松材線蟲傳播與松墨天牛取食行為相關(guān)性研究

王 洋 ，王立超 ，喻愛林 ，金明霞 ，劉曉華

（1.江西省林業(yè)科學(xué)院，江西 南昌 330013；2.南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，江蘇 南京 210037）

松材線蟲?。≒ine wilt disease）是由松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）引起的一種毀滅性的森林病害，是當(dāng)前世界上最具危險性和傳染性的森林病害[1]。由于該病具有易傳播、難防治、患病松樹死亡快等特點，而被世界多國列為重要的檢疫性病害。目前，該病害已侵入我國多個風(fēng)景名勝區(qū)、重要生態(tài)功能區(qū)、以及東北地區(qū)。已經(jīng)對我國部分地區(qū)自然景觀、生態(tài)環(huán)境及松林資源造成嚴(yán)重破壞，給林業(yè)產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失，并對我國大面積林區(qū)及松林景觀生態(tài)區(qū)域構(gòu)成嚴(yán)重威脅。

松材線蟲的傳播需要借助媒介昆蟲進行。松墨天牛（Monochamus alternatus）在東亞地區(qū)是最主要的松材線蟲媒介昆蟲[2-4]。松墨天牛成蟲羽化后尋找健康松樹進行取食補充營養(yǎng)，并在松樹表皮造成傷口，其攜帶的擴散型松材線蟲脫離后通過傷口進入樹體，并脫皮轉(zhuǎn)化為繁殖型成蟲進而快速繁殖對松樹造成危害[5,6]。

松墨天牛羽化后其攜帶的松材線蟲并不能立即開始傳播，而是需要經(jīng)歷一段時間后才開始脫離。Enda等認(rèn)為4齡擴散型松材線蟲幼蟲在媒介天牛羽化后的第10天開始脫離[7]，Hosoda等認(rèn)為在媒介天牛羽化后的3～5天后松材線蟲開始脫離[8]，Aikawa等認(rèn)為在媒介天牛羽化后的第7天其攜帶的松材線蟲開始脫離[9]，Jikunaru等認(rèn)為在媒介天牛羽化后的第5天松材線蟲開始脫離[10]，Wang等認(rèn)為松材線蟲起始脫離媒介天牛的時間主要集中在其羽化后的7～12天[11]。雖然各研究結(jié)果不盡相同，但是都普遍認(rèn)為媒介天牛羽化需經(jīng)歷一段時間后松材線蟲才開始從媒介體內(nèi)脫離。

針對何種原因觸發(fā)導(dǎo)致了松材線蟲從媒介昆蟲的脫離，目前，雖有多種說法但是沒有統(tǒng)一的定論。Stamps等認(rèn)為擴散型松材線蟲體內(nèi)中性脂肪的降解跟松材線蟲的脫離有密切關(guān)系，發(fā)現(xiàn)媒介天牛羽化后隨著時間的延長，其體內(nèi)攜帶的松材線蟲體內(nèi)的脂肪含量逐漸低，并認(rèn)為松材線蟲自身內(nèi)在原因?qū)е铝怂刹木€蟲的脫離[12]。Ishkawa等在瓊脂平板上測試萜烯類物質(zhì) （松樹揮發(fā)物）對擴散型松材線蟲的吸引，發(fā)現(xiàn)β-月桂烯 （βmyrcene）對離體的擴散型松材線蟲具有很強的吸引力，認(rèn)為松樹揮發(fā)物的誘引是導(dǎo)致松材線蟲脫離的原因[13]。Aikawa等用健康松樹枝條和經(jīng)過蒸煮后消除松樹揮發(fā)物質(zhì)的枝條分別喂養(yǎng)松墨天牛，結(jié)果認(rèn)為松材線蟲的脫離是自發(fā)性行為，松樹揮發(fā)物反而在一定程度上抑制了線蟲的脫離[14]，認(rèn)為松材線蟲的脫離可能是內(nèi)源性因素造成的[12,14]。Wu等認(rèn)為松墨天牛羽化后其呼吸作用會逐漸增強，同時其產(chǎn)生二氧化碳的速率也加快，當(dāng)其氣管內(nèi)的CO2濃度升高達(dá)到一定臨界值時，因松材線蟲對CO2的趨避性最終導(dǎo)致線蟲的脫離[15]。

松墨天牛成蟲取食行為是其生命周期中重要的環(huán)節(jié)，也是松材線蟲傳播的關(guān)鍵階段，松材線蟲可通過天牛取食造成的傷口進入健康樹體內(nèi)完成傳播[16,17]。但是，媒介天牛取食行為是否是觸發(fā)導(dǎo)致松材線蟲脫離的原因尚不明確。為了進一步研究媒介天牛攜帶的松材線蟲的脫離原因，本研究中我們分析了媒介天牛（松墨天牛）取食行為對松材線蟲脫離的影響，以及取食量與松材線蟲傳播比率的相關(guān)性，并分析了松樹揮發(fā)物對松材線蟲傳播的影響。

1 材料方法

1.1 松墨天牛幼蟲獲取與喂養(yǎng)

試驗用枯死馬尾松（Pinus massoniana）疫木，于2022年1月份收集于江西省梅嶺國家級風(fēng)景名勝區(qū)，木段需被松墨天牛幼蟲侵染。將木段劈開，取出其中的松墨天牛幼蟲共130頭，并用人工飼料進行喂養(yǎng)，如圖1所示。于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至5齡幼蟲，每隔10天更換1次飼料。

（1）飼料配方：蔗糖：25 g，酵母粉：15.625 g，瓊脂：50 g，苯甲酸鈉：2.5 g，山梨酸：1.25 g，0.5mol/LH2SO4：12.5mL，松樹木屑：125 g，麥胚粉/大豆粉：25 g，膽固醇：1.875 g，抗壞血酸：5 g，干酪素（酪蛋白）：25 g，氯化膽堿：1.25 g，H2O：1000mL。

（2）飼料配制：松樹木屑過孔徑為1.0mm篩，于60℃干燥箱烘干。取不銹鋼鍋，加入1000mL雙蒸水煮至沸騰后加入50 g瓊脂，待瓊脂完全融化后加入除松樹木屑和H2SO4以外的所有組分，充分煮沸后，用H2SO4滴定調(diào)節(jié)飼料的pH，再加入木屑，充分?jǐn)嚢?；并分裝到圖1小杯中（40mL），于105℃滅菌15min，冷卻后保存于4℃冰箱。

圖1 松墨天牛幼蟲喂養(yǎng)Figure 1 Feeding of beetle larvae

1.2 攜帶松材線蟲天牛培育

本試驗所用松材線蟲AMA3蟲株由南京林業(yè)大學(xué)森林保護系森林病理實驗室提供。

采集新鮮馬尾松木段直徑約5 cm，將木段截為10 cm長小木段，并接種松材線蟲10000條，于25℃條件下?lián)嵊?個月。用鉆頭打1 cm×5 cm圓洞，將5齡松墨天牛幼蟲（挑選健康個體120頭）接種于圓洞中，用錫箔紙封口，并于25℃培養(yǎng)；如圖2所示；直至松墨天牛成蟲羽化。

圖2 攜帶線蟲天牛培養(yǎng)Figure 2 Culture of beetles carrying pine wood nematode

1.3 松墨天牛飼喂與松材線蟲傳播

及時收集新羽化的松墨天牛（每2～4 h觀察羽化情況，正常羽化并用于試驗個體共91頭），將天牛分為兩組，一組立即用健康新鮮馬尾松枝條進行喂養(yǎng)，另一組饑餓處理4天后再進行喂養(yǎng)，喂養(yǎng)方法如圖3所示,并每日更換新鮮枝條。

圖3 天牛成蟲喂養(yǎng)Figure 3 Feeding of adult beetles

天牛取食量：本研究以取食面積測算松墨天牛取食量，將天牛取食過的枝條留下的刻痕用刻度尺測量進行估算。天牛取食枝條如圖4-A所示。

天牛傳播線蟲數(shù)量：將每日更換下的枝條剪碎（以及養(yǎng)蟲瓶中碎屑）如圖4-B，用貝爾曼漏斗法[18]進行分離，12小時后收集分離液并于顯微鏡下計數(shù)松材線蟲數(shù)量：為單日松墨天牛傳播線蟲數(shù)量。首次分離到松材線蟲的日期為天牛起始傳播松材線蟲的日期。松墨天牛死亡后用上述方法分離其體內(nèi)殘余松材線蟲。松材線蟲傳播率=傳播線蟲總量/（傳播總量+殘余量）。

圖4 天牛取食枝條處理Figure 4 Treatment of branches fed by beetles

1.4 數(shù)據(jù)分析

Spass 19.0用于數(shù)據(jù)分析。分析不同飼喂方法松材線蟲起始脫離松墨天牛時間的差異性，以及松墨天牛取食量與傳播線蟲比率的相關(guān)性。

2 結(jié)果分析

2.1 不同飼喂處理對線蟲脫離影響

松材線蟲起始脫離松墨天牛的時間情況如圖5所示。羽化后立即喂養(yǎng)的松墨天牛共55頭，平均起始傳播線蟲時間為8.16天；經(jīng)饑餓處理后喂養(yǎng)的天牛共36頭，平均起始傳播線蟲時間為7.76天。對兩種飼喂處理下天牛起始傳播線蟲時間進行差異性分析P=0.2，表明羽化后立即喂養(yǎng)和饑餓處理后再進行喂養(yǎng)的天牛，其攜帶的松材線蟲起始脫離的日期無明顯差異；表明取食與否對松材線蟲的脫離沒有直接影響。

圖5 松材線蟲起始脫離天牛時間Figure 5 The start time of PWN departure from beetle

2.2 天牛取食量與傳播線蟲比率

本研究中，松墨天牛取食量與其傳播松材線蟲情況如表1所示。本研究中共有20頭天牛正常死亡，可用于分析取食與傳播線蟲關(guān)聯(lián)性。松材線蟲傳播平均比率為25.71。松墨天牛傳播線蟲期間平均取食量為8655.98mm2。對天牛取食量和松材線蟲傳播比率進行相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)r=-0.19。表明媒介昆蟲松墨天牛取食量大小與松材線蟲傳播比率呈現(xiàn)較弱的負(fù)相關(guān)性。

表1 天牛取食量與松材線蟲傳播Table 1 The feeding quantity of beetle and the transmission of pine wood nematode

3 討論

媒介昆蟲羽化后，松材線蟲隨媒介昆蟲進行傳播，取食階段是媒介昆蟲生命周期中重要的環(huán)節(jié)，也是松材線蟲傳播的關(guān)鍵階段，松材線蟲可通過天牛取食造成的傷口進入健康樹體內(nèi)完成傳播[16,17]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)饑餓處理的媒介天牛與正常喂養(yǎng)的天牛其松材線蟲起始傳播的時間無明顯差異，表明松材線蟲的脫離不是由媒介昆蟲的取食行為觸發(fā)的。同時饑餓處理的天牛未接受到松樹揮發(fā)物的刺激，其攜帶的松材線蟲也未接收到揮發(fā)物質(zhì)的刺激，可以判斷松樹揮發(fā)物質(zhì)也不是觸發(fā)松材線蟲脫離媒介昆蟲的原因。Ishkawa在瓊脂平板上測松樹揮發(fā)物對擴散型松材線蟲的吸引， 發(fā)現(xiàn) β-月桂烯 （βmyrcene）對擴散型松材線蟲具有很強的吸引力[13]，而Aikawa等用正常枝條和經(jīng)過蒸煮后消除松樹揮發(fā)物質(zhì)的枝條分別喂養(yǎng)松墨天牛，結(jié)果認(rèn)為松材線蟲的脫離是自發(fā)性行為，松樹揮發(fā)物反而在一定程度上抑制了線蟲的脫離[14]，這可能表明松樹揮發(fā)物僅對松材線蟲脫離后的移動起到信號指引作用。

對媒介昆蟲的不同飼喂處理，會導(dǎo)致媒介昆蟲代謝發(fā)生差異，但這種差異并未導(dǎo)致傳播線蟲起始發(fā)生明顯差異，表明媒介天牛羽化后代謝的變化也不是導(dǎo)致松材線蟲脫離的觸發(fā)機制。

本研究中媒介天牛取食量與松材線蟲傳播比率呈現(xiàn)弱的相關(guān)性，表明松材線蟲傳播數(shù)量的多少并非由媒介昆蟲取食所決定。Wang等研究認(rèn)為松材線蟲的傳播具有明顯的規(guī)律性，而媒介天牛的取食量保持相對恒定[11]；也表明松材線蟲的傳播與媒介天牛的取食關(guān)聯(lián)性不大；媒介天牛取食行為僅為松材線蟲傳播的一個重要途徑，而非原因。

Stamps等認(rèn)為松材線蟲體內(nèi)中性脂肪的降解跟其脫離媒介昆蟲有密切關(guān)系，發(fā)現(xiàn)媒介天牛羽化后隨著時間的延長，其攜帶的松材線蟲體內(nèi)的脂肪含量越來越低，認(rèn)為松材線蟲自身內(nèi)在原因?qū)е铝怂刹木€蟲的脫離[12]，Aikawa等認(rèn)為松樹揮發(fā)物不是松材線蟲脫離的原因，其脫離可能是內(nèi)源性因素造成的[12,14]。同時研究認(rèn)為松材線蟲脫離媒介昆蟲需要消耗能量克服天牛氣管的阻力[19]，而能量產(chǎn)生需要消耗氧氣；天牛羽化后其呼吸作用逐漸增強[15]，這可能導(dǎo)致天牛氣管中的線蟲接受到充足氧氣，降解其體內(nèi)中性脂肪產(chǎn)生能量。

松材線蟲脫離媒介原因推測：媒介天牛羽化后兩個重要的行為是取食和呼吸。取食行為不是導(dǎo)致線蟲脫離的原因，呼吸行為的增強可導(dǎo)致線蟲產(chǎn)生充足的能量觸發(fā)其具有脫離的能力；天牛氣管中氧氣濃度變化差異對其移動方向起信號指引作用，媒介天牛取食行為僅是其傳播的途徑。