補(bǔ)腎寧心顆粒多種活性成分同時(shí)測(cè)定

李旭辰,高穎,柳成林,韓文靜,于秀華*,黃曉巍*

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長(zhǎng)春130117；2.中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第964醫(yī)院南湖院區(qū)，長(zhǎng)春130021）

補(bǔ)腎寧心顆粒是我院經(jīng)驗(yàn)方，由丹參、當(dāng)歸、赤芍、益母草、牛膝、蒼術(shù)、茯苓、續(xù)斷、熟地黃、柏子仁、香附、石菖蒲、澤蘭、焦山楂14味中藥材組成的復(fù)方制劑，具有補(bǔ)腎活血，祛瘀通絡(luò)功效?？梢越档椭袠猩窠?jīng)中的NE、DA的含量，使中樞神經(jīng)由興奮轉(zhuǎn)向抑制[1]。達(dá)到了使心血管系統(tǒng)受其影響的可能性降低的作用，因此推測(cè)該藥可以抑制中樞神經(jīng)產(chǎn)生興奮，并且可以有效控制或抑制NE和DA的合成和釋放。該顆粒中赤芍的主要成分為芍藥苷、蒼術(shù)主要成分蒼術(shù)素、丹參主要成分丹酚酸B等，能夠作為本品的有效指標(biāo)成分。經(jīng)研究芍藥苷抗抑郁、調(diào)節(jié)免疫、保肝、抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、保護(hù)神經(jīng)、抗糖尿病并發(fā)癥等藥理作用的研究較為深入[2]。蒼術(shù)素抗炎作用主要表現(xiàn)為抑制炎性細(xì)胞因子，促進(jìn)胃排空作用主要表現(xiàn)為激活GHSR，抗腫瘤作用則表現(xiàn)為抑制癌細(xì)胞增值[3]。丹酚酸B具有治療效果對(duì)于心肌梗死、動(dòng)脈粥樣硬化及心肌缺血等心血管疾病[4]。筆者主要對(duì)補(bǔ)腎寧心顆粒進(jìn)行了定量研究，采用對(duì)指標(biāo)性成分蒼術(shù)素、芍藥苷和丹酚酸B運(yùn)用高效液相色譜(HPLC)法進(jìn)行測(cè)量分析來(lái)測(cè)其含量，達(dá)到質(zhì)量控制的目的，同時(shí)對(duì)該藥的安全性提供保障，為臨床的質(zhì)量控制和使用提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

TP-300超聲波清洗器（天鵬電子新技術(shù)（北京）有限公司）；BSA224S電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津，SPD檢測(cè)器）；純水（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心）；AMW220D型電子分析天平（日本島津）；XS-225A電子天平（OHAHS公司）；所用試劑均為分析純。

1.2 試藥

補(bǔ)腎寧心顆粒（批號(hào)：20190301，來(lái)源：長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑中心）；對(duì)照品：蒼術(shù)素（111924-201605）、丹酚酸B對(duì)照品（120976-200503）芍藥苷（110736-201741）均購(gòu)于中國(guó)藥品生物檢定所。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品混合溶液的制備

首先，分別稱(chēng)取芍藥苷10.0mg、蒼術(shù)素6mg和丹酚酸B 17mg三種對(duì)照品小心轉(zhuǎn)移分別各自放入25ml、100ml、100ml的棕色容量瓶之中，然后在其中用移液槍少量多次加入有機(jī)溶劑甲醇定容，制成了每5ml含芍藥苷、蒼術(shù)素和丹酚酸B分別為2.0mg、0.3mg 0.85mg的混合對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

取本品(補(bǔ)腎寧心顆粒)，研成極細(xì)的粉末，使用分析天平稱(chēng)量研磨好的5g該粉末，后將其加到錐形瓶中，再加入用移液管稱(chēng)量的25ml的甲醇溶劑，后再次稱(chēng)量并記錄此時(shí)錐形瓶和溶液的總質(zhì)量，超聲處理30min后，再進(jìn)行稱(chēng)定重量，滴加甲醇，使此時(shí)質(zhì)量與先前質(zhì)量記錄一致，然后進(jìn)行搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液。

2.3 色譜條件

為了達(dá)到、提高各成分之間的分離度、縮短分析時(shí)間、改善各成分峰的峰形的目的，選擇流動(dòng)相0.2%H3PO4溶液（A）-乙睛（B），使用梯度洗脫的洗脫方式，即為：0-30min，22% B，78% A；30-65 min，65% B，35% A；65-70 min，22% B，78% A，流速為1.0ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為286nm、230nm、340nm，十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑Apollo-C18色譜柱（250mm×4.6 mm）。

2.4 專(zhuān)屬性考察

分別精密吸取“2.1”項(xiàng)下制成含有芍藥苷、蒼術(shù)素和丹酚酸B三種對(duì)照品的溶液，分別取適當(dāng)?shù)牧恐瞥?，注入色譜儀當(dāng)中，對(duì)其進(jìn)行進(jìn)樣檢測(cè)。同時(shí)進(jìn)樣分析“2.2”項(xiàng)下的供試品溶液。結(jié)果顯示如圖1-6，說(shuō)明陰性對(duì)其并沒(méi)有出現(xiàn)干擾，證明了此方法可行。

由上圖可知，各指標(biāo)性的峰分離度良好，并未出現(xiàn)峰拖尾、分叉等不良峰型。且樣品的出峰時(shí)間與對(duì)照品的出峰時(shí)間能夠?qū)?yīng)上，能夠很好的符合規(guī)定。

2.5 線性關(guān)系考察

取“2.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液依次為4.0、8.0、10.0、12.0、15.0、20.0μl，使其稀釋成不同的濃度，進(jìn)樣分析，采用“2.3”項(xiàng)下的方法測(cè)定，以峰面積積分值（Y）-對(duì)照品進(jìn)樣量（X），采用線性回歸分析的方法，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 線性關(guān)系考察表

2.6 精密度檢驗(yàn)

精密度檢驗(yàn)即為不同儀器、不同時(shí)間、不同人員分別按上述的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，取“2.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液10 μl，進(jìn)樣檢測(cè)。結(jié)果芍藥苷、蒼術(shù)素和丹酚酸B的峰面積的RSD值0.07%、0.36%、0.25%。數(shù)據(jù)核算無(wú)誤，得到結(jié)果精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

使用上述建立的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，穩(wěn)定性試驗(yàn)?zāi)康脑谟趯?duì)供試品的穩(wěn)定性進(jìn)行合理評(píng)價(jià)，在一定時(shí)間內(nèi)，于0、2、4、8、12、24h進(jìn)樣10 μl。精密吸取“2.2”下供試品溶液，依法測(cè)定，芍藥苷、丹酚酸B、蒼術(shù)素峰面積的RSD值分別為0.39% 0.63%、1.07%。得到結(jié)果穩(wěn)定性良好。

2.8 回收率試驗(yàn)

取樣品，精密量取本品2.5g（芍藥苷含量為1.8603mg/g，丹酚酸B含量為0.72 mg/g，蒼術(shù)素含量為0.26 mg/g），加入甲醇和對(duì)照品適量，置25ml量瓶中。按上述所建立的液相色譜條件，計(jì)算回收率，進(jìn)樣分析。為保證數(shù)值穩(wěn)定可靠，計(jì)算出了丹酚酸B RSD值1.50%、芍藥苷的RSD值為1.74%、蒼術(shù)素RSD值1.07%，均符合要求。平均加樣回收率結(jié)果分別為丹酚酸B 97.68%、芍藥苷97.45%、蒼術(shù)素96.88%。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證明了該高效液相測(cè)量方法的準(zhǔn)確性較好。

2.9 重現(xiàn)性試驗(yàn)

首先，取相同批次的顆粒，將其配制為“2.1”項(xiàng)下的供試品溶液，然后對(duì)其各自分離的測(cè)定。重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)的目的提高測(cè)量數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，適量進(jìn)樣，測(cè)量6次。丹酚酸B、芍藥苷、蒼術(shù)素RSD值為2.46%、1.85%、2.80%，符合規(guī)定要求，實(shí)驗(yàn)成果證明該液相色譜的方法具備著優(yōu)良重復(fù)性。

2.10 耐用性考察

2.10.1 不同色譜柱

選用WondaSil NH18柱（4.6×250mm，5μm）和GRACE NH18柱（4.6×250mm，5μm），選取作為同一供試品溶液，以0.2%H3PO4溶液為流動(dòng)相A，以為乙腈流動(dòng)相B，選用不同廠家C18色譜柱，在“2.2”下的色譜條件下，檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm、286nm、340nm，柱溫30℃，選用梯度洗脫的洗脫方式，進(jìn)行測(cè)定。

2.10.2 檢測(cè)波長(zhǎng)

取同一供試品溶液，0.2% H3PO4溶液為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B。為了檢驗(yàn)波長(zhǎng)，其余均選用與前文一致的方法，按規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫，流速1.0ml/min，柱溫30℃，YWG-C18柱（4.6×250 mm，5μm）為達(dá)到實(shí)驗(yàn)效果，選用與前文完全不同的波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定，分別于228nm、288nm、338nm測(cè)定。

2.10.3 柱溫的影響

選用與前文相同的上述色譜柱，即C18色譜柱,選擇了不同的溫度作為不同柱溫。選用了柱溫分別為30℃和40℃，取同一供試品溶液，其余均與前文保持一致。在340 nm、286 nm、230 nm下進(jìn)行檢測(cè)。

2.10.4 不同流速的影響

取同一供試品溶液，以0.2% H3PO4溶液為流動(dòng)相A，以乙腈為流動(dòng)相B，為探究流速對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，分別以流速0.8、1.0、1.2 ml/min的不同流速進(jìn)行測(cè)定。用C18為填充劑，選用了YWG-C18柱（4.6×250mm，5μm），進(jìn)行梯度洗脫，柱溫維持30℃；吸收波長(zhǎng)為230nm、286nm、340nm。

得出以上的操作均不會(huì)影響含量測(cè)定的結(jié)果，當(dāng)測(cè)試的條件發(fā)生了適度的變化時(shí)。

2.11 測(cè)定含量

精密吸取10μl對(duì)照品混合溶液、供試品溶液進(jìn)樣檢測(cè)，得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果即為，補(bǔ)腎寧心顆粒中每袋顆粒中，補(bǔ)腎寧心顆粒中以芍藥苷(C23H28O11)、丹酚酸B(C36H30O16)和蒼術(shù)素(C13H10O)含有的赤芍、丹參和蒼術(shù)的生藥量，分別不得少于15.0mg、5.0 mg和1.8 mg。

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法的選擇

主要參考了中國(guó)藥典一部對(duì)于各藥材進(jìn)行含量測(cè)定項(xiàng)下的制備方法的部分，以及查閱了有關(guān)文獻(xiàn)，研究芍藥苷、蒼術(shù)素、丹酚酸B在不同制備方法下所得的含量?？紤]到由于該藥品的有效成分具有極性，且更成分之間極性也各不相同，所以分別加入甲醇、75%甲醇、乙醇等不同的有機(jī)溶劑來(lái)對(duì)其進(jìn)行溶解，能夠達(dá)到其分離溶解的目的，并以超聲、加熱回流等提取的手段，從而得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)論：一是關(guān)于提取方法對(duì)含量的影響，沒(méi)有顯著性差異的兩種提取方法，即回流提取方法和超聲提取方法，這兩種均為中藥提取方法中較為常見(jiàn)的兩種提取方法，由這兩種方法所得到的含量十分接近，并不存在顯著差異，然而為了減少實(shí)驗(yàn)成本和花費(fèi)的時(shí)間，超聲提取的操作容易方便，更加大大的減少了提取的時(shí)間，并且實(shí)驗(yàn)成本相對(duì)較低，因此為本次實(shí)驗(yàn)選擇的樣品提取方法為超聲提取30min；二是不同有機(jī)溶劑所產(chǎn)生的提取效果對(duì)各含量的影響，使用甲醇做為溶劑，測(cè)得的有效成分含量較高，對(duì)含量的影響較大，因此采用甲醇作為溶劑。綜上所述，選擇了操作更為簡(jiǎn)單方便的超聲提取30min的方法，并選擇了甲醇作為有機(jī)溶劑，使得到的指標(biāo)性成分含量跟高的方法。確定采用“2.1”“2.2”項(xiàng)下的方法作為制劑中含量提取的方法。即為上文中選擇的方法。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

根據(jù)對(duì)照品芍藥苷、丹酚酸B、蒼術(shù)素的紫外吸收?qǐng)D，最大吸收峰為232nm、287 nm、336 nm，結(jié)合藥典確定最大吸收為230 nm、286 nm、340 nm。

3.3 選擇芍藥苷、丹酚酸B、蒼術(shù)素作為指標(biāo)性成分的依據(jù)

芍藥苷作為赤芍的主要有效成分，它與赤芍的多種藥用治療作用皆有關(guān)聯(lián)[5]。研究表明，具有抗血栓、淤血，同時(shí)還擁有清熱、抗炎，以及抗毒素的作用[6-8]，符合赤芍的中藥主治，同時(shí)也是中藥赤芍發(fā)揮作用的主要所在。選用芍藥苷作為對(duì)顆粒質(zhì)量的控制，研發(fā)、合理利用。丹酚酸B為水溶性活性成分，是丹參中的指標(biāo)性成分。其能夠良好的溶于制劑當(dāng)中，具有防止心血管疾病的重要作用，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)[9-11]，此成分對(duì)于治療缺血性心臟病具有良好的理論根據(jù)，并發(fā)現(xiàn)了它的作用機(jī)制。丹酚酸B可以作為項(xiàng)指標(biāo)性成分衡量此顆粒標(biāo)準(zhǔn)，綜合上述。蒼術(shù)具有止痛燥濕的功效[12,13]，對(duì)于消化系統(tǒng)具有良好的治療作用，對(duì)于修復(fù)胃黏膜，治療胃潰瘍具有極好的功效，蒼術(shù)素作為蒼術(shù)的特征性成分，能夠很好的反應(yīng)出本顆粒中蒼術(shù)所發(fā)揮的藥用價(jià)值。