重要的意義。

3.2 結(jié)論

本研究對不同方法制備的人參三醇組皂苷進行了性狀鑒別、顯微鑒別以及含量測定，并建立了人參三醇組皂苷的指紋圖譜。建立了HPLC法同時測定人參三醇組皂苷中的人參皂苷Re、Rg2、Rh1及PPT含量的方法，可為人參三醇組皂苷質(zhì)量標準的建立提供科學依據(jù)。

性狀鑒別結(jié)果表明人參三醇組皂苷是淡黃色或黃色粉末，氣微，味苦；薄層鑒別色譜結(jié)果表明人參三醇組皂苷主要含有人參皂苷Re、Rg2、Rf、Rh1及PPT，供試品色譜圖與對照品色譜圖在相同的位置上顯示相同的斑點。本實驗建立了同時測定人參三醇組皂苷中Re、Rg2、Rh1及PPT含量的HPLC法，該方法操作簡單，分離度好，通過該方法測定可知，人參三醇組皂苷中人參皂苷含量分別為Re 179.76 mg/g、Rg211.57 mg/g、Rh13.09 mg/g和PPT 1.60 mg/g。這表明人參皂苷Re是人參三醇組皂苷中含量最高的成分；10批的人參三醇組皂苷樣品共標出17個共有峰，通過與對照品圖譜對比可確認4個有效成分，分別為人參皂苷Re、人參皂苷Rg2、人參皂苷Rh1以及PPT，相似度分析結(jié)果表明同一制備方法得到的樣品相似度較高，聚類分析將10批樣品分為4類，分別對應其不同的制備方法。

目前尚未見國內(nèi)（外）文獻報道人參三醇組皂苷質(zhì)量標準的研究，本研究建立了人參莖葉人參三醇組皂苷的性狀鑒別、薄層鑒別、含量測定以及指紋圖譜，為完善人參三醇組皂苷的質(zhì)量標準，仍需要對人參三醇組皂苷進行更深入的研究與總結(jié)。