強(qiáng)脊方對(duì)強(qiáng)直性脊柱炎患者Th17細(xì)胞及相關(guān)因子IL-6、IL-23影響的臨床研究*

李江 徐斌 喬治 譚龍旺

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西 咸陽(yáng) 712000;2.西安市第五人民醫(yī)院，陜西 西安 710000)

強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是一種類風(fēng)濕因子陰性，以脊柱僵硬并逐漸強(qiáng)直畸形為特征，逐漸發(fā)展累及其他關(guān)節(jié)，甚至累及眼、肺、腎臟等器官及心血管系統(tǒng)，最后導(dǎo)致功能障礙的一種免疫性疾病。目前越來越多的研究表明[1]，Th17細(xì)胞在AS發(fā)病中的作用不容忽視。Th17細(xì)胞是近年發(fā)現(xiàn)的一群產(chǎn)生IL-17的輔助性T細(xì)胞，通過分泌IL-17、IL-6、IL-21、IL-22、IL-23、TNF-α等多種細(xì)胞因子促進(jìn)炎癥、參與抗感染免疫、參與組織損傷和炎癥性骨破壞。

楊毓華教授經(jīng)40年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，所擬中藥方強(qiáng)脊方治療強(qiáng)直性脊柱炎患者，療效顯著，為進(jìn)一步探討分析方藥療效機(jī)理，設(shè)計(jì)此臨床試驗(yàn)，并與柳氮磺吡啶進(jìn)行療效對(duì)比，為臨床推廣提供理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 AS患者40例，來自2018年6月—2019年6月陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院骨科與西安市第五人民醫(yī)院(西安風(fēng)濕病研究所)風(fēng)濕科門診患者?；颊甙凑諄碓\時(shí)間排序分為兩組，每組20例，單號(hào)患者為驗(yàn)方中藥組，雙號(hào)患者為柳氮磺嘧啶對(duì)照組。所有對(duì)象均對(duì)本研究知情同意并簽署知情同意書，活動(dòng)度ASDAS<2.1為穩(wěn)定期、ASDAS≥2.1為活動(dòng)期。本實(shí)驗(yàn)主要以穩(wěn)定期為研究對(duì)象。

1.2AS診斷標(biāo)準(zhǔn) 所有入選的強(qiáng)直性脊柱炎患者均按1984年修訂的紐約標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷[2]。

1.3納入標(biāo)準(zhǔn) ①年齡18～65歲；②病程>3個(gè)月；③符合1984年修訂的AS紐約分類標(biāo)準(zhǔn)；④就診前1個(gè)月未使用過糖皮質(zhì)激素，6個(gè)月內(nèi)未使用過DMARDs。

1.4排除標(biāo)準(zhǔn) ①妊娠期或哺乳期婦女；②合并有嚴(yán)重心、肝、腎等重要臟器和血液、內(nèi)分泌系統(tǒng)病變；③合并有惡性腫瘤或者其他風(fēng)濕性疾病的患者；④精神病患者；⑤正處于急、慢性感染期患者；⑥活動(dòng)度評(píng)分ASDAS≥2.1的活動(dòng)期患者。

1.5臨床指標(biāo)檢測(cè) 測(cè)定AS組治療前的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)：①?gòu)?qiáng)直性脊柱炎疾病活動(dòng)度評(píng)分分值的計(jì)算；②CRP；③ESR；④HLA-B27。

1.6研究方法 對(duì)照組:患者給予柳氮磺吡啶腸溶片(信誼，上海福達(dá)制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H31020840，0.25 g×12 s×5板)開始0.25 g，日3次，以后每周增加0.25～1.0 g，日3次，維持2周，從第6周每周減0.25 g，第8周恢復(fù)0.25 g，日3次，維持2月。

中藥組:中藥丸劑口服，每日2次，每次2丸。具體方劑如下:當(dāng)歸12 g，萆薢15 g，紅花20 g，白芷10 g，制南星10 g，制川烏6 g，制草烏6 g，薏苡仁15 g，細(xì)辛6 g，地龍6 g，狗脊30 g，葛根30 g，牛膝20 g，赤芍30 g，白芍30g杜仲15 g，淫羊霍15 g，五加皮15 g，三七15 g，干胎盤1個(gè) 螞蟻200 g，與蜂蜜制作為蜜丸，約180丸，每日2次，每次2丸，黃酒送服，維持2月。所有藥物由本院藥劑室制作。

1.7分析指標(biāo) 對(duì)中藥組和對(duì)照組所有患者治療前后進(jìn)行強(qiáng)直性脊柱炎疾病活動(dòng)度評(píng)分，C反應(yīng)蛋白、血沉、HLA-B27檢測(cè)，觀察兩組患者臨床療效。對(duì)所有病例治療前進(jìn)行抽血采樣，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th17細(xì)胞數(shù)量；酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞因子IL-6、IL-23。治療2月后再次進(jìn)行抽血采樣，組間進(jìn)行標(biāo)本對(duì)比分析。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1標(biāo)本制備 對(duì)照者均于早晨8～9點(diǎn)間空腹采血。抽取2 mL于EDTA抗凝管中及4 mL于肝素鈉抗凝管中。①EDTA抗凝血2 mL，于3000 r/10 min離心后收集血清凍存于-80 ℃，用于ELISA檢測(cè)IL-6、IL-23細(xì)胞因子。②肝素鈉抗凝血4 mL，用于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th17細(xì)胞數(shù)量。

2.2收集外周血單核細(xì)胞及血漿 步驟方法：抽取研究對(duì)象外周靜脈血5 mL于ETDA抗凝采血管內(nèi)；在15 mL離心管中加入4 mL淋巴細(xì)胞分離液并將外周血緩緩倒入離心管內(nèi)(采血6小時(shí)之內(nèi))，2000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘；吸出上層血漿和中間層PBMCs(外周血單核細(xì)胞)；血漿置于-80 ℃冰箱保存，PBMCs用于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

2.3實(shí)驗(yàn)室檢測(cè) 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th17細(xì)胞，過程如下：

①調(diào)整細(xì)胞PBMCs濃度至2×106/mL，取2 mL PBMCs懸液接種于6孔培養(yǎng)板后加入終濃度為25 ng·mL-1的佛波醇乙酷(PMA),1 μg·mL-1的離子霉素(ionomycin)和1.7 μg·mL-1的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑莫能霉素(monesin)，在37 ℃,5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 h。

②用PBS洗，離心收集細(xì)胞，加入5 μL FITC標(biāo)記的鼠抗人CD4單抗，避光孵育15分鐘。

③加入50 μL固定液((A液)室溫避光固定反應(yīng)15分鐘后加入3 mL PBS,混勻后離心棄上清。

④加入50 μL破膜劑(B液)進(jìn)行細(xì)胞打孔利于細(xì)胞因子單抗進(jìn)入細(xì)胞，進(jìn)行胞內(nèi)細(xì)胞因子染色。

⑤加入5 μL PE標(biāo)記的IL-17單克隆抗體, 4 ℃避光孵育15～20分鐘，再用0.5 mL PBS重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。

⑥檢測(cè)前常規(guī)對(duì)流式細(xì)胞儀進(jìn)行光流路質(zhì)量調(diào)控和熒光補(bǔ)償，使儀器各項(xiàng)指標(biāo)在質(zhì)量控制允許值范圍，檢測(cè)時(shí)首先根據(jù)前向(FSC)和側(cè)向(SSC)散射光信號(hào)對(duì)淋巴細(xì)胞群進(jìn)行設(shè)門，每份標(biāo)本獲取設(shè)門內(nèi)細(xì)胞在10000個(gè)以上，數(shù)據(jù)分析使用EXP032軟件。

2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 Epi data 3.0軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù)，采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行結(jié)果分析，如資料符合正態(tài)分布，采用兩組獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布采用非參數(shù)檢驗(yàn)，兩變量之間的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

所有AS患者中，中藥組有15名患者，對(duì)照組有13名患者配合完成全部實(shí)驗(yàn)測(cè)試，其外周血進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th17細(xì)胞。Th17細(xì)胞檢測(cè)選取的抗體是CD4與IL-17+，所以CD4+、IL-17+的細(xì)胞被確認(rèn)為Th17細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明：AS患者經(jīng)治療后CD4+、IL-17+細(xì)胞(即Th17細(xì)胞)均顯著減少，且中藥組與對(duì)照組相比較，二者無明顯差異(P>0.05)，如圖1、圖2示。

圖1 治療前CD4+、IL-17+細(xì)胞流式檢測(cè)圖

圖2 治療2月后CD4+、IL-17+細(xì)胞流式檢測(cè)

研究對(duì)象的一般臨床指標(biāo)檢測(cè)情況顯示，治療前后兩組患者的活動(dòng)度評(píng)分(ASDAS)，C反應(yīng)蛋白、血沉各項(xiàng)指標(biāo)均明顯下降(P<0.05)，并且兩組之間無明顯差異(P>0.05)，其中中藥組有2例患者HLA-B27轉(zhuǎn)為陰性，對(duì)照組有一例轉(zhuǎn)為陰性。酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)兩組患者相關(guān)細(xì)胞因子治療前后水平如下表1。結(jié)果顯示兩組均可以有效降低IL-6、IL-23，但二者無明顯差異(P>0.05)。

表1 兩組治療前后相關(guān)細(xì)胞因子水平差異

4 討論

目前AS的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但機(jī)體的免疫功能異常在該病發(fā)病中的作用已經(jīng)得到了肯定，T細(xì)胞的免疫功能異常更是得到了廣泛的重視[3]。CD4輔助性T細(xì)胞作為T細(xì)胞中的一個(gè)重要群體因分泌的細(xì)胞因子不同而被分為多個(gè)亞群，各個(gè)Th細(xì)胞亞群在自身免疫疾病發(fā)病中的作用在近十年中得到了廣泛的研究，關(guān)于Th細(xì)胞各亞群之間的失衡在一些自身免疫疾病的發(fā)生發(fā)展的作用也得到了肯定[4]。大量研究[5-7]證實(shí)了AS患者外周血中Th17與Treg細(xì)胞的不平衡可能參與了AS的發(fā)病和病變進(jìn)展。在AS患者外周血中微小核糖核酸-155(miR-155)表達(dá)水平可能影響Th17/Treg細(xì)胞平衡狀態(tài)[8]。Th細(xì)胞根據(jù)其功能和分泌的細(xì)胞因子分為不同的亞群，主要的Th細(xì)胞亞群有：Th1，Th2，Th17及Treg四種[9]。

Th17作為近幾年一種新發(fā)現(xiàn)的Th細(xì)胞亞群，在適應(yīng)性免疫應(yīng)答中起著十分重要的作用。Th17細(xì)胞因分泌IL-17而得名，除了分泌IL-17以外，Th17細(xì)胞還分泌IL-6、IL-23等細(xì)胞因子，其主要效應(yīng)功能是在對(duì)外來的細(xì)菌和真菌的免疫應(yīng)答中活化中性白細(xì)胞，進(jìn)一步介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。初始的CD4+分化為Th17細(xì)胞所需要的條件是：局部微環(huán)境中的IL-6、TGF-β和IL-23；轉(zhuǎn)錄因子RORγt的激活[10]。有人對(duì)IL-6在AS中的診斷價(jià)值進(jìn)行了評(píng)測(cè)，發(fā)現(xiàn)診斷靈敏度為62.5%，特異度為92.5%[11]，可作為AS患者早期診斷及評(píng)判療效的參考。

中醫(yī)在治療本病方面積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，一些固定成方、驗(yàn)方和單方的應(yīng)用更是百花齊放，達(dá)到祛除病痛，調(diào)節(jié)免疫的作用，且可避免或?qū)刮魉幍亩靖弊饔?。中藥?nèi)服是治療AS的常用方法，治療本病常以補(bǔ)益肝腎、活血通絡(luò)、祛風(fēng)濕強(qiáng)筋骨為主，配以其他藥物，辨證施治，臨證加減[12]。也有一些中成藥在臨床上取得明確療效[13-15]。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)中藥治療AS也有了大量研究，證實(shí)苦參堿及雷公藤甲素抑制Th17分化，可能是治療AS炎癥的有效藥物之一[16]。譚希運(yùn)用HPLC(高效液相色譜法)分析了補(bǔ)腎強(qiáng)督治僂方有效化學(xué)成分，證明存在川芎嗪，芍藥苷、柚皮苷、蛇床子素和熊果酸五種化合物，其有效成分對(duì)LPS(脂多糖)誘導(dǎo)的RAW264.7(小鼠單核巨噬細(xì)胞)細(xì)胞模型的IL-23/Th17炎癥軸有不同的影響，如熊果酸和川芎嗪也可以抑制RAW264.7模型細(xì)胞NO和TNF-ɑ、IL-6、IL-17、RORγt、IL-23的表達(dá)，且對(duì)細(xì)胞增殖無影響[17]。目前臨床上也有大量的中西醫(yī)結(jié)合治療AS的報(bào)道，如口服藥物、針灸、中藥熏蒸等聯(lián)合西醫(yī)常規(guī)藥物，取得了一定療效，并且取長(zhǎng)補(bǔ)短，相輔相成[18-20]。

楊毓華教授經(jīng)多年臨床經(jīng)驗(yàn)所擬強(qiáng)脊方治療AS患者，臨床效果顯著，通過此實(shí)驗(yàn)證實(shí)它能通過降低Th17細(xì)胞的表達(dá)數(shù)量，減少IL-6、IL-23細(xì)胞因子分泌，改善炎癥反應(yīng)，與柳氮磺吡啶療效相當(dāng)，避免了西藥的毒副作用，值得臨床推廣。