苗藥葉上花莖和根的顯微鑒別

宋夢姿，蔣艷洲，路瑀璠，羅春麗※

（1.貴州大學貴州省藥用植物繁育與種植重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.華中科技大學同濟醫(yī)學院藥學院，湖北 武漢 430030；3.黔西南州義龍藍天學校，貴州 興義 562400）

葉上花[Helwingia japonica(Thunb.)Dietr.]是山茱萸科青莢葉屬的落葉小灌木[1]，全株可作藥[2,3]，又被稱為葉上珠、葉上果等。和平時常見植物的開花結果不同，葉上花的花果都長在葉片上，一般在中間葉脈靠近葉柄的位置，開花部位特殊且花的美感性強，因此，在藥用價值和觀賞價值方面都引起了人們的廣泛關注，成為了一種難得的、可以進行關注開發(fā)的藥用植物。

顯微鑒別方法作為中藥鑒別方法之一，被許多學者用來鑒別藥材的真?zhèn)?、?yōu)劣及純度等。如李俊松等[4]利用性狀和粉末顯微鑒別等將百部科百部屬中塊根外形極為相似的3個物種區(qū)分。高敏等[5]用粉末顯微鑒定方法對2005版《中國藥典》收錄的5個品種淫羊藿進行分析，最終以葉片非腺毛和上表皮細胞特征作為鑒別依據(jù)。覃挺紅等[6]通過性狀、顯微鑒別方法比較易混淆的6種紫珠屬植物葉片，對其紫珠屬葉類藥材的利用提供重大意義。

葉上花作為苗族習用藥材，目前開展的相關研究極少；同時，由于西南少數(shù)民族地區(qū)特殊的地形和文化傳播方式，造成了葉上花在流傳過程中易混品種較多，不利于葉上花的研究、開發(fā)和利用[7-12]。因此，以苗族習用葉上花為研究對象進行了植物形態(tài)、根、莖及粉末的顯微鑒別，以期為其進一步系統(tǒng)生藥學鑒別及合理應用提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 實驗條件

實驗地點：貴州省藥用植物繁育與種植重點實驗室；貴州大學農(nóng)學院中藥藥劑學實驗室。

實驗材料：材料來源于貴州省畢節(jié)市七星關區(qū)清灣村野生的葉上花。

儀器設備：石蠟切片機（YD-201A型，浙江省金華市益迪醫(yī)療設備有限公司）；生物組織烤片機（YD-B型，浙江省金華市益迪醫(yī)療設備有限公司）；熒光顯微鏡（OLYMPUS DP73型，日本Olympus公司）；體視顯微鏡（Nikon SMZ800型，日本尼康公司）；電熱鼓風干燥箱（101-3AB型，天津市泰斯特儀器有限公司）。

實驗試劑：無水乙醇（重慶川東化工有限公司）；二甲苯、冰乙酸和甘油（天津市風船化學試劑科技有限公司）；苯酚、堿性品紅和水合氯醛（天津市致遠化學試劑有限公司）；甲醛（西隴科學股份有限公司）；丙酸（上海麥克林生化科技有限公司）；番紅花紅T（天津市科密歐化學試劑有限公司）；固綠（北京索萊寶科技有限公司）；明膠（天津市福晨化學試劑廠）；龍膽紫（中國上海遠航試劑廠）。實驗所用FAA固定液、FPA固定液、1%番紅染液、0.5%固綠染液、黏片劑、軟化劑均為按比例自行配制試劑。

1.2 實驗方法

根據(jù)國內(nèi)外文獻和藥用植物相關的書籍對青莢葉、中華青莢葉、浙江青莢葉、峨眉青莢葉和西域青莢葉的形態(tài)描述及分布，對比植株本身，確定其植株的來源。從整體植株形態(tài)對本次實驗材料進行描述，并觀察各部分的大小、性狀、顏色及斷面的特征。

研究所用的葉上花的莖和根使用FAA或FPA固定液進行固定，固定時間為24h，采用石蠟切片技術[13,14]對葉上花的莖和根進行制片，切片的厚度為8m。用番紅 固綠染液（對染法）[15]對制好的葉上花莖的橫切片進行染色；用堿性品紅 龍膽紫[16]染液（二重染色法）對葉上花的根進行染色，根據(jù)實際情況適當調(diào)節(jié)脫水、浸蠟時間[17]，對于木質(zhì)化嚴重的部位可以進行軟化[18,19]。裝片用熒光顯微鏡（OLYMPUS DP73型）和體視顯微鏡（Nikon SMZ800型）觀察，選擇符合要求、相對清晰的圖片進行拍照。

2 結果與分析

2.1 來源鑒定

根據(jù)已知藥用植物相關書籍與文獻[20,21]中對青莢葉、中華青莢葉、浙江青莢葉、峨眉青莢葉和西域青莢葉的形態(tài)描述及分布情況可知：青莢葉屬的植物喜愛蔭蔽環(huán)境，且耐濕潤，我國擁有的青莢葉屬植物有5種，且大多品種分布于四川、云南境內(nèi)，尤其是中華青莢葉和西域青莢葉。根據(jù)《中國植物志》中對5種青莢葉的敘述可知：中華青莢葉屬于落葉小灌木，葉片背面顏色比正面淺，為淺綠色；葉片為線狀披針形、狹披針形，葉不如其他4種青莢葉的葉寬；葉緣的短刺為腺狀具細鋸齒等不同特征，對比植株本身確定實驗材料為中華青莢葉。

圖1 葉上花性狀圖Fig.1 The characteristic of Helwingia japonica

觀察并記錄中華青莢葉的各部位外觀性狀如下：葉上花植株全株高可達1~3 m，屬落葉的小灌木。葉上花的根為直根系，主根為近圓柱狀，表面較粗糙，有栓皮和皮孔，質(zhì)重堅實，折斷面纖維性，形成層環(huán)紋內(nèi)的木質(zhì)部發(fā)達。莖為攀緣莖，呈圓柱形，直徑為0.3~1 cm，存在木質(zhì)化現(xiàn)象的主莖表面呈深棕紫色，顏色隨著莖的幼嫩程度而逐漸變深綠，表面無毛，具有縱紋和少量紋孔，木質(zhì)莖質(zhì)硬而韌，不易折斷，嫩莖斷面有黏質(zhì)液體。葉片為披針形，質(zhì)感為革質(zhì)或近革質(zhì)，兩面均光滑無毛，葉片背面顏色較正面淺，葉片互生，葉尖端略驟尖，葉基呈楔形，葉緣呈睫毛狀，具有短刺，葉脈為羽狀網(wǎng)脈，主葉脈靠近葉柄部分呈暗紫色，其余部分呈深綠色，越靠近植株頂端，葉生長越密集。花朵開在靠近葉柄部分的主葉脈上，花瓣一般為3片，為卵形的排列方式；雌雄異株，雄花的花梗極短，為傘狀花序，花藥3~5個；雌花無花梗[20]；花期4~5月，果落后會留下果梗殘基。

2.2 莖的橫切面顯微結構

實驗材料所用的葉上花的莖屬于幼嫩部位，所用材料的直徑約為1 890m，切片（圖2）中看到的是莖的初生構造，周皮不發(fā)達，可以看出莖的表皮、皮層、髓和維管束等部分[22]。

圖2 葉上花莖橫切面圖（左：100x；右：60x）Fig.2 Stem cross section diagrams of Helwingia japonica(Left:100x;Right:60x)

表皮細胞單列，由長方形扁平細胞緊緊相連并規(guī)則排列而成，切片中可能存在皺縮現(xiàn)象影響觀察效果，觀察到表皮細胞的細胞壁略微加厚，即存在角質(zhì)化現(xiàn)象；皮層由多層球形、多面體等不規(guī)則形狀細胞組成，實驗中皮層寬度約為273m；越接近維管柱細胞越大，細胞壁越薄，多數(shù)為薄壁細胞，沒有表皮細胞排列的緊密度高，內(nèi)含棕色物質(zhì)，可以觀察到草酸鈣方晶，接近表皮細胞部分細胞較小，存在厚角組織，可以加強莖的韌性；維管束寬約128m，射線明顯，每個維管束之間的束間區(qū)域距離較大。初生韌皮部則位于維管束的外部，與薄壁細胞相鄰，不能明顯看出界限。初生木質(zhì)部則位于維管束的內(nèi)側(cè)，與髓部緊挨，界限也不明顯；束中形成層不太明顯，維管束正在生長延伸階段，整個形成層連接成環(huán)。以上韌皮部、木質(zhì)部和束中形成層3部分共同構成維管束。實驗材料的髓部直徑約為1 060m，髓部相對較大，約占據(jù)整個實驗材料面積的31%。由不同大小、近似六邊形的細胞不規(guī)則排列組成，大多為薄壁細胞，髓中心的細胞相對于周圍的細胞體積更大、細胞壁更薄。

2.3 莖的粉末鑒定

葉上花的莖的干燥粉末在自然光下顯現(xiàn)為黃白色。多見草酸鈣結晶和導管等結構[23]。

如圖3所示，葉上花莖的粉末顯微圖可以觀察到以下內(nèi)容：表皮細胞為不規(guī)則的多邊形，細胞壁增厚，內(nèi)含有棕色物質(zhì)，并具有紋孔。導管是由管胞分化而來，在葉上花木質(zhì)部中導管和管胞有同時存在的現(xiàn)象，二者分子短小，但導管數(shù)量略多于管胞，直徑可達70m。導管多呈具緣網(wǎng)紋狀和螺旋狀，兩端不尖銳凸起；管胞多為梯紋管胞，兩端稍凸起，直徑稍小于導管直徑；草酸鈣結晶呈多面不規(guī)則長方體，判斷為草酸鈣方晶，一般以單個或幾個散在的形式存在；淀粉粒較多，一般在10m以下，較大的淀粉粒可以看到層紋；韌皮部射線明顯。

圖3 葉上花莖的熒光顯微鏡粉末鑒定圖（400x）Fig.3 Stem powder identification charts of Helwingia japonica(400x)observed by the fluorescence microscope

2.4 根的橫切面顯微結構

葉上花根整體呈圓形或近圓形，實驗材料的直徑約為1 872m，具有次生構造，未在橫切面的顯微結構圖中發(fā)現(xiàn)異常構造。葉上花根的木質(zhì)部較發(fā)達，射線明顯。

如圖4所示，葉上花根的具體構造如下，周皮為根部最外層，由小于10列的扁平的薄壁細胞連接成環(huán)，這些細胞排列規(guī)則但不緊密，木栓層存在脫落現(xiàn)象。皮層較窄，由不規(guī)則的近圓形的細胞組成。葉上花根的維管束屬于無限外韌型。初生韌皮部分化后剩余部分較少，次生韌皮部中的射線在切片中未能表現(xiàn)完全；在薄壁細胞中存在草酸鈣結晶。葉上花根的韌皮部、木質(zhì)部界限明顯，即形成層較為明顯，由數(shù)列近似方形的細胞連接成環(huán)狀。初生木質(zhì)部分化至整個根的中心部位，無髓；次生木質(zhì)部較發(fā)達，直徑可達900m，可在顯微切片圖中清楚觀察到。以上5部分共同組成一個完整的維管束結構。實驗中用鹽基品紅 龍膽紫染色可將韌皮部染成深藍紫色，木質(zhì)部為深紅紫色。木質(zhì)部中導管呈類圓形，且存在木纖維。

圖4 葉上花根橫切面圖（左：100x；右：40x）Fig.4 Root cross section diagrams of Helwingia japonica(Left:100x;Right:40x)

3 結論

通過文獻查閱及原植物形態(tài)對比觀察，初步確定苗族習用藥材葉上花來源為山茱萸科青莢葉屬的落葉小灌木中華青莢葉[Helwingia japonica(Thunb.)Dietr.]。觀察到側(cè)根生長的部位比較靠上，在主莖上接近葉片生長的部位會出現(xiàn)側(cè)根；通過石蠟切片技術對其莖和根的顯微結構進行觀察，得到莖和根的橫切面圖。觀察顯微結構圖得知，葉上花莖和根的結構構造正常，主要特點為葉上花莖的薄壁細胞中存在草酸鈣方晶，管胞和導管同時存在，且導管多為具緣網(wǎng)紋狀，莖的韌皮部射線呈放射狀，且十分明顯，莖的木質(zhì)部沒有根的木質(zhì)部發(fā)達；根的維管束屬于無限外韌型，形成層明顯。

4 討論

目前，國內(nèi)外前期對青莢葉屬植物的研究較少，且主要集中在分離提取化合物方面，對其鑒別方面的研究鮮為報道。本實驗為了能更好地解決葉上花品種混亂問題，以葉上花顯微鑒定方法為主，對葉上花根與莖兩部分進行顯微結構特點分析，在一定程度上為葉上花的合理利用提供較為全面的依據(jù)。在實驗開展過程中，發(fā)現(xiàn)葉上花根的木質(zhì)化現(xiàn)象較嚴重，側(cè)根和主根的顯微結構差異不明顯，故選用側(cè)根作為實驗材料。此外，在制作葉上花莖的石蠟切片時，選擇的材料應避開木質(zhì)化現(xiàn)象嚴重的部位，這樣不僅便于切片，還有利于觀察部位的形態(tài)特征。在實驗中對染色劑、染色方法和染色順序等進行改變，其結果并未出現(xiàn)良好的分色現(xiàn)象，尤其是葉上花莖的染色，所以染色方法仍需進一步探究。還需注意的是，本次只是對葉上花的根和莖進行了顯微鑒定研究，未來應在此基礎上對青莢葉屬的5種不同青莢葉的莖、根和葉等分別進行顯微鑒定研究，根據(jù)顯微結構圖進行對比，并結合基因組和蛋白組等方面更深入地研究青莢葉屬植物，為其進一步開發(fā)研究提供依據(jù)，進而達到避免基源混亂的目的。