甘草瀉心湯聯(lián)合血竭對(duì)DSS誘導(dǎo)的UC模型大鼠的抗炎作用*

李敏

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川 南充 637000)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是炎癥性腸病的一種，以反復(fù)或持續(xù)發(fā)作的黏液膿血便、腹瀉、腹痛、里急后重及不同程度的腸外并發(fā)癥為主要臨床表現(xiàn)[1-2]。病變部位以結(jié)腸的黏膜及黏膜下層為主[3]，其患病率逐年上升，每千人中約有1～2人患病[4]，已成為全球性的疾病[5]。UC的發(fā)病與遺傳、免疫、環(huán)境及上皮屏障缺陷等因素有關(guān)[6]，細(xì)胞因子在UC的免疫反應(yīng)和局部炎癥反應(yīng)中起重要作用。白細(xì)胞介素6(interleukin-6,IL-6)和腫瘤壞死因子α(tumornecrosis actor-2,TNF-α)是參與UC炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的主要細(xì)胞因子，能促進(jìn)白細(xì)胞活化，使腸道黏膜炎癥反應(yīng)持續(xù)[7-8]。UC是導(dǎo)致相關(guān)性結(jié)直腸癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素之一[9]，UC患者患結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)是正常人群的5倍[10]。目前，UC的治療以緩解癥狀為主，難以徹底治愈。氨基水楊酸、皮質(zhì)類固醇和免疫抑制劑是治療UC的主要化學(xué)藥物，但長期用藥的不良反應(yīng)多，治療費(fèi)用高，部份患者療效并不理想[11]，尋找新的有效的UC治療藥物與方法亟待解決。中醫(yī)中藥對(duì)UC的治療起到了一定的作用[12]，研究表明甘草瀉心湯具有抗?jié)儭⒄{(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的作用，已廣泛用于消化系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等疾病的治療[13-14]。中藥血竭具有活血止血、斂瘡生肌之功。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)甘草瀉心湯和血竭對(duì)UC大鼠有顯著的治療效果[15]。本研究旨在進(jìn)一步探討甘草瀉心湯聯(lián)合血竭對(duì)硫酸葡聚糖鈉(dextran sulfate sodium,DSS)誘導(dǎo)的UC模型大鼠的療效及對(duì)血清IL-6和TNF-α的影響，為甘草瀉心湯聯(lián)合血竭防治UC的合理使用提供參考。

1 儀器與材料

1.1主要儀器設(shè)備 BMJ-Ⅲ石蠟包埋機(jī)(常州中威電子儀器有限公司)；PHY-Ⅲ病理組織漂烘儀(常州中威電子儀器有限公司)；RM2125RTS切片機(jī)(德國LEICA公司)；CX41-12C02顯微攝像系統(tǒng)(日本Olympus株式會(huì)社)。

1.2試藥 甘草瀉心湯(炙甘草12 g，黃連3 g，黃芩9 g，半夏9 g，干姜9 g，大棗6 g，人參9 g)藥材飲片，由川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科提供。按原方比例將藥物飲片按中藥常規(guī)煎煮法煎液，濃縮為含生藥2.4 g·mL-1溶液備用。龍血竭膠囊(0.3 g×60粒)，云南云河藥業(yè)有限公司，批號(hào)：150408。取膠囊內(nèi)容物，用濃縮甲基纖維素鈉與甘草瀉心湯藥液配制成每毫升含血竭0.15 g生藥的混懸液備用。柳氮磺吡啶片(sulfa salazine,SASP，0.25 g×60片)，上海信誼天平藥業(yè)有限公司，批號(hào)09161007。研成粉末，用濃縮甲基纖維素鈉與生理鹽水配制成每毫升含0.17 g生藥的混懸液備用。硫酸葡聚糖鈉(DSS)，上海西寶生物科技有限公司(OS1701A)。大鼠TNF-α試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司(mL002859-J)；大鼠白細(xì)胞介素6(IL-6)試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司(mL102828-J)。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD(sprague dawley)大鼠，SPF(specific pathogen free,DPF)級(jí)，雌雄各半，體質(zhì)量(180±20)g，由川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(川)2018-18，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(川)2018-076。嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)與使用的準(zhǔn)則。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1動(dòng)物分組、造模與給藥 取SD大鼠100只，實(shí)驗(yàn)開始時(shí)稱體質(zhì)量2次，取其平均值作為初始體質(zhì)量，按隨機(jī)數(shù)字表法分成空白組25只與造模組75只，空白組大鼠自由進(jìn)食進(jìn)飲，造模組參照文獻(xiàn)[16]，以3%葡聚糖硫酸鈉溶液代替飲用水自由飲用7 d制作大鼠UC模型，大鼠出現(xiàn)大便次數(shù)增多伴稀便、便中帶黏液和(或)血跡、體質(zhì)量下降提示造模成功。造模成功后大鼠隨機(jī)分成模型組、柳氮磺吡啶組及甘草瀉心湯+血竭組各25只。根據(jù)《中藥藥理研究方法學(xué)》中[17]動(dòng)物給藥量計(jì)算：60 kg成人與200 g大鼠折算系數(shù)為6.25。大鼠等效劑量：柳氮磺吡啶用量為450 mg·(kg·d)-1，甘草瀉心湯用量為6 g·(kg·d)-1，血竭用量為375 mg·(kg·d)-1。柳氮磺吡啶組每天給予柳氮磺吡啶混懸液2.5 mL/只灌胃，甘草瀉心湯+血竭組每天給予甘草瀉心湯+血竭混懸液2.5 mL/只灌胃，空白組、模型組每天給予生理鹽水2.5 mL/只灌胃，連續(xù)灌胃7 d。

2.2觀察指標(biāo)

2.2.1疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分 實(shí)驗(yàn)期間每日觀察記錄大鼠體質(zhì)量、糞便性狀和便血情況，用聯(lián)苯胺法檢測(cè)大便隱血，并參照文獻(xiàn)[18]進(jìn)行疾病活動(dòng)指數(shù)(Disease activity index，DAI)評(píng)分，標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 DAI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

2.2.2酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)測(cè)定各組大鼠血清IL-6、TNF-α含量 治療7 d后，各組大鼠分別給予10%水合氯醛溶液4 mL·kg-1腹腔注射麻醉。解剖大鼠，心臟采血，抽取新鮮血液約4 mL/只，2 h內(nèi)離心，留取上清液，-80 ℃低溫保存，臨用前2 d放入4 ℃環(huán)境解凍，酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定各組大鼠IL-6、TNF-α血清含量。

2.2.3腸黏膜損傷及病理組織學(xué)評(píng)分 取血后各組大鼠處死，解剖，取肛門至回盲部的腸道組織，順著腸系膜剪開，用冰生理鹽水沖洗干凈，鋪平，觀察結(jié)腸黏膜有無水腫、出血點(diǎn)、糜爛及潰瘍情況。參照文獻(xiàn)進(jìn)行結(jié)腸黏膜損傷(colonmucosa damage index，CMDI)評(píng)分[19]，標(biāo)準(zhǔn)見表2。在距肛門及回盲部0.5 cm處各取1塊腸組織，約0.5 cm×0.5 cm，置生理鹽水中清洗，10%福爾馬林溶液固定，常規(guī)石蠟包埋、切片、行蘇木精-伊紅(hematoxylineosin，HE)染色，顯微鏡下觀察組織學(xué)改變，參照文獻(xiàn)行病理組織學(xué)(histopathology，HS)評(píng)分[20]，標(biāo)準(zhǔn)見表3。

表2 CMDI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

表3 HS評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1對(duì)UC大鼠一般情況及DAI評(píng)分的影響 空白組大鼠反應(yīng)敏捷，毛發(fā)柔順光滑，進(jìn)食及飲水如常，大便正常；模型組大鼠出現(xiàn)不同程度的皮毛干枯、精神不振、倦怠懶動(dòng)、扎堆、厭食、腹瀉、大便帶血、體質(zhì)量減輕等癥狀。灌胃后甘草瀉心湯+血竭組和SASP組大鼠毛色逐漸轉(zhuǎn)柔潤光滑，精神逐漸恢復(fù)正常，愛活動(dòng)，進(jìn)食量增加，便血消失，大便逐漸成型并轉(zhuǎn)為顆粒狀，體質(zhì)量增加。模型組大鼠體質(zhì)量低于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，模型組DAI評(píng)分高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；草瀉心湯+血竭組和柳氮磺吡啶組大鼠體質(zhì)量高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，甘草瀉心湯+血竭組和柳氮磺吡啶組DAI評(píng)分低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 對(duì)UC大鼠一般情況及DAI評(píng)分的影響

3.2對(duì)UC大鼠CDMI及HS評(píng)分的影響 結(jié)腸組織洗凈鋪平后見：空白組結(jié)腸粘膜淡紅、潤滑，粘膜皺襞完好，未見充血、水腫及潰瘍；模型組結(jié)腸粘膜充血、水腫明顯，粘膜脆性增加，腸腔管壁增厚粘連，遠(yuǎn)端結(jié)腸粘膜可見多個(gè)橢圓形潰瘍；柳氮磺吡啶組和甘草瀉心湯+血竭組見腸粘膜輕度充血、水腫，遠(yuǎn)端結(jié)腸粘膜少許糜爛面。HE染色后鏡下見：空白組大鼠結(jié)腸黏膜形態(tài)完好，腺體整齊排列，杯狀細(xì)胞分布正常，未見水腫及潰瘍；模型組腸黏膜腺體排列紊亂，腸黏膜上皮部分損壞，粘膜部分缺損，散在多個(gè)潰瘍，隱窩和杯狀細(xì)胞大面積丟失，黏膜和黏膜下層可見較多炎癥細(xì)胞浸潤；柳氮磺吡啶組和甘草瀉心湯+血竭組結(jié)腸粘膜腺體排列欠整齊，粘膜上皮少許缺損，杯狀細(xì)胞和隱窩均出現(xiàn)不同程度的修復(fù)，較多腺體增生，隱窩及間質(zhì)有少許炎細(xì)胞浸潤。模型組、柳氮磺吡啶組及甘草瀉心湯+血竭組大鼠CMDI、HS評(píng)分均高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；柳氮磺吡啶組和甘草瀉心湯+血竭組CMDI、HS評(píng)分均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；甘草瀉心湯+血竭組HS評(píng)分低于柳氮磺吡啶組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1、表5。

表5 對(duì)UC大鼠CDMI及HS評(píng)分的影響

A.空白組；B.模型組；C.柳氮磺吡啶組；D.甘草瀉心湯+血竭組

3.3對(duì)UC大鼠血清IL-6、TNF-α的影響 模型組大鼠血清IL-6、TNF-α含量高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，柳氮磺吡啶組和甘草瀉心湯+血竭組IL-6、TNF-α含量低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；甘草瀉心湯+血竭組IL-6、TNF-α含量低于柳氮磺吡啶組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表6。

表6 對(duì)UC大鼠血清IL-6、TNF-α的影響

4 討論

潰瘍性結(jié)腸炎是一種慢性炎癥性腸病，主要病理表現(xiàn)為結(jié)腸粘膜損傷。此病反復(fù)發(fā)作，遷延難愈，其發(fā)病率逐年升高[21]。而長期的炎癥、潰瘍引起的相關(guān)性結(jié)腸癌風(fēng)險(xiǎn)也逐年增高，病程超過30年的癌變率可高達(dá)30%[22]。目前，UC的病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，大多認(rèn)為與遺傳、環(huán)境、免疫、腸道菌群有關(guān)[23-24]，治療上只能緩解癥狀而不能完全治愈，所用化學(xué)藥物主要有氨基水楊酸類、激素、免疫抑制劑等，但長期用藥的不良反應(yīng)和高昂的費(fèi)用顯著降低了患者的生活質(zhì)量和滿意度。研究表明甘草瀉心湯和血竭具有良好的抗炎和免疫調(diào)節(jié)等作用[14-15]，因此本研究采用甘草瀉心湯聯(lián)合血竭灌胃治療DSS誘導(dǎo)的UC模型大鼠，觀察其抗炎作用及對(duì)血清TNF-α與IL-6含量的影響。

潰瘍性結(jié)腸炎造模方法很多，包括化學(xué)法、基因法、免疫復(fù)合法、中醫(yī)模型等[25]，而化學(xué)法中硫酸葡聚糖鈉(DSS)誘導(dǎo)的UC模型具有簡單方便和與人的潰瘍性結(jié)腸炎相似性被廣泛應(yīng)用[26]。DSS是一種水溶性硫酸化多糖，可通過直接對(duì)腸道上皮細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用、改變結(jié)腸黏液層菌群及引起腸上皮細(xì)胞缺氧來損壞腸道屏障，從而引起潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生，表現(xiàn)為腹瀉、直腸出血、潰瘍和粒細(xì)胞浸潤，這與人類潰瘍性結(jié)腸炎臨床特點(diǎn)和組織學(xué)表現(xiàn)相似[27]。DSS誘導(dǎo)UC的發(fā)生發(fā)展與促炎因子TNF-α、IL-6的表達(dá)增高密切相關(guān)[28-29]，而分子量40000的DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎病變主要表現(xiàn)在遠(yuǎn)端結(jié)腸。DSS的濃度對(duì)結(jié)腸黏膜損傷程度有決定作用，以3% DSS誘導(dǎo)大鼠UC模型為最佳[30]，所以本研究采用分子量40000的3%DSS誘導(dǎo)UC大鼠模型。

中醫(yī)藥理論認(rèn)為潰瘍性結(jié)腸炎以反復(fù)發(fā)作的痛泄粘液膿血便為主要表現(xiàn)，其病候?qū)W特點(diǎn)與中醫(yī)病名“休息痢”相符。脾虛為其發(fā)病之本，濕邪為致病之標(biāo)，血瘀為局部病理變化[31]。濕和瘀既是致病之因，又是病理產(chǎn)物，濕與瘀交結(jié)，蘊(yùn)于腸間，互相影響，寒熱錯(cuò)雜，導(dǎo)致UC經(jīng)久不愈，在患者感受外邪、飲食不當(dāng)、勞累、情志變化時(shí)誘發(fā)，這是UC反復(fù)發(fā)作而不能治愈的根本原因。因此，益氣健脾、除濕化瘀是緩解UC發(fā)作，也是防止其復(fù)發(fā)的關(guān)鍵[32]。甘草瀉心湯出自《傷寒雜病論》，由甘草、半夏、黃芩、黃連、干姜、大棗、黨參組成，該方補(bǔ)清結(jié)合，補(bǔ)中寓清，是治療濕阻中焦，脾胃虛弱，寒熱錯(cuò)雜的經(jīng)典方，被稱為黏膜修復(fù)劑，具有抗?jié)儭⒄{(diào)節(jié)黏膜分泌和機(jī)體免疫功能的作用，能促進(jìn)UC腸道屏障功能修復(fù)[13-14]。中藥血竭具有散瘀定痛、止血生肌之功，能改善局部血液瘀滯狀態(tài)，調(diào)節(jié)免疫，促進(jìn)結(jié)腸粘膜潰瘍愈合[15]。甘草瀉心湯聯(lián)合血竭抓住了UC患者濕伏血瘀、脾胃虛弱的病機(jī)特點(diǎn)，既能健脾益氣，除腸間之濕，又能行內(nèi)瘀之血，使內(nèi)伏濕瘀得除，消除致病之因和病理產(chǎn)物而達(dá)到治療和防止UC再發(fā)的作用。

TNF-α、IL-6都是重要的促炎癥細(xì)胞因子，TNF-α能激活上皮細(xì)胞，誘導(dǎo)趨化因子，使中性粒細(xì)胞聚集，使炎癥效應(yīng)放大，損傷腸黏膜組織，其在血清中含量與UC嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[33]。IL-6能誘導(dǎo)細(xì)胞因子的表達(dá)，使TNF-α的生物學(xué)活性增強(qiáng)，使炎癥反應(yīng)加重，其在血清中含量可反映UC的嚴(yán)重程度[22]。本研究表明，大鼠造模后出現(xiàn)精神不振、倦怠、厭食、腹瀉、大便帶血、體質(zhì)量減輕，結(jié)腸粘膜充血、水腫，腸腔管壁增厚粘連，腸黏膜腺體排列紊亂，上皮損壞及潰瘍形成，隱窩和杯狀細(xì)胞大面積丟失，較多炎癥細(xì)胞浸潤，DAI、CMDI及HS評(píng)分明顯高于空白組(P<0.05)，血清TNF-α、IL-6的含量較空白組顯著增高(P<0.05)。甘草瀉心湯+血竭組灌胃后，大鼠精神逐漸恢復(fù)，活動(dòng)量及進(jìn)食量增加，大便逐漸成型并轉(zhuǎn)為顆粒狀，便血消失，體質(zhì)量增加，腸粘膜充血、水腫、糜爛減輕，杯狀細(xì)胞和隱窩不同程度的修復(fù)，較多腺體增生，炎性細(xì)胞浸潤減少。DAI、CMDI及HS評(píng)分較模型組顯著降低(P<0.05)，血清TNF-α、IL-6的含量也顯著低于模型組(P<0.05)。甘草瀉心湯+血竭組HS評(píng)分及血清TNF-α、IL-6的含量低于柳氮磺吡啶組(P<0.05)。表明甘草瀉心湯聯(lián)合血竭能消除UC模型大鼠的癥狀，促進(jìn)損傷的腸粘膜炎癥消退并修復(fù)，改善結(jié)腸粘膜的病理損害，降低血清TNF-α、IL-6的含量，具有明顯的抗?jié)冃越Y(jié)腸炎作用。

綜上所述，甘草瀉心湯聯(lián)合血竭灌胃能改善DSS誘導(dǎo)的UC模型大鼠腹瀉及粘液血便的癥狀，降低UC大鼠結(jié)腸DAI、CMDI及HS評(píng)分，抑制UC大鼠血清TNF-α、IL-6的表達(dá)，具有明確的抗?jié)冃越Y(jié)腸炎作用。